一種熊蜂孢子蟲的pcr檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種熊蜂抱子蟲的PCR檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[000引熊蜂抱子蟲（Apicystis bombi)屬于類錐體綱（Conoidasida)、簇蟲亞綱 化的肖日1'；[]1日3；[]1日）、新簇蟲目（化〇肖的肖日1'；[]1〇1'1(1日）、抱子蟲屬(49；[。731:13)。熊蜂抱子蟲是一 種寄生于熊蜂屬和西方蜜蜂的原生動(dòng)物寄生蟲，外形與熊蜂微抱子蟲類似但較大，抱子呈 船型，大小約11.4-14.4皿長(zhǎng)，3.6-5.4皿寬。自在芬蘭和意大利出現(xiàn)后，運(yùn)種寄生蟲很快 傳染到歐洲各國(guó)，目前國(guó)內(nèi)尚沒有熊蜂抱子蟲的報(bào)道，但運(yùn)種寄生蟲致病力強(qiáng)，如不嚴(yán)格預(yù) 防，隨著商用熊蜂群進(jìn)出口貿(mào)易往來(lái)的加大，將對(duì)我國(guó)熊蜂的飼養(yǎng)和繁育產(chǎn)生巨大影響。
[0003] 熊蜂抱子蟲的檢驗(yàn)主要是解剖觀察和鏡檢觀察，鏡檢觀察主要是取病蜂的脂肪體 和中腸組織涂片在甲醇中固定2分鐘，0.25%吉姆薩染色8-12小時(shí)后，于光學(xué)顯微鏡下觀 察。鏡檢觀察容易漏檢，且易與微抱子蟲病、短膜蟲病等混淆。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種熊蜂抱子蟲的PCR檢測(cè)方法，W便準(zhǔn)確、靈敏、快速、經(jīng) 濟(jì)地檢測(cè)進(jìn)口熊蜂及國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖熊蜂蜂群中的熊蜂抱子蟲。
[000引本發(fā)明提供的熊蜂抱子蟲的PCR檢測(cè)方法，具體步驟如下： 利用特異性引物對(duì)，對(duì)疑似感染熊蜂抱子蟲的熊蜂腹部組織DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn) 物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，如擴(kuò)增出316 bp的熊蜂抱子蟲基因片段，則標(biāo)志著待檢測(cè)樣品為熊 蜂抱子蟲陽(yáng)性。
[0006 ]其中，所述特異性引物對(duì)為： 上游引物Api-F: 5 ' -AGCGATGGATGTCTTGGG-3 ' ； 下游引物Ap i -R: 5 ' -TTCAGCGGGTAACCTTGT-3 '。
[0007] 其中，所述PCR的反應(yīng)體系如下：
反應(yīng)體系總體積為20 yL。
[000引其中，所述PCR的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性4 min后進(jìn)入循環(huán)，95°C變性1 min，56 °(3退火1111111，72°(3延伸1111111，40個(gè)循環(huán)，最后72°(3延伸10111111。
[0009] 其中，所述凝膠電泳為1.5 %瓊脂糖凝膠電泳。
[0010] 本發(fā)明還提供用于熊蜂抱子蟲的PCR檢測(cè)方法的特異性引物對(duì)，上游引物為上游 引物 Api-F:5'-AGCGATGGATGTCTTGGG-3' ；下游引物為Api-R:5'-TTCAGCGGGTAACCTTGT-3'。
[0011] 本發(fā)明還提供所述熊蜂抱子蟲的PCR檢測(cè)方法在進(jìn)境熊蜂及國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖蜂群中的應(yīng) 用。
[001引本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明所提供的熊蜂抱子蟲的PCR檢測(cè)方法能快速、準(zhǔn)確、靈 敏地檢測(cè)熊蜂抱子蟲。所述PCR反應(yīng)體系中有一對(duì)特異性引物Api-F和Api-R，上述引物能夠 從感染熊蜂抱子蟲的熊蜂DNA中特異性擴(kuò)增一段316 bp的片段，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)熊蜂抱子蟲的 PCR檢測(cè)。本發(fā)明的熊蜂抱子蟲PCR檢測(cè)方法，對(duì)全基因合成的熊蜂抱子蟲DNA的檢測(cè)靈敏度 可達(dá)到1.39 fg/yL，具有特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可用于進(jìn)境熊蜂和國(guó)內(nèi)養(yǎng) 殖熊蜂體內(nèi)熊蜂抱子蟲的檢測(cè)，為防止熊蜂抱子蟲的傳入和國(guó)內(nèi)熊蜂抱子蟲病的防控提供 可靠的理論和技術(shù)依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1易和熊蜂抱子蟲混淆的病蟲害DNA的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠 電泳圖。其中Μ :DNAMarker I;N :陰性對(duì)照(d地2〇);1:熊蜂抱子蟲;2:熊蜂微抱子蟲；3: 東方蜜蜂微抱子蟲，4:西方蜜蜂微抱子蟲，5:熊蜂短膜蟲;6:布赫納幢蛾。
[0014] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2為全基因合成的熊蜂抱子蟲DNA不同稀釋倍數(shù)下的PCR產(chǎn)物 的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中Μ :DNAMarker I;N:陰性對(duì)照（d地2〇); 1:陽(yáng)性對(duì)照；2 :1〇d;3 :1〇1 ;4 :102;5 :103;6 :104;7 :105;8 :1〇6 ;9 :1〇7;10 :1〇8;11 :109;12 :l〇w;13 : 1〇11 ;14 :1〇i2;15 :1〇i3;16 :1〇i4;17 :1〇1 己。
[001引圖3為本發(fā)明實(shí)施例3利用本發(fā)明檢測(cè)方法對(duì)23份臨床樣本的檢測(cè)。其中Μ :DNA Marker I ;N :陰性對(duì)照(dd出0):1-23分別表示23份待檢樣本。
【具體實(shí)施方式】
[0016] W下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0017] 實(shí)施例1熊蜂抱子蟲的特異性檢驗(yàn) 采用本發(fā)明方法，對(duì)擴(kuò)增測(cè)序?yàn)樾芊浔ё酉x陽(yáng)性的DNA樣本和其他寄生病蟲害進(jìn)行熊 蜂抱子蟲的檢驗(yàn)。
[0018] 特異性引物對(duì)為： Api-F:5 '-AGCGATGGATGTCTTGGG-3 '； Api-R:5'-TTCAGCGGGTAACCTTGT-3'。
[0019] PCR反應(yīng)體系中包括4 化的5XGoTaq Buffer、1.5 化的MgCb (25mM)(Promega 公司），2.0 化的dNTPs(200yM)(TaKaRa 公司），引物Api-F、引物Api-R 各 1 μΚ?0μΜ)，0.5 化的GoTaq? DM聚合酶，2化的模板DNA，d地2〇補(bǔ)足至20化： 反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性4 min后進(jìn)入循環(huán)，95°C變性1 min，56°C退火1 min，72°C延伸 1 min,40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 min。
[0020] 取6化擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果見圖1中PCR產(chǎn)物的瓊 脂糖凝膠電泳條帶。熊蜂抱子蟲陽(yáng)性樣本用引物Api-F/Api-R進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢 測(cè)結(jié)果表明擴(kuò)增出了316 bp的熊蜂抱子蟲基因片段，其他寄生病蟲害DNA用引物Api-F/ Api-R擴(kuò)增產(chǎn)物的1.5%瓊脂糖凝膠電泳未檢測(cè)出電泳條帶，使用本發(fā)明的方法可用于疑似 感染熊蜂抱子蟲的熊蜂檢驗(yàn)。
[0021] 實(shí)施例2熊蜂抱子蟲的靈敏性檢驗(yàn) 采用本發(fā)明方法，對(duì)全基因合成的熊蜂抱子蟲DNA不同稀釋倍數(shù)進(jìn)行靈敏度檢驗(yàn)。 [002引PCR反應(yīng)方法、體系與條件均同實(shí)例1，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳 檢測(cè)，圖2為全基因合成的熊蜂抱子蟲DNA10^^-10l5倍稀釋后PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳條 帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)108倍稀釋的139 ng/化模板DNA擴(kuò)增出了 條帶，本發(fā)明中的特異性引物對(duì)Api-F/Api-R的靈敏度為1.39 fg/ yL。
[0023]實(shí)施例3熊蜂抱子蟲的臨床樣本檢測(cè) 提取待檢測(cè)熊蜂的腹部組織基因組DNA 剪取熊蜂腹部組織置于研鉢，加入適量液氮快速研磨，反復(fù)幾次研磨成漿，用CTAB法提 取熊蜂腹部組織基因組DNA，具體步驟如下： 熊蜂腹部組織研磨成漿后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離屯、管中，12000巧m離屯、2 min,棄上清，加入 50化TE緩沖液，使樣品充分懸浮后，加入60化10% SDS溶液和10化20 mg/mL的蛋白 酶K，混勻后于37°C下溫育1 h; 加入100 μL 5 mol/L的NaCl溶液，上下顛倒充分混勻，加入80化CTAB/NaCl溶液， 混勻后65°C溫育10 min; 加入700 μL氯仿/異戊醇(體積比為24:1)，混勻后12000巧m離屯、2 min;吸取上清 至另一干凈離屯、管，加入等體積的酪/氯仿/異戊醇（Ξ者體積比為25: 24:1)，上下顛倒混 勻，12000 rpm離屯、2 min;再次吸取上清至另一干凈離屯、管，加入2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙 醇沉淀DNA，輕輕混勻，4°C下12000巧m離屯、30 min,徹底去除上清； 用300 μL 70%預(yù)冷的乙醇洗涂沉淀，4°C下12000 rpm離屯、15 min,棄上清，再離屯、幾 秒，用移液器徹底吸除酒精，在超凈工作臺(tái)上自然驚干；加入20 μL TE溶液溶解DNA，-20°C 下保存； 采用本發(fā)明方法，對(duì)疑似感染熊蜂抱子蟲的熊蜂腹部組織DNA樣本進(jìn)行臨床檢測(cè)。
[0024] PCR反應(yīng)方法、體系與條件均同實(shí)例1，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳 檢測(cè)，圖3為疑似感染熊蜂抱子蟲的熊蜂腹部組織DNA樣本PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳條 帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在23個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本中有12個(gè)檢測(cè)出316 bp的電 泳條帶，表現(xiàn)為熊蜂抱子蟲陽(yáng)性，其他11個(gè)樣本未檢測(cè)到電泳條帶，表現(xiàn)為陰性。
[0025] 本發(fā)明并不局限于上述【具體實(shí)施方式】，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，所做 出的多種變化和改進(jìn)也應(yīng)包括在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)熊蜂孢子蟲的PCR引物，其特征在于:所述的特異性引物對(duì)為： 上游引物Api-F: 5 ' -AGCGATGGATGTCTTGGG-3 ' ； 下游引物Ap i -R: 5 ' -TTCAGCGGGTAACCTTGT-3 '。2. -種熊蜂孢子蟲的PCR檢測(cè)方法，其特征在于：包括以下步驟：利用特異性引物對(duì) Api-F和Api-R，對(duì)待測(cè)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，如擴(kuò)增出316 bp 的特異性條帶，說(shuō)明待測(cè)樣品中含有熊蜂孢子蟲，反之則未檢出。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熊蜂孢子蟲的PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述的PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系為20 yL，包括GoTaq? DNA聚合酶0.5 yL;200 μΜ的dNTPs 2 yL;25 mM的MgCl2 1.5 yL;5XGoTaq Buffer 4 yL;濃度為10 μΜ的上游引物Api-F 1 yL;濃度為10 μΜ的下游引物 Api-R 1 yL;DNA模板2 yL;ddH20 8 yL。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熊蜂孢子蟲的PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述的PCR反應(yīng) 條件為:95°C預(yù)變性4 min，之后95°C變性1 min，56°C退火1 min，72°C延伸1 min，循環(huán)40次 后，72°C延伸 10 min。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熊蜂孢子蟲的PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述的PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物檢測(cè)與分析步驟:取6 yL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在加入0.01% GelRed核酸染料的1.5%瓊脂糖 凝膠上電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熊蜂孢子蟲的PCR檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述PCR反應(yīng)體系中有一對(duì)特異性引物Api-F和Api-R，上述引物能夠從感染熊蜂孢子蟲的熊蜂DNA中特異性擴(kuò)增一段316？bp的片段，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)熊蜂孢子蟲的PCR檢測(cè)。本發(fā)明的熊蜂孢子蟲PCR檢測(cè)方法，對(duì)全基因合成的熊蜂孢子蟲DNA的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1.39？fg/μL，具有特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可用于進(jìn)境熊蜂和國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖熊蜂體內(nèi)熊蜂孢子蟲的檢測(cè)，為防止熊蜂孢子蟲的傳入和國(guó)內(nèi)熊蜂孢子蟲病的防控提供可靠的理論和技術(shù)依據(jù)。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號(hào)】CN105543404
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610133952
【發(fā)明人】張?bào)w銀, 劉蓓, 鄭騰, 白泉陽(yáng), 王武軍, 張志燈, 于師宇, 林素潔
【申請(qǐng)人】福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年3月10日