專利名稱：篩選與鑒定治療免疫耐受相關(guān)疾病功能基因serpinh1的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選與鑒定治療免疫耐受相關(guān)疾病功能基因SERPINH1的方法，具體講是已知基因serine proteins inhibitor H1(下文簡(jiǎn)稱SERPINH1基因)新功能的篩選與鑒定方法，免疫耐受相關(guān)基因SERPINH1參與免疫耐受并影響免疫應(yīng)答基因的表達(dá)。SERPINH1基因在免疫相關(guān)性疾病如抗移植排斥反應(yīng)、腫瘤、炎癥、自身免疫性疾病的治療方面有著潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
背景技術(shù)：
1975年著名免疫學(xué)家Burnet提出克隆選擇學(xué)說，并以克隆清除(clonal deletion)學(xué)說解釋免疫耐受現(xiàn)象。處于未成熟階段的T、B反應(yīng)細(xì)胞系因接觸抗原而被清除，則造成免疫耐受。但是，目前對(duì)免疫耐受機(jī)制的認(rèn)識(shí)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越克隆清除。它的發(fā)生涉及到免疫應(yīng)答過程中任何一個(gè)正、負(fù)調(diào)節(jié)系統(tǒng)?？寺〔粦?yīng)答可能由于免疫活性細(xì)胞缺乏激活信號(hào)；免疫活性細(xì)胞激活受阻；缺乏輔助細(xì)胞和抑制細(xì)胞的作用如T抑制細(xì)胞的作用，其他抑制免疫細(xì)胞如NKT細(xì)胞，巨噬細(xì)胞的抑制作用。樹突細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)最有效的抗原呈現(xiàn)細(xì)胞，在免疫反應(yīng)的啟動(dòng)和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)過程中起著決定性作用。樹突細(xì)胞能夠表達(dá)高水平的抗原呈遞分子、刺激分子、產(chǎn)生廣泛的細(xì)胞因子和化學(xué)趨化因子，這些細(xì)胞控制著先天性免疫反應(yīng)和被動(dòng)免疫反應(yīng)引導(dǎo)抗病原菌和抗腫瘤免疫反應(yīng)。
搞清免疫耐受機(jī)理對(duì)腫瘤免疫，移植排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病有著重要意義。免疫耐受的誘導(dǎo)、維持和破壞影響著許多臨床疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。人們企圖誘導(dǎo)和維持免疫耐受性來防治超敏性疾病、自身免疫性疾病，腫瘤以及移植物的排斥反應(yīng)。某些感染性疾病以及腫瘤生長過程中，設(shè)法解除免疫耐受、激發(fā)免疫應(yīng)答將有利于對(duì)病原體的清除及腫瘤的控制。近年發(fā)現(xiàn)免疫耐受的核心就是樹突細(xì)胞(Dendritic cell，DC)(Beriou et al.，2005；Coates and Thomson，2002；Cobbold et al.，2003；Fairchild et al.，2004；MacDonaldet al.，2005；Martinez and Rosen，2005；Quezada et al.，2004；Raimondi and Thomson，2005；Taner and Thomson，2004)，這樣發(fā)現(xiàn)和鑒定控制樹突狀細(xì)胞參于誘導(dǎo)免疫耐受的基因?qū)⑹顷P(guān)鍵的。盡管人們通過其它方法發(fā)現(xiàn)一些能夠調(diào)節(jié)樹突細(xì)胞分化和功能的基因，但這遠(yuǎn)沒能揭開控制樹突細(xì)胞分化和功能尤其是與免疫耐受有關(guān)的遺傳基礎(chǔ)。到目前為止，還沒有一個(gè)系統(tǒng)方法鑒定樹突細(xì)胞內(nèi)控制免疫耐受的基因。
Serine proteases inhibitor(Serpin)，由許多成員組成?，F(xiàn)有研究已證實(shí)Serpins對(duì)重要生理系統(tǒng)的維持起著重要作用(Pike RN.2002，1-7)Serpins控制血凝系統(tǒng)(Pike RN.4842-4851)；保護(hù)T細(xì)胞的自身殺傷(Pike RN.2002，1-7)；能夠抑制中性細(xì)胞和血小板的激活；調(diào)節(jié)IFN-α的產(chǎn)生與釋放(Wachtfogel；1993，1-9)；Serine proteaseAprotinin處理的病人IL-6產(chǎn)生減少(Soeporwata，55-64)，IL-8的水平降低(Soeporwata，55-64)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種篩選與鑒定治療免疫耐受相關(guān)疾病功能基因SERPINH1的方法。在體外通過卵巢腫瘤細(xì)胞與未成熟樹突細(xì)胞共同孵育引導(dǎo)和產(chǎn)生免疫耐受樹突細(xì)胞。利用基因芯片技術(shù)，基因庫生物信息和現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)通過比較對(duì)照樹突細(xì)胞和腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞，從腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞篩選免疫耐受基因。篩選的免疫耐受基因再通過一系列分析方法進(jìn)一步確認(rèn)。
SERPINH1基因在免疫耐受樹突細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高。當(dāng)SERPINH1基因或靶向這個(gè)基因的siRNA轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞系，影響其轉(zhuǎn)錄因素的激活，細(xì)胞因子的產(chǎn)生和共刺激分子的表達(dá)；重要的是轉(zhuǎn)染免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞樹突細(xì)胞后能夠發(fā)揮特有的免疫調(diào)節(jié)功能，引導(dǎo)免疫耐受。該基因在免疫相關(guān)性疾病如抗移植排斥反應(yīng)、腫瘤、炎癥、自身免疫性疾病的治療方面有著巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明是通過體外誘導(dǎo)免疫耐受樹突細(xì)胞的產(chǎn)生，免疫耐受樹突細(xì)胞具有不成熟樹突細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和降低的免疫刺激功能具有相對(duì)較低的抗原呈遞功能，降低的引導(dǎo)免疫特異反應(yīng)的能力。利用基因芯片技術(shù)，基因庫生物信息和現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)從免疫耐受樹突細(xì)胞中篩選和鑒定與免疫耐受有關(guān)的基因SERPINH1。SERPINH1基因的功能通過五個(gè)不同的分析方法進(jìn)行了進(jìn)一步評(píng)價(jià)1)轉(zhuǎn)染SERPINH1基因?qū)D(zhuǎn)錄因素的影響；2)、轉(zhuǎn)染SERPINH1基因?qū)?xì)胞因子、化學(xué)趨化因子和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)的影響；3)、轉(zhuǎn)染SERPINH1對(duì)共同刺激分子表達(dá)的影響；4)、沉寂SERPINH1基因?qū)δ[瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞引導(dǎo)T調(diào)節(jié)細(xì)胞CD4+CD25+細(xì)胞的影響；5)、沉寂SERPINH1基因?qū)渫患?xì)胞抵抗腫瘤對(duì)樹突細(xì)胞的影響；6)、沉寂SERPINHl基因?qū)渫患?xì)胞抗原呈遞功能的影響。
本發(fā)明提出的篩選與鑒定治療免疫耐受相關(guān)疾病功能基因SERPINH1的方法是包括下述步驟(1)免疫耐受樹突細(xì)胞的制備和鑒定1)取4-6周健康C57BL/6小鼠的骨髓細(xì)胞，用水溶解去除紅細(xì)胞后，這些骨髓細(xì)胞培養(yǎng)在1000單位GM-CSF，10％FCSRPMI1640培養(yǎng)基中，37℃溫度下培養(yǎng)4天的骨髓起源的樹突細(xì)胞作為未成熟的樹突細(xì)胞。
2)培養(yǎng)4天的未成熟的樹突細(xì)胞，用生理鹽水洗三次，在24孔板分別與鼠卵巢癌腫瘤細(xì)胞，已照射卵巢癌細(xì)胞或卵巢癌細(xì)胞上清液共同培養(yǎng)9天。
3)9天后，用2μl FITC螢光素標(biāo)記的CD80抗體(BD Pharmingen公司)染鼠卵巢腫瘤細(xì)胞與樹突細(xì)胞，然后通過流式細(xì)胞儀從鼠卵巢腫瘤細(xì)胞與樹突細(xì)胞的混和培養(yǎng)(在10％FCSRPMI1640培養(yǎng)基中，時(shí)間9天)分離樹突細(xì)胞，得免疫耐受樹突細(xì)胞。
4)首先對(duì)免疫耐受樹突細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，觀察腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞的形態(tài)與結(jié)構(gòu)。
5)腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞用生理鹽水洗三次后，分別加2μl FITC螢光素標(biāo)記的抗CD40、CD80和CD86抗體染色，流式細(xì)胞儀分析，分析免疫耐受樹突細(xì)胞刺激分子的表達(dá)。
6)用類乳頭瘤病毒質(zhì)粒(VLP)(由The Johns Hopkins University School of Medicine提供)免疫鼠引導(dǎo)的特異性T細(xì)胞作為靶細(xì)胞，腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞與對(duì)照樹突細(xì)胞在裝載類乳頭瘤病毒質(zhì)粒(VLP)后作為刺激細(xì)胞。在10％FCSRPMI1640培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)48小時(shí)，取上清液，通過酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒分析上清液中的IFN-γ(干擾素γ)含量。
(2)免疫耐受樹突細(xì)胞內(nèi)免疫耐受基因的篩選
1)首先按照Invitrogen公司提供的步驟，從腫瘤相關(guān)性樹突細(xì)胞用Trizol試劑(Invitrogen)提取總RNA；2)對(duì)腫瘤相關(guān)性樹突細(xì)胞總RNA通過基因芯片進(jìn)行分析，所用基因芯片是AffymetrixMouse U74 GeneChip series(U74A，U74B和U74C)，由美國約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院(TheJohne Hopkins University School of Medicine)基因組研究室分析1、首先，用寡核苷酸和dT作為引物(Proligo，Boulder，co)以及SuperScript choice(SuperScript TM Choice System，cDNA合成試劑盒)合成單股cDNA。
2、然后合成雙股cDNA。雙股cDNA通過苯酚-氯仿抽提后，利用BioArray RNA highyield Transcript labeling試劑盒(Inzo Bioche)，通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生Biomylated anti-sense cRNA。
3、cRNA在45℃與Affymetrix基因組基因芯片雜交。用Affymetrix Fluidics Station400洗染芯片除去未雜交的cRNA，然后用streptavidin-PE結(jié)合Biotimylated cRNA，再與羊抗-streptavidin Ab孵育。用Hewlett-Packard G2500 GeneArray檢測(cè)熒光強(qiáng)度。用MicroArray Suite5.0軟件(Affymetrix)對(duì)每個(gè)基因芯片進(jìn)行圖像分析。
4、采用Agilent Bioanalyzer(Palo Alto，CA)與“Lab on a chip”(芯片實(shí)驗(yàn)室)技術(shù)證實(shí)所有樣本有著類似的rRNA比率。
5、根據(jù)基因庫提供生物信息，對(duì)在腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞基因芯片分析中明顯上調(diào)的基因或明顯下調(diào)的基因結(jié)合基因庫提供生物信息進(jìn)行分析。
6)、SERPINH1基因在腫瘤相關(guān)的樹突細(xì)胞的高水平表達(dá)通過半定量PCR和定量PCR進(jìn)一步評(píng)價(jià)。根據(jù)基因庫提供生物信息，找出在腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞中明顯上調(diào)的SERPINH1基因序列。給出基因序列和上調(diào)的SERPINH1基因序列atgcgctctc tccttctggg caccttatgc ctcttggccg tggccctggc agccgaggtgaagaaacccc tagaggcggc agcccctggt actgcggaga agctaagttc caaggcgaccacactggcag agcgcagcac aggcctggcc ttcagcctat atcaggcgat ggccaaagaccaggcggtgg agaacatcct cctgtcaccc ttggtggtgg cctcatccct gggtcttgtgtcactgggtg gtaaagccac cacagcgtcg caggcgaagg cagtgctgag cgctgagaagctgcgcgatg aggaggtgca cacggggctg ggtgagctgc tccgctccct cagcaactccactgcgcgca acgtgacctg gaaactgggc agccgcctgt acgggcccag ctccgtgagcttcgccgatg acttcgtgcg cagcagcaag caacactaca actgcgaaca ctccaagatcaacttccgag acaagcgcag cgccctgcag tccatcaacg agtgggcctc gcagaccacggacggcaagc tgcctgaggt caccaaggat gtggagcgca cggatggggc actgcttgtgaacgccatgt tctttaagcc acactgggat gagaggtttc accacaggat ggtggacaaccgtggcttca tggtgacccg ctcctatact gtgggtgtta cgatgatgca ccggacaggcctgtacaact actatgacga cgagaaggag aagctgcaga tggtggagat gcccctggctcacaagctct ccagcctcat catcctcatg ccccaccatg tggagccgct cgagcgcttggagaagctgc tgaccaagga gcagctgaag gcctggatgg gaaagatgca gaagaaggctgtcgccatct ccctgcccaa gggcgtggtg gaggtgaccc atgacctgca gaaacatctggcaggactgg gcctgaccga agccatcgac aagaacaagg cagacctatc gcgcatgtctggcaagaagg acctgtacct ggccagtgtg ttccacgcca ctgccttcga gtgggacaccgagggcaacc cctttgacca agacatctac gggcgcgagg agctgcgcag ccccaagctgttctatgccg accacccctt catcttcctg gtgcgagata atcagagcgg ctccttgctcttcattggcc gcctggtccg gcccaaggga gacaagatgc gagatgagtt gtag
設(shè)計(jì)SERPINH1基因引物5‘a(chǎn)tgcgctctctccttctgggcacc3’和3’caactcatctcgcatcttgtctcc5’。用Invitrogen提供的RT-PCR試劑盒進(jìn)行分析。用SybrGreen I檢測(cè)模式通過定量PCR，用TAKARA公司提供的SYBR green I螢光染料測(cè)定SERPINH1的轉(zhuǎn)錄水平。
(3)克隆SERPINH1基因首先按照Invitrogen公司提供的步驟，從腫瘤相關(guān)性樹突細(xì)胞用Trizol試劑提取總RNA。用SERPINH1引物5‘a(chǎn)tgcgctctctccttctgggcacc3’和3’caactcatctcgcatcttgtctcc5’，通過Invitrogen公司提供的RT-PCR試劑盒，按照該公司提供的實(shí)驗(yàn)步驟擴(kuò)增SERPINH1基因，通過Invitrogen膠提取試劑盒提取擴(kuò)增的SERPINH1基因片段。然后通過Invitrogen公司提供的pCDNA3.1His/V5 ToPo載體，根據(jù)該公司提供的實(shí)驗(yàn)步驟將SERPINH1基因克隆到pCDNA3.1His/V5 ToPo載體。最后，通過測(cè)序確定SERPINH1序列(上述列出的序列)。
(4)對(duì)篩選的腫瘤相關(guān)免疫耐受相關(guān)基因功能進(jìn)一步鑒定1)、用載有免疫耐受基因SERPINH1載體與pNF-KappaB-Seap報(bào)告基因(CloneTech公司)通過lipofectin2000(Invitrogen)共同轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，然后用1μg/mlLPS或25μg/mlPolyI:C刺激，24小時(shí)后吸取上清。上清液用clonetech公司提供的“Great Esc Ape SEAPChemilumine Scence”檢測(cè)試劑盒，通過clonetech公司提供的方法和程序，分析上清液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(Chemilumine Scence)。
2)、腫瘤相關(guān)免疫耐受基因SERPINH1轉(zhuǎn)染的RAW264.7，在600μg/ml G418選擇條件下，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。染色后通過流式細(xì)胞儀分析這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面刺激分子CD40、CD80和CD86及其它共刺激分子的表達(dá)。同時(shí)，分析這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在不同的Toll-like受體連接鍵(1μg/ml LPS，25μg/ml Poly I:C 50μg/ml PGN和100nM B.DNA)的刺激后48小時(shí)細(xì)胞表面CD40、CD80、CD86和其它共刺激分子的表達(dá)。
3)、SERPINH1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞系的總RNA按照Invitrogen公司提供的方法與步驟，用Trizol試劑提取RNA?？俁NA用于基因芯片分析SERPINH1對(duì)細(xì)胞因子、化學(xué)趨化因子及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)的表達(dá)的影響。
4)、沉寂SERPINH1基因?qū)δ[瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞引導(dǎo)T調(diào)節(jié)細(xì)胞CD4+CD25+細(xì)胞的影響。應(yīng)用AMAXA公司提供的siRNA樹突細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒，按照該公司提供的試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。靶向免疫耐受基因SERPINH1的siRNA轉(zhuǎn)染的卵巢腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞與鼠脾Native T細(xì)胞共同培養(yǎng)10天后，流式細(xì)胞儀分析CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞的比例。
SERPINH1靶序列1#AACACTACAACTGCGAACACT；siRNA序列sense strand siRNACACUACAACUGCGAACACUtt和antisense strandsiRNAAGUGUUCGCAGUUGUAGUGtt；SERPINH1靶序列2#AACTACTATGACGACGAGAAG；siRNA序列sense strand siRNACUACUAUGACGACGAGAAGtt和antisense strandsiRNACUUCUCGUCGUCAUAGUAGtt；對(duì)照siRNA上述siRNA的人工突變形式(ΔsiRNA)siRNA序列sense strand siRNACAGUACCACUGCGAACACUtt和antisense strand siRNAAGUGUUCGCAGUGGUACUGtt；(正義鏈和反義鏈)。
用德國生產(chǎn)的Nucleofector核酸轉(zhuǎn)染儀(AMAXA公司)轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞。評(píng)價(jià)對(duì)樹突細(xì)胞的影響。
5)、沉寂SERPINH1基因?qū)渫患?xì)胞抗原呈遞功能的影響。靶向免疫耐受基因SERPINH1的siRNA轉(zhuǎn)染的卵巢腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞，裝載類乳頭瘤病毒質(zhì)粒后刺激類乳頭瘤病毒顆粒特異的T細(xì)胞反應(yīng)。通過ELISA試劑盒測(cè)定上清液IFN-γ的濃度。
6)、沉寂SERPINH1基因?qū)渫患?xì)胞抵抗腫瘤對(duì)樹突細(xì)胞的影響。用SBI SystemBiosciences公司提供的Double-Promoter pFIV-H1/U6siRNA克隆和表達(dá)質(zhì)粒，按照該公司提供的實(shí)驗(yàn)步驟組建了靶向SERPINH1基因的慢病毒感染系統(tǒng)。siRNA模版的設(shè)計(jì)和插入完全按照SBI System Biosciences公司提供的方法和步驟進(jìn)行。
SERPINH1siRNA模版1#5’cacaagctct ccagcctcat catc-3’和3’gtgttcgagaggtcggagtagtag-5’；SERPINH1siRNA模版2#5’-ctgcgcgatgaggaggtgcacacg-3’和3’gacgcgctactcctccacgtgtgc-5’。
對(duì)照siRNA模版上述siRNA模版的突變形式(ΔsiRNA)cacacgctct ccagcctcat cagc-3’和3’gtgtgcgagaggtcggagtagtcg-5’。
利用攜帶靶向SERPINH1基因siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞，同時(shí)設(shè)靶向SERPINH1基因siRNA的慢病毒對(duì)照。用慢病毒轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞，得到不同轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞與卵巢癌細(xì)胞在10％FCS1640培養(yǎng)基，37℃下共同培養(yǎng)，一周后，觀察樹突細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和抗原刺激分子和抗原呈遞功能分析。
本發(fā)明提供了一個(gè)非常有效的治療免疫耐受相關(guān)疾病功能基因SERPINH1的篩選與鑒定方法，在免疫相關(guān)性疾病如抗移植排斥反應(yīng)、腫瘤、炎癥、自身免疫性疾病研究有著重要的意義。通過體外培養(yǎng)建立了制備人免疫耐受樹突細(xì)胞的方法。對(duì)腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞遺傳背景分析，篩選和鑒定了免疫耐受功能基因。SERPINH1免疫耐受基因參與免疫耐受的引導(dǎo)，在免疫相關(guān)性疾病如抗移植排斥反應(yīng)、腫瘤、炎癥、自身免疫性疾病有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明的積極效果具體描述如下SERPINH1免疫耐受基因?qū)δ[瘤臨床免疫治療有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。腫瘤是危害人類身體健康的首要疾病之一，過去十年人們發(fā)展了多種抗腫瘤免疫治療，特別是以樹突細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療方法。但到目前為止，這些方法遠(yuǎn)沒有達(dá)到人們的預(yù)期效果，一個(gè)重要的原因就是腫瘤對(duì)干細(xì)胞和樹突細(xì)胞分化和功能的抑制。腫瘤細(xì)胞可通過直接接觸，細(xì)胞因子的釋放等因素引導(dǎo)樹突細(xì)胞的耐受。樹突細(xì)胞內(nèi)免疫耐受基因的發(fā)現(xiàn)與鑒定，可通過siRNA沉寂或片段缺失等生物學(xué)技術(shù)，降低樹突細(xì)胞內(nèi)免疫耐受基因的表達(dá)，抵抗腫瘤細(xì)胞對(duì)樹突細(xì)胞的抑制作用。這可成為腫瘤免疫治療的一種新手段。
SERPINH1免疫耐受基因?qū)σ浦才懦夥磻?yīng)臨床治療有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。組織器官移植已成為醫(yī)學(xué)上重要的治療手段之一。臨床上已開展同種肝臟、腎、脾、胰島、小腸移植，以及肝腎、肝胰、心肺、等聯(lián)合移植。由于移植物通常取自遺傳背景不同的另一個(gè)體，移植后常出現(xiàn)排斥反應(yīng)。建立受者對(duì)移植物組織抗原的免疫耐受是移植學(xué)家追求的目標(biāo)。樹突細(xì)胞控制著免疫反應(yīng)，免疫耐受基因SERPINH1基因轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞具有引導(dǎo)免疫耐受的功能，可通過SERPINH1轉(zhuǎn)染修飾的樹突細(xì)胞治療移植排斥反應(yīng)。
SERPINH1免疫耐受基因?qū)ψ陨砻庖咝约膊?，超敏性疾病和感染性疾病的臨床治療有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。樹突細(xì)胞是最重要的抗原呈遞細(xì)胞，這些細(xì)胞不僅能夠引導(dǎo)免疫反應(yīng)，也能引導(dǎo)免疫耐受，SERPINH1轉(zhuǎn)染或靶向這些基因的siRNA轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞可成為這些疾病治療的一種新手段。
此外，隨著現(xiàn)代生物材料的發(fā)現(xiàn)如納米材料，SERPINH1免疫耐受基因以及靶向這些基因siRNA可直接靶向到樹突細(xì)胞，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，治療與免疫有關(guān)的疾病如自身免疫性疾病、抗排斥反應(yīng)、腫瘤等。


圖1、腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞不具備成熟樹突細(xì)胞的特征。
圖2、SERPINH1在腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞高水平表達(dá)。
圖3、腫瘤相關(guān)免疫耐受基因SERPINH1抑制免疫激活因素對(duì)轉(zhuǎn)錄因素的激活。
圖4、腫瘤相關(guān)免疫耐受基因SERPINH1抑制刺激分子CD40的表達(dá)。
圖5、沉寂SERPINH1降低了腫瘤相關(guān)樹突細(xì)胞引導(dǎo)T調(diào)節(jié)CD4+CD25+細(xì)胞產(chǎn)生的能力。
圖6、沉寂SERPINH1促進(jìn)了腫瘤相關(guān)樹突細(xì)胞抗原呈遞功能。
圖7攜帶靶向SERPINH1基因siRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染促進(jìn)了樹突細(xì)胞抵抗腫瘤細(xì)胞的抑制作用。
圖8、攜帶靶向SERPINH1基因siRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染促進(jìn)了腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞抗原呈遞功能。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是本實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容做出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。
實(shí)施例1免疫耐受樹突細(xì)胞的制備。
具體制備方法1.1.實(shí)驗(yàn)材料1)、培養(yǎng)基是含有10％小牛血清(民海生物公司)的PRMI1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)，同時(shí)加入1％青霉素與1％鏈霉素。(Sigma公司)(重量)，以下記載中的培養(yǎng)基都是該培養(yǎng)基。
2)、卵巢腫瘤細(xì)胞是從鼠卵巢腫瘤組織分離的腫瘤細(xì)胞；卵巢腫瘤細(xì)胞由Dr.KatherineRoby提供。為了決定腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞的誘導(dǎo)是通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸還是腫瘤細(xì)胞本身分泌的因素，我們對(duì)卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行了如下處理A、用14000 Rad Co60照射卵巢癌細(xì)胞。這類細(xì)胞被用于評(píng)價(jià)細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸的影響。
B、卵巢癌細(xì)胞的培養(yǎng)上清液。培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞4天上清液被用于調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌因素的影響。
C、未經(jīng)處理的卵巢癌細(xì)胞被用于評(píng)價(jià)細(xì)胞與細(xì)胞的直接作用與細(xì)胞的分泌物對(duì)樹突細(xì)胞的影響。
3)、樹突細(xì)胞是由骨髓細(xì)胞在GM-CSF因子(R&D公司)的作用下，引導(dǎo)產(chǎn)生。4-6周健康C57BL/6(購自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)小鼠，斷頸處死后，取骨髓細(xì)胞，用消毒蒸餾水溶解去除紅細(xì)胞后，這些骨髓細(xì)胞培養(yǎng)在1000單位GM-CSF，10％FCSRPMIl640培養(yǎng)基中。培養(yǎng)4天的骨髓起源的樹突細(xì)胞作為未成熟的樹突細(xì)胞。
1.2.免疫耐受樹突細(xì)胞的引導(dǎo)。
A.培養(yǎng)4天的未成熟的樹突細(xì)胞，用生理鹽水洗三次，在24孔板分別與鼠卵巢癌腫瘤細(xì)胞，已照射卵巢癌細(xì)胞或卵巢癌細(xì)胞上清液共同培養(yǎng)9天。卵巢腫瘤細(xì)胞與樹突細(xì)胞的比例為1∶10。卵巢癌細(xì)胞上清液與新鮮培養(yǎng)基的比例是1∶3。
B.9天后這些處理的樹突細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀與卵巢癌細(xì)胞分離。用2μl FITC螢光素標(biāo)記的CD80抗體(BD PharMingen公司)染卵巢腫瘤細(xì)胞與樹突細(xì)胞，然后通過流式細(xì)胞儀從卵巢腫瘤細(xì)胞與樹突細(xì)胞的混和培養(yǎng)，分離樹突細(xì)胞。在這個(gè)共同培養(yǎng)系統(tǒng)，9天后，腫瘤細(xì)胞多數(shù)自動(dòng)消失，不需要近一步流式細(xì)胞儀分離。樹突細(xì)胞對(duì)照。未與腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)的樹突細(xì)胞作為對(duì)照細(xì)胞，為了保證對(duì)照樹突細(xì)胞的可比性，用2μl FITC螢光素標(biāo)記的CD80抗體染色后也通過流式細(xì)胞儀分離以排除其他污染的細(xì)胞。
1.3、免疫耐受樹突細(xì)胞的鑒定。
A.首先對(duì)免疫耐受樹突細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞不具備成熟樹突細(xì)胞的特征。圖1、腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞不具備成熟樹突細(xì)胞的特征。
B.免疫耐受樹突細(xì)胞表達(dá)低水平的刺激分子。為了決定腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)，腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞用生理鹽水洗三次后，分別加2μl FITC螢光素標(biāo)記的抗CD40、CD80和CD86抗體，流式細(xì)胞儀分析。圖1B顯示了腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞降低的共刺激分子的表達(dá)(a抗體亞型對(duì)照；b對(duì)照組樹突細(xì)胞；c腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞)。
C.免疫耐受樹突細(xì)胞具有相對(duì)較低的抗原呈遞功能和降低的引導(dǎo)免疫特異反應(yīng)的能力。
為了觀察腫瘤相關(guān)的免疫耐受樹突細(xì)胞的抗原工呈遞功能，按照我們以前的方法(J.Virology，2004，11152-11160)，用類乳頭瘤病毒質(zhì)粒(VLP)免疫鼠引導(dǎo)的特異性T細(xì)胞被用作靶細(xì)胞(2×106)，腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞與對(duì)照樹突細(xì)胞在裝載類乳頭瘤病毒質(zhì)粒(VLP)后作為刺激細(xì)胞。共同培養(yǎng)48小時(shí)，取上清，通過酶聯(lián)試劑盒(R&D Co.)分析上清液中的IFN-γ含量。結(jié)果顯示了免疫耐受樹突細(xì)胞具有相對(duì)較低的抗原呈遞功能和降低的引導(dǎo)免疫特異反應(yīng)的能力(圖1C)。
圖1、腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞不具備成熟樹突細(xì)胞的特征。A、光鏡下的腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞，A1對(duì)照組樹突細(xì)胞；A2腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞。B、腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞共刺激分子的表達(dá)，a抗體亞型對(duì)照；b對(duì)照組樹突細(xì)胞；c腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞。C、腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞降低的抗原呈遞能力，DC對(duì)照樹突細(xì)胞；T.DC腫瘤相關(guān)的免疫耐受樹突細(xì)胞；Contr.僅樹突細(xì)胞。DC:T樹突細(xì)胞與T細(xì)胞的比率。
2.免疫耐受樹突細(xì)胞內(nèi)免疫耐受基因的鑒定。
本發(fā)明為了決定或鑒定腫瘤相關(guān)的免疫耐受基因，對(duì)腫瘤相關(guān)性樹突細(xì)胞總RNA通過基因芯片進(jìn)行了分析。首先按照Invitrogen公司提供的步驟，從腫瘤相關(guān)性樹突細(xì)胞用Trizol試劑(購自Invitrogen公司)提取總RNA。
2.1.基因芯片分析方法A、5μg總RNA用于合成單股cDNA。用寡核苷酸和dT作為引物(Proligo，Boulder，co)以及SuperScript choice合成單股cDNA，然后合成雙股cDNA。
B、雙股cDNA通過苯酚-氯仿(兩種液體等體積)抽提后，利用BioArray RNA high yieldTranscript labeling試劑盒(Inzo Bioche)。通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生Biomylated anti-sense cRNA。15mg的Biotimylated cRNA在94℃處理35分鐘(100mM Trix-acetate，PH8.2，500mM KoAc，150mMMgOAc)，隨后10ug總的處理過的cRNA在45℃下與Affymetrix(Affymetrix，Inc.)人基因組基因芯片雜交，輕輕搖動(dòng)(60rpm)16小時(shí)。用Affymetrix Fluidics Station400洗染芯片除去未雜交的cRNA，然后用streptavidin-PE結(jié)合Biotimylated cRNA，再與羊抗-streptavidin Ab孵育。用Hewlett-Packard G2500 GeneArray檢測(cè)熒光強(qiáng)度。用MicroArray Suite 5.0軟件(Affymetrix)對(duì)每個(gè)基因芯片進(jìn)行圖像分析。為了比較不同的芯片，使用全球尺度，確定150作為熒光強(qiáng)度值。
C、為了確保來自不同樣本的可比性，我們采用芯片分析系統(tǒng)Agilent Bioanalyzer(PaloAlto，CA)Agilent 2100 Bioanalyzer與“Lab on a chip”(芯片實(shí)驗(yàn)室，這項(xiàng)技術(shù))技術(shù)證實(shí)了所有樣本有著類似的rRNA比率，18S和28S比率為1∶2和清晰的“run pattern”(電泳條帶)。同樣的，這個(gè)技術(shù)也被用于確認(rèn)cRNA和已片段化的cRNA(fragmented cRNA)。為了確保雜交的質(zhì)量，Genechip影像，不同芯片之間的比較，我們也研究了以下參數(shù)等級(jí)參數(shù)(scaling factor)；背景；保留基因。為了評(píng)估質(zhì)量控制，我們也比較了每個(gè)組不同上調(diào)與下調(diào)的百分比。起始表達(dá)結(jié)果是基于不同實(shí)驗(yàn)條件下的比較，試驗(yàn)組與對(duì)照組的表達(dá)水平至少顯示2倍的變化，才被認(rèn)為有意義。
2.2.通過對(duì)鼠腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞與對(duì)照樹突細(xì)胞相比較，正如圖2顯示的，一部分基因被上調(diào)，而另一部分基因下調(diào)。在這些卵巢腫瘤相關(guān)的免疫耐受基因(卵巢腫瘤上調(diào)或下調(diào)的基因)中，SERPINH1明顯上調(diào)(圖2A)。明顯上調(diào)的SERPINH1基因在卵巢腫瘤相關(guān)的樹突細(xì)胞的高水平表達(dá)由半定量PCR(圖2B)和定量PCR(圖2C)得到進(jìn)一步證實(shí)。SERPINH1引物5‘a(chǎn)tgcgctctctccttctgggcacc3’和3’caactcatctcgcatcttgtctcc5’。
圖2、SERPINH1在腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞高水平表達(dá)。A、腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞基因芯片分析。T.DC腫瘤相關(guān)樹突細(xì)胞；DC對(duì)照樹突細(xì)胞。B1和C1SERPINH1在對(duì)照樹突細(xì)胞的表達(dá)；B2和C2SERPINH1在腫瘤相關(guān)樹突細(xì)胞的表達(dá)。B、半定量PCR，C、定量PCR；R.E相對(duì)強(qiáng)度；GAPDH陽性保留基因?qū)φ铡?br> 3、SERPINH1免疫相關(guān)耐受基因的克隆。首先按照Invitrogen公司提供的步驟，從腫瘤相關(guān)性樹突細(xì)胞用Trizol試劑提取總RNA。用SERPINH1引物5‘a(chǎn)tgcgctctctccttctgggcacc3’和3’caactcatctcgcatcttgtctcc5’。用Invitrogen提供的RT-PCR試劑盒進(jìn)行分析，按照該公司提供的實(shí)驗(yàn)步驟擴(kuò)增SERPINH1基因，通過Invitrogen膠提取試劑盒提取擴(kuò)增的SERPINH1基因片段。然后通過Invitrogen公司提供的pCDNA3.1His/V5 ToPo載體，根據(jù)該公司提供的實(shí)驗(yàn)步驟將SERPINH1基因克隆到pCDNA3.1His/V5 ToPo載體。最后，通過測(cè)序確定SERPINH1序列。
4、對(duì)篩選腫瘤相關(guān)免疫耐受基因功能的確定。
4.1、腫瘤相關(guān)免疫耐受基因SERPINH1對(duì)轉(zhuǎn)錄因素的影響。
為了決定SERPINH1基因?qū)γ庖哒{(diào)節(jié)功能的影響。用載有免疫耐受基因SERPINH1的載體與pNF-KappaB-Seap報(bào)告基因(CloneTech公司)通過lipofectin2000(Invitrogen)共同轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，然后用1μg/mlLPS或25μg/ml PolyI:C刺激，24小時(shí)后吸取上清。上清液用clonetech公司提供的“Great Esc Ape SEAP Chemilumine Scence”檢測(cè)試劑盒，通過clonetech公司提供的方法和程序，分析上清液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(Chemilumine Scence)。正如圖3中所示的，SERPINH1明顯抑制了LPS和PolyI:C對(duì)轉(zhuǎn)錄因素NF-kappaB的激活。
圖3、腫瘤相關(guān)免疫耐受基因SERPINH1抑制免疫激活因素對(duì)轉(zhuǎn)錄因素的激活。RAW264.7單核吞噬細(xì)胞系對(duì)照；TRAW264.7SERPINH1轉(zhuǎn)染的單核吞噬細(xì)胞。Contr僅RAW264.7或TRAW264.7上清液；LPS用1μg/ml LPS刺激RAW264.7或TRAW264.7上清液；Poly I:C用25μg/ml Poly I:C刺激RAW264.7或TRAW264.7上清液?；瘜W(xué)發(fā)光強(qiáng)度由克隆公司提供的試劑盒檢測(cè)。
4.2、腫瘤相關(guān)免疫耐受基因SERPINH1對(duì)共刺激分子表達(dá)的影響。
腫瘤相關(guān)免疫耐受基因SERPINH1轉(zhuǎn)染的RAW264.7，在600μg/ml G418選擇條件下，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。染色后通過流式細(xì)胞儀分析這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面刺激分子CD40、CD80和CD86及其它共刺激分子的表達(dá)。同時(shí)，分析這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在不同的Toll-like受體連接鍵(1μg/ml LPS，25μg/ml Poly I:C 50μg/ml PGN和100nM B.DNA)的刺激后48小時(shí)。細(xì)胞表面CD40、CD80、CD86和其它共刺激分子的表達(dá)。如圖4所示。SERPINH1轉(zhuǎn)染明顯降低了RAW264.7對(duì)Toll-like受體連接鍵刺激的反應(yīng)能力，降低了CD40的表達(dá)。圖4、腫瘤相關(guān)免疫耐受基因SERPINH1抑制刺激分子CD40的表達(dá)。a抗體亞型對(duì)照；b腫瘤相關(guān)免疫耐受基因轉(zhuǎn)染的單核吞噬細(xì)胞；c未轉(zhuǎn)染的單核吞噬細(xì)胞對(duì)照。SERPINH1基因轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的Raw264.7在給予100nM B.DNA，1μg/ml LPS，25μg/ml PGN，25μg/ml PolyI:C刺激48小時(shí)后，CD40的表達(dá)。
4.3、腫瘤相關(guān)免疫耐受基因SERPINH1對(duì)細(xì)胞因子、化學(xué)趨化因子、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)分子表達(dá)的影響。SERPINH1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞系的總RNA按照invitrogen公司提供的方法與步驟，用Trizol試劑提取?？俁NA用于基因芯片分析。與對(duì)照未轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞相比，SERPINH1明顯影響了一些細(xì)胞因子、化學(xué)趨化因子及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)的表達(dá)(表1-3)。
表1、腫瘤相關(guān)免疫耐受基因SERPINH1對(duì)細(xì)胞因子及相關(guān)基因表達(dá)的影響。
GeneGene Title Symbol Contr.SERPINH1interleukin 2 receptor，gamma chainll2rg 305.8 407.8interleukin 18 ll18645.5 602.7interleukin enhancer binding factor 2 llf250.4 89.7interleukin 15 ll1550.1 256.6interleukin 1 family，member 6 ll16371.4 355.8interleukin 17 receptorll17r 333.1 145Interleukin 17 receptorll17r 547.5 321interleukin 6 signal transducerll6st 107.2 131.3interleukin 1 alphall1a2398.21102.1interleukin-1 receptor-associated kinase 4 lrak4 140.3 56.8interleukin 15 receptor，alpha chain ll15ra 175.2 333.8interleukin 1 receptor antagonist ll1rn 3006.91817.2interleukin 1 family，mamber 9 ll119 563.6 683.7interleukin 13 receptor，alpha 1 ll13ra1 67.6 182.7interleukin-1 receptor-associated kinase 3 lrak3 670.6 380.3interleukin-1 receptor-associated kinase 3 lrak3 1001.6641.1interleukin 15 receptor，alpha chain ll15ra 118.8 446.8interleukin 1 beta ll1b7108.35566interleukin 6 ll6 872.3 2483.1interleukin 10 ll10220.1 30.2interleukin 18 binding protein ll18bp 64.8 8.2interleukin 1 receptor-like 1 ligand ll1rl1l 256.7 218.2interleukin 13 receptor，alpha 1 ll13ra1 234.3 228.9表2、腫瘤相關(guān)免疫抑制基因SERPINH1對(duì)化學(xué)趨化因子及其相關(guān)基因表達(dá)的影響。
Gene TitleGene SymbolContr.SERPINH1chemokine(C-C motif)ligand 6 Ccl6 307.1 387.9chemokine(C-X-C motif)ligand 7Cxcl7 28.1 29.1chemokine(C-X-C motif)ligand 10 Cxcl10 4153 8151.8chemokine(C-C motif)ligand 12 Ccl12 2065.81080.5chemokine(C-X-C motif)ligand 11 Cxcl11 135 6 396.5chemokine(C-C motif)ligand 6 Ccl6 114.8 67.8chemokine(C-C motif)ligand 2 Ccl2 26506 3 32813chemokine(C-C motif)ligand 7 Ccl7 5897 410509.9chemokine(C-C motif)ligand 4 Ccl4 21904.6 16951.2chemokine(C-X-C motif)receptor 4 Cxcr4 87.7 150.8chemokine(C-X-C motif)ligand 4Cxcl4 2757 21774.9chemokine(C-X-C motif)ligand 2Cxcl2 10286.6 13843.3chemokine(C-C motif)ligand 24 Ccl24 11.2 15chemokine(C-X-C motif)ligand 1Cxcl1 160 116.8表3、腫瘤相關(guān)免疫抑制基因SERPINH1對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)相關(guān)分子表達(dá)的影響。
Gene Title Gene SymbolContr.SERPINH1Rho GTP ase activating protein 9 Arhgap9627.3 570.7Rho GTP ase activating protein 1 Arhgap1430.6 262.5Rho GTP ase activating protein 24 Arhgap24 149.6 190.7Rho GTP ase activating protein 10 Arhgap10 228.8 170.4Rho GTP ase activating protein 17 Arhgap17 358 308.7activating transcription factor 2 Atf2 214 252.4Rho GTP ase activating protein 18 Arhgap18 69.2 19.2IQ motif containing GTP ase activating protein 1 Iqgap1 119.7 79.9Rho GTP ase activating protein 9 Arhgap9631.7 415.4activating transcription factor 7 Atf7 60.4 92.1Rho GTP ase activating protein 11A Arhgap11a 268.7 163.6activating transcription factor 4 Atf4 8303 9288.3activating transcription factor 3 Atf3 3868.35560.4Rho GTP ase activating protein 9 Arhgap9256.3 286.2apoptotic prote ase activating factor 1Apaf1 119.6 139.5Rac GTP ase-activating protein 1 Racgap1819.5 297.9Rho GTP ase activating protein 12 Arhgap12 158.3 103.1cyclin-depandent kinase 7 Cdk7 126.6 200.7activating transcription factor 2 Atf2 217.1 218.9apoptotic prote ase activating factor 1Apaf1 205.4 148.5Cdc42 GTP ase-activating protein Cdgap 179 93T-cell activation GTP ase activating protein 1 Tagap1 373.5 360.5表1-3轉(zhuǎn)染SERPINH1基因的Raw264.7的基因芯片分析Contr未轉(zhuǎn)染SERPINH1基因的Raw264.7細(xì)胞。SERPINH1轉(zhuǎn)染SERPINH1基因的Raw264.7細(xì)胞。
4.4、沉寂腫瘤相關(guān)免疫耐受基因SERPINH1的siRNA抑制腫瘤相關(guān)免疫耐受細(xì)胞引導(dǎo)CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生。應(yīng)用AMAXA公司提供的siRNA樹突細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒，按照該公司提供的試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。靶向免疫耐受基因SERPINH1的siRNA轉(zhuǎn)染的卵巢腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞與鼠脾Native T細(xì)胞共同培養(yǎng)10天后，流式細(xì)胞儀分析CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示了免疫耐受基因siRNA沉寂樹突細(xì)胞免疫抑制基因的表達(dá)，明顯抑制了CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生(圖5)。SERPINH1靶序列1#AACACTACAACTGCGAACACT；siRNA序列sense strand siRNACACUACAACUGCGAACACUtt和antisense strand siRNAAGUGUUCGCAGUUGUAGUGtt；SERPINH1靶序列2#AACTACTATGACGACGAGAAG；siRNA序列sense strand siRNACUACUAUGACGACGAGAAGtt和antisense strand siRNACUUCUCGUCGUCAUAGUAGtt；對(duì)照siRNA上述siRNA的人工突變形式(ΔsiRNA)siRNA序列sense strand siRNACAGUACCACUGCGAACACUtt和antisense strand siRNAAGUGUUCGCAGUGGUACUGtt；用德國生產(chǎn)的AMAXAsiRNA轉(zhuǎn)染儀轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞。圖5、沉寂SERPINH1降低了腫瘤相關(guān)樹突細(xì)胞引導(dǎo)T調(diào)節(jié)CD4+CD25+細(xì)胞產(chǎn)生的能力。T.siRNADC靶向SERPINH1基因siRNA轉(zhuǎn)染的腫瘤相關(guān)樹突細(xì)胞；T.MsiRNA對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的腫瘤相關(guān)樹突細(xì)胞。
4.5、沉寂SERPINH1促進(jìn)了腫瘤相關(guān)樹突細(xì)胞抗原呈遞功能。靶向免疫耐受基因的SERPINH1siRNA轉(zhuǎn)染的卵巢腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞裝載類乳頭瘤病毒質(zhì)粒能夠刺激類乳頭瘤病毒顆粒特異的T細(xì)胞反應(yīng)，引導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生。如圖6所示的，IFN-γ水平明顯高于對(duì)照siRNA(ΔsiRNA)感染的樹突細(xì)胞。圖6、沉寂SERPINH1促進(jìn)了腫瘤相關(guān)樹突細(xì)胞抗原呈遞功能。
4.6、攜帶靶向SERPINH1基因siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染促進(jìn)了樹突細(xì)胞抵抗腫瘤細(xì)胞的抑制作用。為了進(jìn)一步?jīng)QSERPINH1免疫耐受基因?qū)渫患?xì)胞功能的影響，建立了攜帶靶向SERPINH1基因siRNA的慢病毒感染系統(tǒng)。SBI System Biosciences公司提供的Double-Promoter pFIV-H1/U6siRNA克隆和表達(dá)了質(zhì)粒。siRNA模版的設(shè)計(jì)和插入完全按照SBI System Biosciences公司提供的方法和步驟進(jìn)行。SERPINH1siRNA模版1#5’cacaagctctccagcctcat catc-3’和3’gtgttcgagaggteggagtagtag-5’；SERPINH1siRNA模版2#5’-ctgcgcgatgaggaggtgcacacg-3’和3’gacgcgctactcctccacgtgtgc-5’。對(duì)照siRNA模版上述siRNA模版的突變形式(ΔsiRNA)cacacgctct ccagcctcat cagc-3’和3’gtgtgcgagaggtcggagtagtcg-5’。轉(zhuǎn)染率可通過自身GFP的表達(dá)檢測(cè)。利用攜帶靶向SERPINH1基因siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞，同時(shí)設(shè)靶向SERPINH1基因siRNA的慢病毒對(duì)照。用慢病毒轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞，如圖7，90％的樹突細(xì)胞轉(zhuǎn)染。得到不同轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞與卵巢癌細(xì)胞共同培養(yǎng)，一周后，觀察了樹突細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和抗原刺激分子。結(jié)果清楚地展示了，攜帶靶向腫瘤免疫耐受基因siRNA的慢病毒，明顯抵抗卵巢癌細(xì)胞對(duì)樹突細(xì)胞的影響，而攜帶對(duì)照siRNA的慢病毒則不能抵抗卵巢癌腫瘤細(xì)胞對(duì)樹突細(xì)胞的抑制效果，導(dǎo)致耐受性樹突細(xì)胞的產(chǎn)生(圖7)。圖7攜帶靶向SERPINH1基因siRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染促進(jìn)了樹突細(xì)胞抵抗腫瘤細(xì)胞的抑制作用。A整合靶向腫瘤相關(guān)免疫耐受基因SERPINH1siRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞。A1、光鏡下樹突細(xì)胞；A2、GFP在慢病毒轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞的表達(dá)。ΔsiRNA對(duì)照siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞；siRNASERPINH1siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞。
4.7、靶向免疫耐受基因siRNA促進(jìn)了樹突細(xì)胞的抗原呈遞功能。
靶向SERPINH1基因siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗原呈遞功能，裝載類乳頭瘤病毒質(zhì)粒的不同siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞能夠刺激類乳頭瘤病毒顆粒刺激的T細(xì)胞反應(yīng)。如圖8所示的，IFN-γ水平明顯高于攜帶對(duì)照siRNA慢病毒感染的樹突細(xì)胞。圖8、攜帶靶向SERPINH1基因siRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染促進(jìn)了樹突細(xì)胞抵抗腫瘤細(xì)胞的抑制作用。DC對(duì)照組樹突細(xì)胞；T.DC腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞；T.siRNADC靶向SERPINH1基因siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染的腫瘤相關(guān)樹突細(xì)胞；T.ΔsiRNA對(duì)照siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染的腫瘤相關(guān)樹突細(xì)胞；僅樹突細(xì)胞僅對(duì)照樹突細(xì)胞和轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞。DC:T樹突細(xì)胞與T細(xì)胞的比率。
4.8、腫瘤免疫耐受基因抑制免疫刺激因素引導(dǎo)的樹突細(xì)胞成熟。免疫刺激因素如Toll-like受體連接鍵(LPS、Poly I:C、CPG和PGN)能夠激活NF-KappaB信號(hào)途徑，引導(dǎo)樹突細(xì)胞的成熟。腫瘤免疫耐受基因SERPINH1轉(zhuǎn)染的單核細(xì)胞RAW264.7能夠抵抗這些Toll-like受體連接鍵對(duì)轉(zhuǎn)錄因素NF-KappaB的激活作用，阻止共刺激分子的表達(dá)(圖3、圖4)。
序列表SEQUENCE LISTING<110>南開大學(xué)<120>篩選與鑒定治療免疫耐受相關(guān)疾病功能基因SERPINH1的方法<130>2006023<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1254<212>DNA<213>小鼠mouse<400>1atgcgctctc tccttctggg caccttatgc ctcttggccg tggccctggc agccgaggtg 60aagaaacccc tagaggcggc agcccctggt actgcggaga agctaagttc caaggcgacc 120acactggcag agcgcagcac aggcctggcc ttcagcctat atcaggcgat ggccaaagac 180caggcggtgg agaacatcct cctgtcaccc ttggtggtgg cctcatccct gggtcttgtg 240tcactgggtg gtaaagccac cacagcgtcg caggcgaagg cagtgctgag cgctgagaag 300ctgcgcgatg aggaggtgca cacggggctg ggtgagctgc tccgctccct cagcaactcc 360actgcgcgca acgtgacctg gaaactgggc agccgcctgt acgggcccag ctccgtgagc 420ttcgccgatg acttcgtgcg cagcagcaag caacactaca actgcgaaca ctccaagatc 480aacttccgag acaagcgcag cgccctgcag tccatcaacg agtgggcctc gcagaccacg 540gacggcaagc tgcctgaggt caccaaggat gtggagcgca cggatggggc actgcttgtg 600aacgccatgt tctttaagcc acactgggat gagaggtttc accacaggat ggtggacaac 660cgtggcttca tggtgacccg ctcctatact gtgggtgtta cgatgatgca ccggacaggc 720ctgtacaact actatgacga cgagaaggag aagctgcaga tggtggagat gcccctggct 780cacaagctct ccagcctcat catcctcatg ccccaccatg tggagccgct cgagcgcttg 840gagaagctgc tgaccaagga gcagctgaag gcctggatgg gaaagatgca gaagaaggct 900gtcgccatct ccctgcccaa gggcgtggtg gaggtgaccc atgacctgca gaaacatctg 960gcaggactgg gcctgaccga agccatcgac aagaacaagg cagacctatc gcgcatgtct1020ggcaagaagg acctgtacct ggccagtgtg ttccacgcca ctgccttcga gtgggacacc1080gagggcaacc cctttgacca agacatctac gggcgcgagg agctgcgcag ccccaagctg1140ttctatgccg accacccctt catcttcctg gtgcgagata atcagagcgg ctccttgctc1200ttcattggcc gcctggtccg gcccaaggga gacaagatgc gagatgagtt gtag 125權(quán)利要求
1.一種篩選與鑒定治療免疫耐受相關(guān)疾病功能基因SERPINH1的方法，其特征在于包括下述步驟(1)免疫耐受樹突細(xì)胞的制備和鑒定1)取小鼠的骨髓細(xì)胞，用水溶解去除紅細(xì)胞后，在1000單位GM-CSF，10％FCSRPMI1640培養(yǎng)基中，37℃溫度下培養(yǎng)4天的骨髓起源的樹突細(xì)胞作為未成熟的樹突細(xì)胞；2)用生理鹽水洗三次未成熟的樹突細(xì)胞，分別與鼠卵巢癌腫瘤細(xì)胞，已照射Co60的鼠卵巢癌細(xì)胞或鼠卵巢癌細(xì)胞上清液在1000單位GM-CSF，10％FCSRPMI1640培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)9天；3)用2μl FITC螢光素標(biāo)記的CD80抗體(BD PharMingen公司)染鼠卵巢腫瘤細(xì)胞與樹突細(xì)胞，在10％FCSRPMI1640培養(yǎng)基中混和培養(yǎng)9天，然后通過流式細(xì)胞儀分離出樹突細(xì)胞，得腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞；4)觀察腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞的形態(tài)與結(jié)構(gòu)；5)將腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞用生理鹽水洗三次后，分別加2μl FITC螢光素標(biāo)記的抗CD40、CD80和CD86抗體染色，流式細(xì)胞儀分析，分析免疫耐受樹突細(xì)胞刺激分子的表達(dá)；6)用類乳頭瘤病毒質(zhì)粒(VLP)免疫鼠引導(dǎo)的特異性T細(xì)胞作為靶細(xì)胞，腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞與對(duì)照樹突細(xì)胞在裝載類乳頭瘤病毒質(zhì)粒(VLP)后作為刺激細(xì)胞；在10％FCSRPMI1640培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)48小時(shí)，取上清液，通過酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒分析上清液中的IFN-γ(干擾素γ)含量；(2)免疫耐受樹突細(xì)胞內(nèi)免疫耐受基因的篩選1)用Trizol試劑從腫瘤相關(guān)性樹突細(xì)胞提取總RNA；2)用基因芯片對(duì)腫瘤相關(guān)性樹突細(xì)胞總RNA進(jìn)行分析1、用寡核苷酸和dT作為引物以及SuperScript choice(cDNA合成試劑盒SuperScriptTM Choice System For cDNA Synthesis Kit)合成單股cDNA；2、合成雙股cDNA，雙股cDNA通過苯酚-氯仿抽提后，利用BioArray RNA high yieldTranscript labeling試劑盒(Inzo Bioche)，通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生Biomylated anti-sense cRNA；3、處理過的cRNA在45℃下與Affymetrix基因組基因芯片雜交，用Affymetrix FluidicsStaion400洗染基因芯片除去未雜交的cRNA，然后用streptavidin-PE結(jié)合Biotimylated cRNA，再與羊抗-streptavidin Ab孵育；用Hewlett-Packard G2500 GeneArray檢測(cè)熒光強(qiáng)度，用MicroArray Suite 5.0軟件對(duì)每個(gè)基因芯片進(jìn)行圖像分析；4、采用Agilent Bioanalyzer和“Lab on a chip”(芯片實(shí)驗(yàn)室技術(shù))證實(shí)所有樣本有著類似的rRNA比率；5、根據(jù)美國基因庫提供生物信息，對(duì)在腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞基因芯片分析中明顯上調(diào)的基因或明顯下調(diào)的基因；6、通過半定量PCR和定量PCR方法進(jìn)一步評(píng)價(jià)SERPINH1基因在腫瘤相關(guān)的樹突細(xì)胞的高水平表達(dá)；根據(jù)基因庫提供生物信息，找出在腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞中明顯上調(diào)的SERPINH1基因序列如下atgcgctctc tccttctggg caccttatgc ctcttggccg tggccctggc agccgaggtgaagaaacccc tagaggcggc agcccctggt actgcggaga agctaagttc caaggcgaccacactggcag agcgcagcac aggcctggcc ttcagcctat atcaggcgat ggccaaagaccaggcggtgg agaacatcct cctgtcaccc ttggtggtgg cctcatccct gggtcttgtgtcactgggtg gtaaagccac cacagcgtcg caggcgaagg cagtgctgag cgctgagaagctgcgcgatg aggaggtgca cacggggctg ggtgagctgc tccgctccct cagcaactccactgcgcgca acgtgacctg gaaactgggc agccgcctgt acgggcccag ctccgtgagcttcgccgatg acttcgtgcg cagcagcaag caacactaca actgcgaaca ctccaagatcaacttccgag acaagcgcag cgccctgcag tccatcaacg agtgggcctc gcagaccacggacggcaagc tgcctgaggt caccaaggat gtggagcgca cggatggggc actgcttgtgaacgccatgt tctttaagcc acactgggat gagaggtttc accacaggat ggtggacaaccgtggcttca tggtgacccg ctcctatact gtgggtgtta cgatgatgca ccggacaggcctgtacaact actatgacga cgagaaggag aagctgcaga tggtggagat gcccctggctcacaagctct ccagcctcat catcctcatg ccccaccatg tggagccgct cgagcgcttggagaagctgc tgaccaagga gcagctgaag gcctggatgg gaaagatgca gaagaaggctgtcgccatct ccctgcccaa gggcgtggtg gaggtgaccc atgacctgca gaaacatctggcaggactgg gcctgaccga agccatcgac aagaacaagg cagacctatc gcgcatgtctggcaagaagg acctgtacct ggccagtgtg ttccacgcca ctgccttcga gtgggacaccgagggcaacc cctttgacca agacatctac gggcgcgagg agctgcgcag ccccaagctgttctatgccg accacccctt catcttcctg gtgcgagata atcagagcgg ctccttgctcttcattggcc gcctggtccg gcccaaggga gacaagatgc gagatgagtt gtag設(shè)計(jì)SERPINH1基因引物5‘a(chǎn)tgcgctctctccttctgggcacc3’和3’caactcatctcgcatcttgtctcc5’；用Invitrogen提供的RT-PCR試劑盒進(jìn)行分析；用SybrGreen I檢測(cè)模式通過定量PCR，用TAKARA公司提供的SYBR green I螢光染料測(cè)定SERPINH1的轉(zhuǎn)錄水平；(3)克隆SERPINH1基因用Trizol試劑從腫瘤相關(guān)性樹突細(xì)胞提取總RNA；用SERPINH1引物5‘a(chǎn)tgcgctctctccttctgggcacc3’和3’caactcatctcgcatcttgtctcc5’，通過Invitrogen公司提供的RT-PCR試劑盒，擴(kuò)增SERPINH1基因，并且通過Invitrogen膠提取試劑盒提取擴(kuò)增的SERPINH1基因片段；然后通過Invitrogen公司提供的pCDNA3.1His/V5 ToPo載體，將SERPINH1基因克隆到pCDNA3.1His/V5 ToPo載體，測(cè)序確定出上述列出的SERPINH1序列；(4)對(duì)篩選的腫瘤相關(guān)免疫耐受相關(guān)基因功能進(jìn)一步鑒定1)、用載有免疫耐受基因SERPINH1載體(Invitrogen公司提供的pCDNA3.1His/V5 ToPo載體)與pNF-KappaB-Seap報(bào)告基因(CloneTech公司)通過lipofectin2000(Invitrogen)共同轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，然后用1μg/mlLPS或25μg/ml PolyI:C刺激，24小時(shí)后吸取上清液，上清液用clonetech公司提供的“Great Esc Ape SEAP Chemilumine Scence”檢測(cè)試劑盒，分析上清液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度；2)、腫瘤相關(guān)免疫耐受基因SERPINH1轉(zhuǎn)染的RAW264.7，在600μg/ml G418選擇條件下，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系(免疫耐受基因SERPINH1轉(zhuǎn)染的RAW264.7)，染色后通過流式細(xì)胞儀分析這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面刺激分子CD40、CD80和CD86及其它共刺激分子的表達(dá)，分析這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在不同的Toll-like受體連接鍵(1μg/ml LPS，25μg/ml Poly I:C 50μg/ml PGN和100nM B.DNA)的刺激后48小時(shí)細(xì)胞表面CD40、CD80、CD86和其它表面分子共刺激分子的表達(dá)；3)、SERPINH1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞系的總RNA再按照Invitrogen公司提供的方法與步驟，用Trizol試劑提取RNA，總RNA用于基因芯片分析SERPINH1對(duì)細(xì)胞因子、化學(xué)趨化因子及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)的表達(dá)的影響；4)、沉寂SERPINH1基因?qū)δ[瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞引導(dǎo)T調(diào)節(jié)細(xì)胞CD4+CD25+細(xì)胞的影響，應(yīng)用AMAXA公司提供的siRNA樹突細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，靶向免疫耐受基因SERPINH1的siRNA轉(zhuǎn)染的卵巢腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞與鼠脾Native T細(xì)胞共同培養(yǎng)10天后，在10％FCSRPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃；流式細(xì)胞儀分析CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞的比例SERPINH1靶序列1#AACACTACAACTGCGAACACT；siRNA序列sense strand siRNACACUACAACUGCGAACACUtt和antisense strandsiRNAAGUGUUCGCAGUUGUAGUGtt；SERPINH1靶序列2#AACTACTATGACGACGAGAAG；siRNA序列sense strand siRNACUACUAUGACGACGAGAAGtt和antisense strandsiRNACUUCUCGUCGUCAUAGUAGtt；對(duì)照siRNA上述siRNA的人工突變形式(ΔsiRNA)siRNA序列sense strand siRNACAGUACCACUGCGAACACUtt和antisense strand siRNAAGUGUUCGCAGUGGUACUGtt；用德國生產(chǎn)的Nucleofector核酸轉(zhuǎn)染儀(AMAXA公司)將siRNA轉(zhuǎn)染至樹突細(xì)胞；評(píng)價(jià)對(duì)樹突細(xì)胞的影響；5)、沉寂SERPINH1基因?qū)渫患?xì)胞抗原呈遞功能的影響，靶向免疫耐受基因SERPINH1的siRNA轉(zhuǎn)染的卵巢腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細(xì)胞，裝載類乳頭瘤病毒質(zhì)粒后刺激類乳頭瘤病毒顆粒特異的T細(xì)胞反應(yīng)，通過ELISA試劑盒測(cè)定上清液干擾素γ(IFN-γ)的濃度，6)、沉寂SERPINH1基因?qū)渫患?xì)胞抵抗腫瘤對(duì)樹突細(xì)胞的影響，用SBI SystemBiosciences公司提供的Double-Promoter pFIV-H1/U6siRNA克隆和表達(dá)質(zhì)粒，按照該公司提供的實(shí)驗(yàn)步驟組建了靶向SERPINH1基因的慢病毒感染系統(tǒng)，siRNA模版的設(shè)計(jì)和插入按照SBI System Biosciences公司提供的方法和步驟進(jìn)行；SERPINH1siRNA模版1#5’cacaagctct ccagcctcat catc-3’和3’gtgttcgagaggtcggagtagtag-5’；SERPINH1siRNA模版2#5’-ctgcgcgatgaggaggtgcacacg-3’和3’gacgcgctactcctccacgtgtgc-5’；對(duì)照siRNA模版上述siRNA模版的突變形式(ΔsiRNA)cacacgctct ccagcctcat cagc-3’和3’gtgtgcgagaggtcggagtagtcg-5’。利用攜帶靶向SERPINH1基因siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞，同時(shí)設(shè)靶向SERPINH1基因siRNA的慢病毒對(duì)照，用慢病毒轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞，得到不同轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞與卵巢癌細(xì)胞在10％FCS1640培養(yǎng)基中37℃共同培養(yǎng)，一周后，觀察樹突細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和抗原刺激分子和進(jìn)行抗原呈遞功能分析以決定抗原呈遞功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選和鑒定方法，其特征在于步驟(1)卵巢腫瘤細(xì)胞與樹突細(xì)胞的比例為1∶10；卵巢癌細(xì)胞上清液與新鮮培養(yǎng)基的比例是1∶3，體積。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的功能基因SERPINH1的應(yīng)用于免疫相關(guān)性疾病的治療的藥劑，包括抗移植排斥反應(yīng)、腫瘤、炎癥、自身免疫性疾病。
全文摘要
本發(fā)明提供了診斷和治療免疫耐受相關(guān)疾病功能基因SERPINH1的篩選與鑒定方法。通過體外培養(yǎng)建立了制備人免疫耐受樹突細(xì)胞，SERPINH1基因在免疫耐受樹突細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高。當(dāng)SERPINH1基因或靶向這些基因的siRNA轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞系，將影響其轉(zhuǎn)錄因素的激活，細(xì)胞因子的產(chǎn)生和共刺激分子的表達(dá)；重要的是轉(zhuǎn)染免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞樹突細(xì)胞后能夠發(fā)揮特有的免疫調(diào)節(jié)功能，引導(dǎo)免疫耐受。該基因在免疫相關(guān)性疾病如抗移植排斥反應(yīng)、腫瘤、炎癥、自身免疫性疾病的治療方面有著巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1840709SQ20061001309
公開日2006年10月4日 申請(qǐng)日期2006年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月23日
發(fā)明者楊榮存, 劉昱, R.盧登, W.如適, 張園, 張灼寒 申請(qǐng)人:南開大學(xué)