一種利用多個標記基因?qū)婧诎卟【M行種級分類的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及一種利用多個標記基因?qū)婧诎?病菌進行種級分類的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 梨黑斑病是由鏈格抱真菌侵染引起，主要危害果實、葉片及新梢。該病在世界范圍 內(nèi)廣泛發(fā)生。尤其在亞洲的日本、韓國、中國發(fā)病嚴重。
[0003] 1933年Tanaka首次在日本報道梨黑斑病，并將該病原菌命名為Alternaria kikuchiana Tanaka。由于早在 1920年，Nagano就報道了該菌的學(xué)名Alternaria gaisen Nagano,因此，根據(jù)命名法，simmon認為A. kikuchiana是A. gaisen的晚出異名。
[0004] 目前世界上報道的從儲藏期梨果實上分離的鏈格抱有9種，在中國報道的有5種， 分風(fēng)I為Altern曰ri曰邑曰iseruAltern曰ri曰曰Item曰t曰、Altern曰ri曰 tenuissim曰、Altern曰ri曰 y曰liinficiens、Altern曰ri曰.ventricos曰.
[0005] 對于小抱子鏈格抱，目前種級分類標準是根據(jù)分生抱子形態(tài)、產(chǎn)抱表型、寄主范圍 等依據(jù)。ITS只能鑒定到屬一級，無法鑒定到種級水平。Simmons和3〇66的3根據(jù)產(chǎn)抱表型及 分生抱子形態(tài)，將從全國各地采集的亞洲梨上分離的菌株，用代表性的種確定了幾個明確 的組，女曰Alternaria 邑aisen組、Alternaria alternata組、Alternaria tenuissima組等。
[0006] 根據(jù)Simmons和Robeds的分類方法，GB/T 28072-2011梨黑斑病菌檢疫鑒定方法， 對梨黑斑病菌的鑒定主要根據(jù)形態(tài)學(xué)及致病性測定。該標準鑒定的A.gaisen分生抱子梗直 立，不分枝或基本不分枝，多數(shù)抱子鏈含5~9個抱子。分生抱子大?。?2.2皿~35. Ομπι) X (5.祉m~14.5皿），瞭呈短柱狀或錐狀，約（2皿~8.7皿）X (2.3皿~4.6皿），抱子橫隔1~4， 縱斜隔膜為0~3。病斑初期圓形或不規(guī)則形，后擴大成同屯、環(huán)紋狀，暗褐色。符合W上特征 的即為A. gai sen。近似種A. al ternata，分生抱子鏈分枝繁復(fù)、致密;A. tenui SS ima，分生抱 子鏈長，每鏈10~15個抱子，分枝很少。A. inf ectoria分生抱子鏈分枝松散，次生抱子梗長。 此Ξ種近似種對梨葉不致病。
[0007] 為了研究田間梨黑斑病菌的種群結(jié)構(gòu)，從田間發(fā)病梨葉片及果實上分離得到127 株鏈格抱真菌。根據(jù)產(chǎn)抱表型觀察，127株菌株中包括A. gai sen組、A. alternata組W及 A. tenuissima組。致病性測定結(jié)果顯示:Ξ組菌株對梨葉片及果實均有致病性，但致病力存 在差異。在種級鑒定過程中，發(fā)現(xiàn)小抱子種鏈格抱分生抱子形態(tài)具有多態(tài)性，且形態(tài)特征易 受溫濕度、光照等培養(yǎng)條件的影響；另外來自寄主與來自培養(yǎng)基上的分生抱子形態(tài)具有較 大差異;產(chǎn)抱表型相對容易觀察，但在實際操作過程中，存在一些過渡性態(tài);還有一類產(chǎn)抱 極少或不產(chǎn)抱的鏈格抱菌株，均給種級鑒定帶來一定困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)存在的缺陷，提供一種利用多個標記基因?qū)婧?斑病菌進行種級分類的方法，利用多個標記基因綜合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過聚類分析對梨 黑斑病菌進行種級分類鑒定。通過標記基因篩選比較，WLEU/GPD+HIS綜合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育 樹，可準確快速的區(qū)分引起梨黑斑病的鏈格抱種類。該方法從鏈格抱基因組DNA中尋找合適 的標記基因作為分離依據(jù)，是種級鑒定的可靠方法。
[0009] 其具體技術(shù)方案為：
[0010] -種利用多個標記基因?qū)婧诎卟【M行種級分類的方法，包括W下步驟：
[001。 第一步，WLEU/GPD、HIS特異引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物連接PUC19載體，挑取單 克隆測序。第二步LEU/GPD、HIS擴增產(chǎn)物序列拼接，第Ξ步，WMEGA5.0對序列進行分析，根 據(jù)聚類結(jié)果，明確待測菌株的種類。
[001 ^ 優(yōu)選地，所述特異引物序列分別為:HIS3-巧日SEQ: ID: NO: 1所示，HIS3-喊日SEQ: ID: NO: 2所示，L抓-F如沈Q: ID: NO: 3所示，L抓-R如SEQ: ID: NO: 4所示，GPD-F如SEQ: ID: NO: 5所 示，6?0-喊日沈0:10:備：6所示。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0014] 本發(fā)明利用多個標記基因綜合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過聚類分析對梨黑斑病菌進行 種級分類鑒定。通過標記基因篩選比較，WLEU/GPD+HIS綜合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，可準確快速 的區(qū)分引起梨黑斑病的鏈格抱種類。該方法從鏈格抱基因組DNA中尋找合適的標記基因作 為分離依據(jù)，是種級鑒定的可靠方法。
【附圖說明】
[001引圖1是MEGA5.0進行序列分析結(jié)果。
【具體實施方式】
[0016] 為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié) 合附圖和具體實例進一步闡述本發(fā)明。
[0017] 1、菌株的分離培養(yǎng)
[0018] 采田間具有典型黑斑病癥狀的葉片及果實，采用組織分離法分離病原菌。取病斑 與健康組織交界處約0.5cm2大小組織，先在0.3%次氯酸鋼溶液中消毒30s，再用75%酒精 消毒30s，然后在清水中漂洗3次，于無菌濾紙上吸干水分后，置于PDA平板上，25°C普通光照 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0019] 2、菌株的單抱(單菌絲)分離
[0020] 待菌落在PDA平板上生長5天后，W 1ml無菌水反復(fù)沖洗菌落，取抱子液稀釋至一定 濃度后，均勻涂布于2 %水瓊脂板上，待培養(yǎng)基表面水分風(fēng)干后，25°C培養(yǎng)過夜。第2天在顯 微鏡下挑取已萌發(fā)的單抱(若無抱子，可W挑取單根菌絲），置于新的PDA平板上培養(yǎng)。
[0021] 3、柯赫氏法則鑒定
[0022] 將單抱分離的菌株W分生抱子液、菌絲塊接種梨葉片和果實，將能產(chǎn)生黑斑病典 型癥狀的菌株再分離，并保存。
[0023] 4、黑斑病菌DNA的提取
[0024] 將梨黑斑病菌WPDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7天后，刮取菌絲約0.5g，W改良CTAB法提取菌絲 DNA。
[0025] 5、PCR 擴增
[00%]分別WHIS、L抓或Gro特異引物進行PCR擴增，引物序列如表1所示：
[0027]表 1 [002引
[0029] 擴增程序如下：95°C5mins; 95°C45s，53°C30s，72°C30s; 35巧cles; 72°C10mins
[0030] 6、連 PUC19 載體
[0031] 擴增產(chǎn)物取扣1電泳檢測檢測。然后擴增產(chǎn)物與載體PUC195yl混合，WEcoRI、化nd 虹雙酶切。酶切30mins后，沉淀回收。PCR產(chǎn)物先加入80μ1無菌水成10化1，然后加入60 %體 積異丙醇10000轉(zhuǎn)離屯、lOmins，棄上清，加入200μ175 %乙醇漂洗，10000轉(zhuǎn)離屯、5mins，棄上 清，超凈工作臺內(nèi)驚干后，加8化1無菌水溶解。加入連接酶1 igase 0.化1，連接過夜。
[0032] 7、電擊轉(zhuǎn)化
[0033] W大腸桿菌DH 5α進行轉(zhuǎn)化，連接體系與20μ10Η 5α感受態(tài)細胞混合均勻后，W 1600V電壓，電擊，37°C培養(yǎng)箱放置20mins后涂Amp板(加 X-gal)。
[0034] 37°C培養(yǎng)箱12~16個小時候，觀察，挑單菌落(不帶藍斑)搖菌，菌液培養(yǎng)8小時后， 送樣測序。
[0035] 8、序列分析
[0036] 測序由上海上海百力格生物技術(shù)有限公司完成。首先，將各菌株的GPD/LKJ與HIS3 擴增序列拼接，然后WMEGA5.0進行序列分析。分析結(jié)果如圖顯示，鏈格抱菌可聚為Ξ大類， 分風(fēng)I為:Altern曰ri曰.曰Item曰t曰、Altern曰ri曰.邑曰isen、、Altern曰ri曰.tenuissim曰。
[0037] W上所述，僅為本發(fā)明最佳實施方式，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明 披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的 保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種利用多個標記基因?qū)婧诎卟【M行種級分類的方法，其特征在于，包括以下 步驟： 第一步，以LEU/GPD、HIS特異引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物連接PUC19載體，挑取單克隆 測序。第二步LEU/GPD、HIS擴增產(chǎn)物序列拼接，第三步，以MEGA5.0對序列進行分析，根據(jù)聚 類結(jié)果，明確待測菌株的種類。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用多個標記基因?qū)婧诎卟【M行種級分類的方法，其特 征在于，所述特異引物序列分別為:HIS3-F如SEQ :ID:N0:lK*，HIS3-I^nSEQ:ID:N0 :2K 示，LEU-F如 SEQ: ID: NO: 3所示，LEU-R如SEQ: ID: NO: 4所示，GPD-F如SEQ: ID: NO: 5所示，GPD-R 如SEQ: ID:NO:6所示。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用多個標記基因?qū)婧诎卟【M行種級分類的方法，包括以下步驟：(1)利用標記基因LEU/GPD、HIS的特異引物對待測菌株進行PCR擴增；(2)擴增產(chǎn)物連接PUC19-vector，再測序；(3)利用MEGA軟件對LEU/GPD+HIS綜合序列進行系統(tǒng)分析，從而對不同梨黑斑病菌菌株進行分類。此鑒定方法可準確快速的對梨黑斑病菌進行種分類。
【IPC分類】C12R1/645, C12Q1/04, C12Q1/68
【公開號】CN105543407
【申請?zhí)枴緾N201610149853
【發(fā)明人】朱紅艷, 秦仲麒, 張曉旭, 伍濤, 李先明, 涂俊凡, 楊夫臣, 劉政, 朱婷
【申請人】湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年3月16日