專利名稱：Hla芯片表面處理的制作方法
背景技術(shù)：
HLA抗原位于人的第6號(hào)染色體短臂的一個(gè)狹窄區(qū)域，是人體內(nèi)最復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，在免疫調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。HLA多態(tài)性檢測(cè)在醫(yī)學(xué)實(shí)踐和科研中具有十分重要意義，為器官、組織移植配型，疾病相關(guān)性研究，人類學(xué)及法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用等領(lǐng)域的發(fā)展提供了可靠的技術(shù)方法和有價(jià)值的資料。血清學(xué)方法是HLA-B抗原傳統(tǒng)的經(jīng)典分型方法，但是隨著對(duì)HLA研究的深入和對(duì)分型技術(shù)要求的不斷提高，以及越來越多的等位基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)和命名，血清學(xué)方法已經(jīng)無法獲得足夠的單特異性抗體，不能夠分辨出所有的特異性，而且標(biāo)準(zhǔn)抗血清的篩選技術(shù)復(fù)雜，難度大，人力物力消耗大，另外血清學(xué)方法之間存在較多，較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，使HLAI、II類抗原亞型的分辨較為困難。
隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基因分型已成為HLA分型的主要方法。近年來對(duì)I、II類抗原的基因分型研究取得了較大進(jìn)展。其中PCR-SSP、PCR-SSO、PCR-SSCP(單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析)3種分型方法對(duì)I類抗原的分型均獲得成功.但這些方法也存在一些明顯的不足，如PCR-SSP方法，主要依賴于PCR技術(shù)，對(duì)某一基因個(gè)體進(jìn)行分型時(shí)往往要設(shè)計(jì)大量的引物，這將很難避免接下來的PCR過程中的污染問題而導(dǎo)致的假陽性，而且操作復(fù)雜，需要通過多次的電泳來判斷最后的結(jié)果，不適合大批量樣本的分型，使其在臨床上的應(yīng)用受到限制；PCR-SSCP法對(duì)分析小于400bpPCR擴(kuò)增產(chǎn)物十分有效，但此法僅能探知基因變異的存在，而無法確定變異的確切位置及內(nèi)容，一般僅用作HLA匹配程度的分析，而不用來進(jìn)行HLA的具體分型。
基因芯片是近年來興起的一項(xiàng)前沿生物技術(shù)，是對(duì)傳統(tǒng)生物技術(shù)如檢測(cè)、DNA雜交、分型和測(cè)序技術(shù)重大的飛躍和創(chuàng)新，是涉及到生物信息學(xué)，微電子技術(shù)，計(jì)算機(jī)科學(xué)，半導(dǎo)體技術(shù)等諸多自然學(xué)科的綜合性技術(shù)，在生命科學(xué)領(lǐng)域中顯出了巨大的潛能和誘人前景?；蛐酒侵笇⒃S多特定的寡核昔酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律的排列固定于支持物上，然后與待測(cè)的標(biāo)記過的樣本基因進(jìn)行特異性雜交，通過激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一個(gè)探針上的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，從而得出大量信息。基因芯片具有高度集成和并行處理的特點(diǎn)，所需試劑和樣本量少，結(jié)果由計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)分析，是解決HLA眾多等位基因分型的有效方法。由于HLA個(gè)體遺傳學(xué)差異的本質(zhì)是在編碼其抗原產(chǎn)物的基因水平上，所以分析HLA基因型無疑是對(duì)HLA型別分析的最準(zhǔn)確的方法，其準(zhǔn)確性遠(yuǎn)高于血清與細(xì)胞學(xué)分型，并已逐漸取代了前兩者的位置，因此HLA抗原的DNA分型成為必然趨勢(shì)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用寡核苷酸芯片分型方法，依據(jù)第十三屆國際組織相容性工作會(huì)議報(bào)告及相關(guān)文獻(xiàn)，同時(shí)考慮遺傳的連鎖不平衡，及強(qiáng)脊炎，幼年型糖尿病等與HLA密切相關(guān)的遺傳病等因素，選擇了中國人群基因頻率較高的等位基因，根據(jù)HLA-A，HLA-B，HLA-DR，HLA-DQB，HLA-DQA不同基因亞型的獨(dú)特序列，完成了探針的設(shè)計(jì)與篩選，最后設(shè)計(jì)了213條探針(HLA-A56條，HLA-B66條，HLA-DQA22條，HLA-DQB38條，HLA-DR31條)，制成基因分型芯片，這些探針可完成中分辨度分辨，完全可以滿足臨床配型工作的需要。通過帶熒光標(biāo)記的引物將待測(cè)樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增后所要目的片斷帶上熒光標(biāo)記，帶有熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與芯片上的探針雜交，根據(jù)雜交信號(hào)強(qiáng)弱及位置確定樣品的基因型。本發(fā)明在玻片上固定了涵蓋5個(gè)等位基因的213條探針，完全可以完成HLA基因分型、骨髓移植器官移植的HLA配型、與HLA有密切關(guān)系的遺產(chǎn)性疾病的人群篩查。
本發(fā)明的目的是針對(duì)HLA-A基因設(shè)計(jì)了一套探針(見表1)，針對(duì)HLA-B基因設(shè)計(jì)了一套探針(見表2)，針對(duì)HLA-DQB基因設(shè)計(jì)了一套探針(見表3)，針對(duì)HLA-DQA基因設(shè)計(jì)了一套探針(見表4)，針對(duì)HLA-DRB基因設(shè)計(jì)了一套探針(見表5)。將這些探針固定在環(huán)氧處理的芯片片基上，制成完整的HLA-I、II類基因寡核苷酸芯片，并提供包含實(shí)驗(yàn)操作所必需的所有組分，組成了一套完整的試劑盒?？捎糜贖LA基因分型、骨髓移植器官移植的HLA配型、與HLA有密切關(guān)系的遺產(chǎn)性疾病的人群篩查。
優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明的實(shí)施實(shí)現(xiàn)了對(duì)HLA-A，B，DRB，DQA，DQB基因快速、準(zhǔn)確、高通量分型，可實(shí)現(xiàn)一張芯片多人份，滿足臨床器官移植的配型要求，適于臨床推廣，并可用于其他相關(guān)領(lǐng)域，具有重大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
實(shí)施方法下面結(jié)合
本發(fā)明的具體實(shí)施方法圖一芯片外觀1玻片表面處理環(huán)氧玻片處理普通玻片，洗液浸泡，清水沖洗，蒸餾水洗三遍，晾干備用。
2％3-glycidoxypropyltriethoxysilane乙醇溶液超聲2min混合，放入玻片1hr浸泡，95％乙醇洗兩次5min，自然晾干。
我們處理過的芯片在后續(xù)處理相同的情況下，與sigma的成品氨基片，醛基片及環(huán)氧玻片的最后雜交效果沒有區(qū)別，證明我們的處理方法可行。而且同樣條件下環(huán)氧玻片的雜交效果明顯優(yōu)于其他方法處理的玻片，至此我們建立了優(yōu)化環(huán)氧片基的制備方法，建立了優(yōu)化環(huán)氧片基用于基因芯片中核酸固定的條件。與其他處理片基方法相比，該種片基具有后處理簡單，交聯(lián)密度高，熒光背景低等優(yōu)點(diǎn)。
2引物設(shè)計(jì)及PCR條件HLA-A，HLA-B，HLA-DR，HLA-DQB，HLA-DQA選擇有意義外顯子片段，設(shè)計(jì)自己的引物。針對(duì)HLA-B座位的exon2和exon3區(qū)域分別設(shè)計(jì)上下游引物(下游為混合引物)，產(chǎn)物長度在900bp左右，序列如下正鏈5‘-G GGT CCC AGT TCT AAA GTC CCC ACG-3’，反鏈5’-CCATC CCC GGC GAC CTA TAG GAG ATG-3‘5‘-AGG CCA TCC CGG GCG ATC TAT-3’。標(biāo)記PCR50ul PCR擴(kuò)增體系，通過帶熒光的引物使PCR產(chǎn)物帶上Cy3標(biāo)記。根據(jù)gengeruner軟件及我們?cè)O(shè)計(jì)的引物，初步建立擴(kuò)增條件通過單一標(biāo)本，其他條件確定的梯度PCR，摸索退貨溫度及循環(huán)數(shù)，使PCR保持在指數(shù)增長期，最終選擇96℃5min；94℃22s、62℃50s、72℃30s，40個(gè)循環(huán)；72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色檢測(cè)。為了達(dá)到最好的PCR結(jié)果，預(yù)實(shí)驗(yàn)中上游引物我們選擇了0.1-0.5μmol/L之間的9個(gè)濃度(0.1μmol/L，0.15μmol/L，0.2μmol/L，0.25μmol/L，0.3μmol/L，0.35μmol/L，0.4μmol/L，0.45μmol/L，0.5μmol/L)，每個(gè)濃度與下游引物的比例分別為1∶1，1∶50，1∶100，共27組，以一個(gè)模板同同樣條件進(jìn)行PCR，以最終PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果的亮度來確定哪個(gè)PCR條件最佳，上游引物濃度為0.4μmol/L，上下游引物的比例分別為1∶50時(shí)條帶最亮，也就是PCR產(chǎn)物的量最大，這樣有利于我們后期的雜交，選擇該濃度作為最終應(yīng)用濃度。在HLA-A座位的exon2和exon3區(qū)域分別設(shè)計(jì)上下游引物，為雙下游和雙上游引物進(jìn)行嵌套氏PCR，產(chǎn)物長度在800bp左右，序列如下正鏈5’-GGCCTCTGT/CGGGGAGAAGCAA-3’，5’-GTCCCAATTGTCTCCCCTCCTT-3’，反鏈5’-AGCCGCGCCG/TGGAAGAGGGTCG-3’，5’-GGCCCCTGGTACCCGTGCGCTG-3’。擴(kuò)增條件為第一次PCR96℃3min；96℃25s、65℃45s、72℃30s，26個(gè)循環(huán)；96℃25s、55℃1min、72℃2min，4個(gè)循環(huán)；72℃5min。第二次PCR(Nested PCR)96℃3min；96℃30s、56℃ 30s、72℃30s，30個(gè)循環(huán)；96℃ 30s、56℃1min、72℃2min，4個(gè)循環(huán)；72℃5min。方法同前選擇最佳條件，建立引入熒光標(biāo)記的PCR體系。在HLA-DRB座位的exon2區(qū)域分別設(shè)計(jì)上下游引物，，產(chǎn)物長度在274bp左右，序列如下正鏈5’-CCCCACAGCACGTTTCTTG-3’，反鏈5’-CCGCTGCACTGTGAAGCTCT-3’。在HLA-DQB座位的exon2分別設(shè)計(jì)上下游引物，下游為混合引物，產(chǎn)物長度在260bp左右，序列如下正鏈5’-CA/CTGTGCTACTTCACCAAC/TGG-3’，反鏈5’-CTG/CTAGTTGTGTCTGCAC/TAC-3’。在HLA-DQA座位的exon2區(qū)域分別設(shè)計(jì)上下游引物，產(chǎn)物長度在240bp左右，序列如下正鏈5’-A/GC/TGGTGTAAACTTGTACCAGT-3’，反鏈5’TTGGTAGCAGCA/GGTAGAGTTG-3’。經(jīng)過摸索條件，將HLA-DRB、HLA-DQB及HLA-DQA的標(biāo)記PCR擴(kuò)增條件統(tǒng)一為95℃5min，94℃30s、57℃30s、72℃1min，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色檢測(cè)。方法同前選擇最佳條件，建立引入熒光標(biāo)記的PCR體系。用統(tǒng)一得HLA-DRB、HLA-DQB及HLA-DQA擴(kuò)增條件擴(kuò)增，不但能達(dá)到最好的擴(kuò)增效果，而且優(yōu)化了操作過程，更利于將此種檢測(cè)手段推向臨床。
3探針處理探針經(jīng)NH2-修飾后用于芯片點(diǎn)樣。通過NH2與環(huán)氧基的化學(xué)結(jié)合，探針固定在環(huán)氧片基上。將濃度為100umol/L的寡核苷酸探針與點(diǎn)樣緩沖液(0.2M NaOH)1∶1混合加在96孔板里，用點(diǎn)樣儀點(diǎn)成所需矩陣(見圖一)。從左往右，每五個(gè)點(diǎn)代表一條探針，共分五個(gè)矩陣，分別是HLA-A，HLA-B，HLA-DQA，HLA-DQB，HLA-DRB的五組探針。點(diǎn)樣后封閉過夜，待其自然干燥后，130℃烘烤30min、95℃水浴1min、封閉待其自然干燥、-20℃保存?zhèn)溆谩?br>
4雜交將10ul雜交buffer，18ulPCR產(chǎn)物與1ul鮭精DNA(鮭精DNA用來降低雜交背景)充分混合，將同一樣本的HLA-A，HLA-B，HLA-DQA，HLA-DQB，HLA-DRB的五種不同PCR產(chǎn)物用移液器加樣到相應(yīng)點(diǎn)樣區(qū)域，根據(jù)區(qū)域大小選擇合適大小的蓋玻片，蓋上蓋玻片。放入分子雜交儀雜交，雜交條件為40℃，1小時(shí)。
5洗滌取出芯片，5×洗脫液(20*SSC)洗脫，浸泡5分鐘；取出芯片，放入3×洗脫液中浸泡5分鐘ddH2O洗2次(每一步浸泡清洗后，都必須迅速離心)。將洗過的芯片置于室溫自然晾干，干燥后用ScanarryGX掃描。
6掃描通過分析軟件，將直觀的信號(hào)強(qiáng)弱轉(zhuǎn)化為信號(hào)比值，根據(jù)比值及具體位置上標(biāo)記的探針序列，即可確定樣本的基因型。在圖二中，最左邊是陽性定位點(diǎn)，用于分析軟件識(shí)別行列和定位。當(dāng)帶熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與芯片上的探針雜交時(shí)，探針如果與PCR產(chǎn)物完全互補(bǔ)，則掃描出的雜交信號(hào)強(qiáng)，顏色在黃白之間；如果與PCR產(chǎn)物完全不互補(bǔ)，掃描出的信號(hào)弱，顏色為藍(lán)或無色；如果與PCR產(chǎn)物部分互補(bǔ)，則掃描出的信號(hào)和顏色介于兩者之間。通過特定分析軟件，將直觀的顏色強(qiáng)弱轉(zhuǎn)化為信號(hào)的比值，可以方便的得出分型結(jié)果。HLA配型芯片設(shè)計(jì)了陽性對(duì)照和陰性對(duì)照而且每個(gè)探針都有5次重復(fù)，使系統(tǒng)的可靠性、穩(wěn)定性、科學(xué)性得到了有效保證。
圖二雜交結(jié)果顯示7結(jié)果芯片檢測(cè)結(jié)果用國際知名的one lambda公司的Micro SSPTM Class I&II Generic Tray，MicroSSPTM Allele Specfic DQB1，Micro SSPTM Allele Specfic DRB進(jìn)行平行對(duì)照試驗(yàn)?；蚍中徒Y(jié)果與用國際公認(rèn)的one lambda試劑盒所得出的基因分型結(jié)果基本一致。
對(duì)不一致的樣本進(jìn)行了測(cè)序?qū)φ?，測(cè)序結(jié)果與芯片分析結(jié)果完全一致。
1HLA配型芯片可分辨HLA-A抗原特異性21個(gè)，等位基因196個(gè)(見表6)。
表6基因芯片分辨HLA-A位點(diǎn)等位基因及其對(duì)應(yīng)的抗原特異性
注()內(nèi)為可分辨的等位基因數(shù)。
2HLA配型芯片可分辨HLA-B抗原特異性36個(gè)，等位基因402個(gè)(見表7)。
表7基因芯片分辨HLA-B位點(diǎn)等位基因及其對(duì)應(yīng)的抗原特異性
注()內(nèi)為可分辨的等位基因數(shù)。
3HLA配型芯片可分辨HLA-DRB抗原特異性19個(gè)，等位基因432個(gè)(見表8)。
表8基因芯片分辨HLA-DRB位點(diǎn)等位基因及其對(duì)應(yīng)的抗原特異性
注()內(nèi)為可分辨的等位基因數(shù)。
4HLA配型芯片可分辨HLA-DQB抗原特異性5個(gè)，等位基因51個(gè)(見表9)。
表9基因芯片分辨HLA-DQB位點(diǎn)等位基因及其對(duì)應(yīng)的抗原特異性
注()內(nèi)為可分辨的等位基因數(shù)。
5HLA配型芯片可分辨HLA-DQA抗原特異性6個(gè)，等位基因28個(gè)(見表10)。
表10基因芯片分辨HLA-DQA位點(diǎn)等位基因及其對(duì)應(yīng)的抗原特異性
注()內(nèi)為可分辨的等位基因數(shù)。
<注>目前市場(chǎng)上并沒有用于DQA分型的產(chǎn)品，但是隨著對(duì)DQA研究的深入，其在配型、遺傳性疾病及法醫(yī)學(xué)中個(gè)人識(shí)別、親子鑒定中的應(yīng)用日益明顯，我們將DQA也并入芯片，完成完整的系統(tǒng)的配型芯片。
序列表1<110>天津醫(yī)科大學(xué)<120>HLA芯片表面處理<160>213<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>1TATTTCTTCA CATCCGTGT 19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>2TATTTCTACA CCTCCGTGT 19<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>3TCTACACTTC CGTGTCCCG 19<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>4TACACCTCCA TGTCCCGGC 19<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>5CAGGAGAGGC CTGAGTATT 19<210>6<211>19
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>6GACGAGGAGA CAGGGAAAG 19<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>7GGGACCGGAA CACACGGAA 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>8GGGACCTGCA GACACGGAA 19<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>9GGAACACACG GAAAGTGAA 19<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>10GGGACGGGGA GACACGGAA 19<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>11ACACGGAATA TGAAGGCCC 19
<210>12<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>12GACACGGAAT GTGAAGGCC 19<210>13<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>13TCTGTGACTG GGCCT 15<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>14TGAAGGCCCA CTCACAGA 18<210>15<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>15GTCAGTCTGT GAGTGG 16<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>16TCACAGACTC ACCGAGTGG 19<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)
<400>17CACAGATTGA CCGAGTGGA19<210>18<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>18ACAGACTGAC CGAGTGGAC 19<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>19CCGAGCGAAC CTGGGGACC 19<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>20CCGAGTGGAC CTGGGGAC 18<210>21<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>21CCGAGAGAAC CTGCGGAT 18<210>22<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>22ACCGAGAGAG CCTGCGGAT 19<210>23<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>23CCGAGAGAAC CTGGGGACC 19<210>24<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>24GTGGACCTGG CGACCCTGC 19<210>25<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>25CACACCATCC AGATAATGT 19<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>26CACACCGTCC AGAGGATGT 19<210>27<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>27TACCGGCAGG ACGCCTACG 19<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>28TACCAGCAGGACGCTTACG 19<210>29<211>19
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>29TATGAACAGC ACGCCTACG 19<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>30TACCACCAGT ACGCCTACG 19<210>31<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>31TACCAGCAGG ACGCCTACG 19<210>32<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>32TCGCCTTGAA CGAGGACC 18<210>33<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>33TCGCCCTGAA AGAGGACC 18<210>34<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>34CCTGCGCTCT TGGACCGCG 19
<210>35<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>35TCAGATCACC CAGCGCAAG 19<210>36<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>36TCAGARCACC AAGCGCAAG 19<210>37<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>37TCAGACCACC AAGCACAAG 19<210>38<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>38GGAGGCGGCC CATGTGGCG 19<210>39<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>39GGAGACGGCC CATGAGGCG 19<210>40<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)
<400>40GGAGGCGGCC CATGAGGCG 19<210>41<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>41CCTCATGGGC CGCC 14<210>42<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>42AGGCGGCCCA TGCGGCGGA 19<210>43<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>43AGGCGGCCCG TCGGGCGGA 19<210>44<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>44AGGCGGCCCG TGTGGCGGA 19<210>45<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>45GGAGCAGCGG AGAGTCTAC 19<210>46<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>46GGCGGAGCAG TTGAGAGCC 19<210>47<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>47GGCGGAGCAG TGGAGAGCC 19<210>48<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>48GGCGGAGCAG CAGAGAGCC 19<210>49<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>49CCTGGATGGC ACGTGCGTG 19<210>50<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>50GCACGTGCGT GGAGTGGC 18<210>51<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>51GCCGGTGCGT GGACGGGC 18<210>52<211>19
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>52GGCGAGTGCG TGGAGTGGC 19<210>53<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>53GCACGTGCGT GGACGGGC 18<210>54<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>54GCCGGTGCGT GGAGTGGC 18<210>55<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>55GGCGAGTGCG TGGACGGGC 19<210>56<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>56TGCGTGGACG GGCTCCGCA 19<210>57<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>57TATTTCGACA CCGCCATGT 19
<210>58<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>58GGACGACACG CAGTTCGTG 19<210>59<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>59GGACGACACC CAGTTCGTG 19<210>60<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>60CCACGAGTCC GAGGATGGC 19<210>61<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>61CCGAGGATGG CGCCCCGGG 19<210>62<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>62GTCCGAGGACGGAGCCCCG 19<210>63<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)
<400>63CGAGTCCGAG AGAGGAGCC 19<210>64<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>64GTCCGAGGAA GGAGCCGCG 19<210>65<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>65GTCCGAGAGG GGAGCCGCG 19<210>66<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>66GCCGTGGGTG GAGCAGGA 18<210>67<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>67TATTGGGACG GGGAGACAC 19<210>68<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>68TATTGGGACC GGGAGACAC 19<210>69<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>69GGGACCGGAA CACACAGA 18<210>70<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>70GAACACACAG ATCTCCAAG 19<210>71<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>71AGATCTTCAA GACCAACAC 19<210>72<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>72AGATCTGCAA GACCAACAC 19<210>73<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>73GAACATGAAG GCCTCCGCG 19<210>74<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>74AGAAGTACAA GCGCCAGGC 19<210>75<211>19
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>75CACAGATCTA CAAGGCCCA 19<210>76<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>76AGATCTCCAA GACCAACAC 19<210>77<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>77CAGATCTACA AGACCAACA 19<210>78<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>78GCAAGGCCAA GGCACAGAC 19<210>79<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>79ACTTACCGAG AGAGCCTGC 19<210>80<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>80GACTTACCGA GAGAACCTG 19
<210>81<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>81AGAGAACCTG CGGATCGCG 19<210>82<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>82GAGAGAGCCT GCGGAACCT 19<210>83<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>83CCTGCGCACC GCGCTCCGC 19<210>84<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>84GCGGATCGCG CTCCGCTAC 19<210>85<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>85CGGAACCTGC GCGGCTAC 18<210>86<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)
<400>86CCTGCTCCGC TACTACAAC 19<210>87<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>87CTGCGCGGCT ACTACAACC 19<210>88<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>88ACACCCTCCA GAGCATGTA 19<210>89<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>89ACACTTGGCA GAGGATGTA 19<210>90<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>90CCTCCAGAAT ATGTATGGC 19<210>91<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>91GTCTCACACC ATCCAGAGG 19<210>92<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>92ACACCCTCCA GAGGATGTA 19<210>93<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>93TCGCAGCCAA ACATCCTCT 19<210>94<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>94CCAGAGGATG TACGGCTGC 19<210>95<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>95GGCTGCGACC TGGGGCCSG 19<210>96<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>96GACGGGCGCC TCCTCCGCG 19<210>97<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>97GCTTCCTCCG CGGGCATAA 19<210>98<211>19
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>98CGGGCATGAC CAGTACGCC 19<210>99<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>99GGGCATAACC AGTACGCC 18<210>100<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>100CGGGCATAAC CAGTTAGC 18<210>101<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>101CGGGCATGAC CAGTCCGCC 19<210>102<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>102GCGGGTACCA CCAGGACGC 19<210>103<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>103CGGGCATAAC CAGTTCGCC 19
<210>104<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>104CGGGTATGAC CAGGACGCC 19<210>105<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>105CGACGGCAAA GATTACATC 19<210>106<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>106ATCTCCCAGC GCAAGTTGG 19<210>107<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>107GTGAGGCGGA GCAGCGGAG 19<210>108<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>108GTGAGGCGGA GCAGCTGAG 19<210>109<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)
<400>109GTGAGGCGGA GCAGTGGAG 19<210>110<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>110TGTGGCGGAG CAGCTGAGA 19<210>111<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>111GGAGCAGGAC AGAGCCTAC 19<210>112<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>112GAGAACCTAC CTGGAGGGC19<210>113<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>113CTGGAGGGCG AGTGCGTGG 19<210>114<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>114GCCTGTGCGT GGAGTGGCT 19<210>115<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>115GGCACGTGCG TGGAGTGGC 19<210>116<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>116GCGTGGAGTC GCTCCGCAG 19<210>117<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>117TGCGTGGACG GGCTCCGCA 19<210>118<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>118CTCCGCAGAC ACCTGGAGA 19<210>119<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>119CTCCGCAGAT ACCTGGAGA 19<210>120<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>120AGGACAAGCT GGAGCGCGC 19<210>121<211>19
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>121AGGACACGCT GGAGCGCGC 19<210>122<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>122AGGAGACGCT GCAGCGCGC 19<210>123<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>123TGGCCAGTAC ACCCATGA 18<210>124<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>124TGGCCAGTTC ACCCATGA 18<210>125<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>125TGGGCAGTAC AGCCATGA 18<210>126<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>126GAGATGAGGA GTTCTACG 18
<210>127<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>127GAGATGAGCA GTTCTACG 18<210>128<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>128GAGACGAGCA GTTCTACG 18<210>129<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>129GAGACGAGGA GTTCTATG 18<210>130<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>130ACCTGGAGAT GAAGGAGA 18<210>131<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>131ACCTGGAGAA GAAGGAGA 18<210>132<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)
<400>132ACCTGGGGAG GAAGGAGA 18<210>133<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>133TGCCTGGCGG TGGCCTGA 18<210>134<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>134TGTCTGGAAG TTGCCTCT 18<210>135<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>135TGTCTGGCAG TTGCCTCT 18<210>136<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>136TGTCTGGTGT TTGCCTGT 18<210>137<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>137ATGGCTGTGG CAAAACAC 18<210>138<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>138ATCGCTGTGC TAAAACAT 18<210>139<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>139ATCGCTGTCC TAAAACAT 18<210>140<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>140ATCGCTGTGA CAAAACAC 18<210>141<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>141CTTGAACATC GTGATTAA 18<210>142<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>142CTTGAACATC CTGATTAA 18<210>143<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>143CTTGAACATC ATGATTAA 18<210>144<211>18
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>144CTTGAACAGT CTGATTAA 18<210>145<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>145GACCGAGCTC GTGCGGGG 18<210>146<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>146AACGGGACCG AGCGCGTG 18<210>147<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>147CGGGGTGTGA CCAGACAC 18<210>148<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>148CGTTATGTGA CCAGATAC 18<210>149<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>149CGTCTTGTGA CCAGATAC 18
<210>150<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>150CGTCTTGTAA CCAGACAC 18<210>151<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>151CGTCTTGTGA GCAGAAGC 18<210>152<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>152CGTCTTGTAA CCAGATAC 18<210>153<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>153GGGTGTGACC AGATACAT 18<210>154<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>154AGGAGTACGT GCGCTTCG 18<210>155<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)
<400>155AGGAGGACGT GCGCTTCG 18<210>156<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>156TAACCGAGAA GAGTACGT<210>157<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>157GGAGTACGCG CGCTTCGA 18<210>158<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>158GGAGTACGCA CGCTTCGA 18<210>159<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>159GACGTGGAGG TGTACCGG 18<210>160<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>160GGTGTACCGG GCAGTGAC 18<210>161<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>161GGTGTATCGG GCGGTGAC 18<210>162<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>162GTGTACCGGG CCGTGACG 18<210>163<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>163GCGGCCTGTT GCCGAGTA 18<210>164<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>164GCGGCCTAGC GCCGAGTA 18<210>165<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>165GCGGCCTGAC GCCGAGTA 18<210>166<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>166GCGGCCTGAT GCCGAGTA 18<210>167<211>18
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>167GGCTGCCTGC CGCCGAGT 18<210>168<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>168GGCCGCCTGA CGCCGAGT 18<210>169<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>169TGGGGCCGCC TGCCGCCG 18<210>170<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>170GCGGCTTGAC GCCGAGTA 18<210>171<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>171GCGGCCTGTC GCCGAGTA 18<210>172<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>172GCCTGACGCC GAGTA 15
<210>173<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>173TGGAGGGGGC CCGGGCGT 18<210>174<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>174GACCCGAGCG GAGTTGGA 18<210>175<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>175GAGGGGACCC GGGCGGAG 18<210>176<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>176CTGGAGAGGA CCCGGGCG 18<210>177<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>177GAAACGGGCG GCGGTGGA 18<210>178<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)
<400>178CTGGAGGAGG ACCGGGCG 18<210>179<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>179AGGACCCGGG CGGCGGTG 18<210>180<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>180ACCCGGGCGG AGTTGGAC 18<210>181<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>181GGTGGACAGG GTGTGCAG 18<210>182<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>182GGTGGACACC GTATGCAG 18<210>183<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>183TGGCAGCTTA AGTTTGAA 18<210>184<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>184AGCCTAAGA GGGAGTGTC 18<210>185<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>185GTACTCTACG TCTGAGTG 18<210>186<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>186GAGCAGGTTA AACATGAG 18<210>187<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>187GAGTACTCTA CGGGTGAG 18<210>188<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>188TGGCAGGGTA AGTATAAG 18<210>189<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>189GAAGCAGGAT AAGTTTGA 18<210>190<211>18
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>190GAGGAGGTTA AGTTTGAG 18<210>191<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>191CAGCAGGATA AGTATGAG 18<210>192<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>192GAGCTGCTTA AGTCTGAG 18<210>193<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>193GTTCCTGCAC AGAGACAT 18<210>194<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>194GCGGTACCTG GACAGATA 18<210>195<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>195GTTCCTGGAG AGACACTT 18
<210>196<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>196TTCCTGGAGA GATACTTCC 19<210>197<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>197ACCAGGAGGA GAACGTGC 18<210>198<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>198ATCACCAAGA GGAGTACG 18<210>199<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>199CCAGGAGGAG CTCCTGCG 18<210>200<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>200CAGGAGGAGT TCCTGCGC 18<210>201<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)
<400>201CAGGAGGAGT TCGTGCGC 18<210>202<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>202GCCTAGCGCC GAGTACTG 18<210>203<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>203GCCTGATGAG GAGTACTG 18<210>204<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>204GCCTGCTGCG GAGCACTG 18<210>205<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>205AAGGACCTCC TGGAAGA 17<210>206<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>206TCCTGGAGCA GAGGCGGG 18<210>207<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>207GGCCGGGTGG ACAACTAC 18<210>208<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>208ACCGCGGCCC GCTTCTGC 18<210>209<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>209ACATCCTGGA AGACGAGC 18<210>210<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>210TGGAAGACAG GCGGGCCG 18<210>211<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>211GAAGACAGGC GGGCCCTG 18<210>212<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>212CTGGAAGACA AGCGGGCCG 19<210>213<211>18
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>213AACTACGGGGCTGTGGAG 18
權(quán)利要求
1 一種HLA基因中分辨度分型方法，其特征在于根據(jù)中國人群HLA類常見的基因位點(diǎn)以及臨床應(yīng)用中對(duì)分型分辨度的實(shí)際需要，設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸中分辨度分型探針，制成基因分型芯片。采用帶熒光標(biāo)記的引物，用合適的PCR方法擴(kuò)增HLA類抗原上的多態(tài)性區(qū)域，產(chǎn)物與芯片上探針雜交。雜交結(jié)果經(jīng)熒光掃描并用特定軟件分析判斷陽性探針，以此確定樣品基因型，以及該方法的試劑組成和在臨床及科學(xué)研究中的應(yīng)用。芯片試劑盒組分如下檢測(cè)用片基、信號(hào)標(biāo)記系統(tǒng)、寡核苷酸探針、引物、洗滌液、點(diǎn)樣液。
2 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，片基上每孔固相化的探針為寡核苷酸探針，其序列依據(jù)第十三屆國際組織相容性工作會(huì)議報(bào)告及相關(guān)文獻(xiàn)，同時(shí)考慮遺傳的連鎖不平衡，及強(qiáng)脊炎，幼年型糖尿病等與HLA密切相關(guān)的遺傳病等因素，選擇了中國人群基因頻率較高的等位基因，根據(jù)HLA-A不同基因亞型的獨(dú)特序列，完成了探針的設(shè)計(jì)與篩選，最后設(shè)計(jì)了HLA探針制成基因分型芯片，其長度范圍在14-30個(gè)堿基，一般為18個(gè)堿基，其Tm值在滿足上述基因中等分辨度分型需要。
3 根據(jù)權(quán)利要求1所述的辦法，其各種引物是根據(jù)HLA基因序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)，在HLA多態(tài)性區(qū)域分別設(shè)計(jì)上下游引物，進(jìn)行PCR，引物長度在18-25個(gè)堿基之間，分別用于上述基因的擴(kuò)增。
4 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的辦法，用于信號(hào)顯示的信號(hào)分子標(biāo)記是針對(duì)HLA基因序列擴(kuò)增的引物。
5 根據(jù)權(quán)利要求書4，用于信號(hào)顯示的信號(hào)分子為CY3。
6 根據(jù)權(quán)利要求書1所述方法，可應(yīng)用于醫(yī)院或血站對(duì)人群HLA基因所有座位進(jìn)行分型，為組織配型和干細(xì)胞移植提供依據(jù)。也可應(yīng)用于科研單位、法醫(yī)領(lǐng)域?yàn)榉治雠cHLA相關(guān)的遺傳疾病及個(gè)人識(shí)別提供依據(jù)。
全文摘要
根據(jù)中國人群HLA－I、II類常見的基因位點(diǎn)以及臨床應(yīng)用中對(duì)分型分辨度的實(shí)際需要，設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸中分辨度分型探針，制成基因分型芯片。采用帶熒光標(biāo)記的引物，用合適的PCR方法擴(kuò)增HLA－I、II類抗原上的多態(tài)性區(qū)域，產(chǎn)物與芯片上探針雜交。雜交結(jié)果經(jīng)熒光掃描并用特定軟件分析判斷陽性探針，以此確定樣品基因型，以及該方法的試劑組成和在臨床及科學(xué)研究中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1995383SQ20061001301
公開日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2006年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月6日
發(fā)明者郭剛, 張瑞, 張鏡宇, 梁東春, 王寶利 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)