專利名稱：Hla－a中分辨度配型芯片的制備及應(yīng)用的制作方法
背景技術(shù)：
HLA抗原位于人的第6號(hào)染色體短臂的一個(gè)狹窄區(qū)域，是人體內(nèi)最復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，在免疫調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。HLA多態(tài)性檢測(cè)在醫(yī)學(xué)實(shí)踐和科研中具有十分重要意義，為器官、組織移植配型，疾病相關(guān)性研究，人類學(xué)及法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用等領(lǐng)域的發(fā)展提供了可靠的技術(shù)方法和有價(jià)值的資料。血清學(xué)方法是HLA-B抗原傳統(tǒng)的經(jīng)典分型方法，但是隨著對(duì)HLA研究的深入和對(duì)分型技術(shù)要求的不斷提高，以及越來越多的等位基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)和命名，血清學(xué)方法已經(jīng)無法獲得足夠的單特異性抗體，不能夠分辨出所有的特異性，而且標(biāo)準(zhǔn)抗血清的篩選技術(shù)復(fù)雜，難度大，人力物力消耗大，另外血清學(xué)方法之間存在較多，較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，使HLA-A類抗原亞型的分辨較為困難。
隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基因分型已成為HLA分型的主要方法。近年來對(duì)A類抗原的基因分型研究取得了較大進(jìn)展。其中PCR-SSP、PCR-SSO、PCR-SSCP(單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析)3種分型方法對(duì)抗原的分型均獲得成功.但這些方法也存在一些明顯的不足，如PCR-SSP方法，主要依賴于PCR技術(shù)，對(duì)某一基因個(gè)體進(jìn)行分型時(shí)往往要設(shè)計(jì)大量的引物，這將很難避免接下來的PCR過程中的污染問題而導(dǎo)致的假陽性，而且操作復(fù)雜，需要通過多次的電泳來判斷最后的結(jié)果，不適合大批量樣本的分型，使其在臨床上的應(yīng)用受到限制；PCR-SSCP法對(duì)分析小于400bpPCR擴(kuò)增產(chǎn)物十分有效，但此法僅能探知基因變異的存在，而無法確定變異的確切位置及內(nèi)容，一般僅用作HLA匹配程度的分析，而不用來進(jìn)行HLA的具體分型。
基因芯片是近年來興起的一項(xiàng)前沿生物技術(shù)，是對(duì)傳統(tǒng)生物技術(shù)如檢測(cè)、DNA雜交、分型和測(cè)序技術(shù)重大的飛躍和創(chuàng)新，是涉及到生物信息學(xué)，微電子技術(shù)，計(jì)算機(jī)科學(xué)，半導(dǎo)體技術(shù)等諸多自然學(xué)科的綜合性技術(shù)，在生命科學(xué)領(lǐng)域中顯出了巨大的潛能和誘人前景?；蛐酒侵笇⒃S多特定的寡核昔酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律的排列固定于支持物上，然后與待測(cè)的標(biāo)記過的樣本基因進(jìn)行特異性雜交，通過激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一個(gè)探針上的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，從而得出大量信息?；蛐酒哂懈叨燃珊筒⑿刑幚淼奶攸c(diǎn)，所需試劑和樣本量少，結(jié)果由計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)分析，是解決HLA眾多等位基因分型的有效方法。由于HLA個(gè)體遺傳學(xué)差異的本質(zhì)是在編碼其抗原產(chǎn)物的基因水平上，所以分析HLA基因型無疑是對(duì)HLA型別分析的最準(zhǔn)確的方法，其準(zhǔn)確性遠(yuǎn)高于血清與細(xì)胞學(xué)分型，并已逐漸取代了前兩者的位置，因此HLA抗原的DNA分型成為必然趨勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用寡核苷酸芯片分型方法，依據(jù)第十三屆國際組織相容性工作會(huì)議報(bào)告及相關(guān)文獻(xiàn)，同時(shí)考慮遺傳的連鎖不平衡，及強(qiáng)脊炎，幼年型糖尿病等與HLA密切相關(guān)的遺傳病等因素，選擇了中國人群基因頻率較高的等位基因，根據(jù)HLA-A不同基因亞型的獨(dú)特序列，完成了探針的設(shè)計(jì)與篩選，最后設(shè)計(jì)了HLA-A56條探針制成基因分型芯片，這些探針可完成中分辨度分辨，完全可以滿足臨床配型工作的需要。通過帶熒光標(biāo)記的引物將待測(cè)樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增后所要目的片斷帶上熒光標(biāo)記，帶有熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與芯片上的探針雜交，根據(jù)雜交信號(hào)強(qiáng)弱及位置確定樣品的基因型。本發(fā)明在玻片上固定探針，完全可以完成HLA基因分型、骨髓移植器官移植的HLA配型、與HLA有密切關(guān)系的遺產(chǎn)性疾病的人群篩查。
本發(fā)明的目的是針對(duì)HLA-A基因設(shè)計(jì)了一套探針(見表1)。將這些探針固定在環(huán)氧處理的芯片片基上，制成完整的HLA-A類基因寡核苷酸芯片，并提供包含實(shí)驗(yàn)操作所必需的所有組分，組成了一套完整的試劑盒?？捎糜贖LA基因分型、骨髓移植器官移植的HLA配型、與HLA有密切關(guān)系的遺產(chǎn)性疾病的人群篩查。
優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明的實(shí)施實(shí)現(xiàn)了對(duì)HLA-A基因快速、準(zhǔn)確、高通量分型，可實(shí)現(xiàn)一張芯片多人份，滿足臨床器官移植的配型要求，適于臨床推廣，并可用于其他相關(guān)領(lǐng)域，具有重大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
實(shí)施方法下面結(jié)合


本發(fā)明的具體實(shí)施方法圖1芯片外觀1玻片表面處理環(huán)氧玻片處理普通玻片，洗液浸泡，清水沖洗，蒸餾水洗三遍，晾干備用。
2％3-glycidoxypropyltriethoxysilane乙醇溶液超聲2min混合，放入玻片1hr浸泡，95％乙醇洗兩次5min，自然晾干。
2引物設(shè)計(jì)及PCR條件HLA-A選擇有意義外顯子片段，設(shè)計(jì)自己的引物。在HLA-A座位的exon2和exon3區(qū)域分別設(shè)計(jì)上下游引物，為雙下游和雙上游引物進(jìn)行嵌套氏PCR，產(chǎn)物長度在800bp左右，序列如下正鏈5’-GGCCTCTGT/CGGGGAGAAGCAA-3’，5’-GTCCCAATTGTCTCCCCTCCTT-3’，反鏈5’-AGCCGCGCCG/TGGAAGAGGGTCG-3’，5’-GGCCCCTGGTACCCGTGCGCTG-3’。擴(kuò)增條件為第一次PCR96℃3min；96℃25s、65℃45s、72℃30s，26個(gè)循環(huán)；96℃25s、55℃1min、72℃2min，4個(gè)循環(huán)；72℃5min。第二次PCR(Nested PCR)96℃3min；96℃30s、56℃30s、72℃ 30s，30個(gè)循環(huán)；96℃30s、56℃1min、72℃2min，4個(gè)循環(huán)；72℃5min。方法同前選擇最佳條件，建立引入熒光標(biāo)記的PCR體系。
3探針處理探針經(jīng)NH2-修飾后用于芯片點(diǎn)樣。通過NH2與環(huán)氧基的化學(xué)結(jié)合，探針固定在環(huán)氧片基上。將濃度為100umol/L的寡核苷酸探針與點(diǎn)樣緩沖液(0.2M NaOH)1∶1混合加在96孔板里，用點(diǎn)樣儀點(diǎn)成所需矩陣(見圖1)。從左往右，每五個(gè)點(diǎn)代表一條探針，共分三個(gè)矩陣，分別是陽性對(duì)照，HLA-A，陰性對(duì)照的三組探針。點(diǎn)樣后封閉過夜，待其自然干燥后，130℃烘烤30min、95℃水浴1min、封閉待其自然干燥、-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 4雜交將10ul雜交buffer，18ulPCR產(chǎn)物與1ul鮭精DNA(鮭精DNA用來降低雜交背景)充分混合，將同一樣本的陽性對(duì)照，HLA-A陰性對(duì)照的三種不同PCR產(chǎn)物用移液器加樣到相應(yīng)點(diǎn)樣區(qū)域，根據(jù)區(qū)域大小選擇合適大小的蓋玻片，蓋上蓋玻片。放入分子雜交儀雜交，雜交條件為40℃，1小時(shí)。
5洗滌取出芯片，5×洗脫液(20*SSC)洗脫，浸泡5分鐘；取出芯片，放入3×洗脫液中浸泡5分鐘ddH2O洗2次(每一步浸泡清洗后，都必須迅速離心)。將洗過的芯片置于室溫自然晾干，干燥后用ScanarryGX掃描。
6掃描通過分析軟件，將直觀的信號(hào)強(qiáng)弱轉(zhuǎn)化為信號(hào)比值，根據(jù)比值及具體位置上標(biāo)記的探針序列，即可確定樣本的基因型。在圖2中，最左邊是陽性定位點(diǎn)，最右邊是陰性定位點(diǎn)，用于分析軟件識(shí)別行列和定位。當(dāng)帶熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與芯片上的探針雜交時(shí)，探針如果與PCR產(chǎn)物完全互補(bǔ)，則掃描出的雜交信號(hào)強(qiáng)，顏色在黃白之間；如果與PCR產(chǎn)物完全不互補(bǔ)，掃描出的信號(hào)弱，顏色為藍(lán)或無色；如果與PCR產(chǎn)物部分互補(bǔ)，則掃描出的信號(hào)和顏色介于兩者之間。通過特定分析軟件，將直觀的顏色強(qiáng)弱轉(zhuǎn)化為信號(hào)的比值，可以方便的得出分型結(jié)果。HLA配型芯片設(shè)計(jì)了陽性對(duì)照和陰性對(duì)照而且每個(gè)探針都有5次重復(fù)，使系統(tǒng)的可靠性、穩(wěn)定性、科學(xué)性得到了有效保證。
圖2雜交結(jié)果顯示7結(jié)果芯片檢測(cè)結(jié)果用國際知名的one lambda公司的Micro SSPTM Class I&II Generic Tray進(jìn)行平行對(duì)照試驗(yàn)?；蚍中徒Y(jié)果與用國際公認(rèn)的one lambda試劑盒所得出的基因分型結(jié)果基本一致。
對(duì)不一致的樣本進(jìn)行了測(cè)序?qū)φ眨瑴y(cè)序結(jié)果與芯片分析結(jié)果完全一致。1HLA配型芯片可分辨HLA-A抗原特異性21個(gè)，等位基因196個(gè)(見表6)。
表6基因芯片分辨HLA-A位點(diǎn)等位基因及其對(duì)應(yīng)的抗原特異性

注()內(nèi)為可分辨的等位基因數(shù)。
序列表1<110>天津醫(yī)科大學(xué)<120>HLA-A中分辨度配型芯片的制備及應(yīng)用<160>56<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>1TATTTCTTCA CATCCGTGT 19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>2TATTTCTACA CCTCCGTGT 19<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>3TCTACACTTC CGTGTCCCG 19<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>4TACACCTCCA TGTCCCGGC 19<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>5CAGGAGAGGC CTGAGTATT 19<210>6
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>6GACGAGGAGA CAGGGAAAG 19<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>7GGGACCGGAA CACACGGAA 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>8GGGACCTGCA GACACGGAA 19<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>9GGAACACACG GAAAGTGAA 19<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>10GGGACGGGGA GACACGGAA 19<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>11
ACACGGAATA TGAAGGCCC 19<210>12<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>12GACACGGAAT GTGAAGGCC 19<210>13<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>13TCTGTGACTG GGCCT 15<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>14TGAAGGCCCA CTCACAGA 18<210>15<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>15GTCAGTCTGT GAGTGG 16<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>16TCACAGACTC ACCGAGTGG 19<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>17CACAGATTGA CCGAGTGGA 19<210>18<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>18ACAGACTGAC CGAGTGGAC 19<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>19CCGAGCGAAC CTGGGGACC 19<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>20CCGAGTGGAC CTGGGGAC 18<210>21<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>21CCGAGAGAAC CTGCGGAT 18<210>22<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>22ACCGAGAGAG CCTGCGGAT 19<210>23<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>23CCGAGAGAAC CTGGGGACC 19<210>24<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>24GTGGACCTGG CGACCCTGC 19<210>25<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>25CACACCATCC AGATAATGT 19<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>26CACACCGTCC AGAGGATGT 19<210>27<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>27TACCGGCAGG ACGCCTACG 19<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>28TACCAGCAGGACGCTTACG 19<210>29
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>29TATGAACAGC ACGCCTACG 19<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>30TACCACCAGT ACGCCTACG 19<210>31<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>31TACCAGCAGG ACGCCTACG 19<210>32<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>32TCGCCTTGAA CGAGGACC 18<210>33<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>33TCGCCCTGAA AGAGGACC 18<210>34<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>34
CCTGCGCTCT TGGACCGCG 19<210>35<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>35TCAGATCACC CAGCGCAAG 19<210>36<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>36TCAGARCACC AAGCGCAAG 19<210>37<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>37TCAGACCACC AAGCACAAG 19<210>38<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>38GGAGGCGGCC CATGTGGCG 19<210>39<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>39GGAGACGGCC CATGAGGCG 19<210>40<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>40GGAGGCGGCC CATGAGGCG 19<210>41<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>41CCTCATGGGC CGCC 14<210>42<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>42AGGCGGCCCA TGCGGCGGA 19<210>43<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>43AGGCGGCCCG TCGGGCGGA 19<210>44<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>44AGGCGGCCCG TGTGGCGGA 19<210>45<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>45GGAGCAGCGG AGAGTCTAC 19<210>46<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>46GGCGGAGCAG TTGAGAGCC 19<210>47<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>47GGCGGAGCAG TGGAGAGCC 19<210>48<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>48GGCGGAGCAG CAGAGAGCC 19<210>49<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>49CCTGGATGGC ACGTGCGTG 19<210>50<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>50GCACGTGCGT GGAGTGGC 18<210>51<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>51GCCGGTGCGT GGACGGGC 18<210>52
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>52GGCGAGTGCG TGGAGTGGC 19<210>53<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>53GCACGTGCGT GGACGGGC 18<210>54<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>54GCCGGTGCGT GGAGTGGC 18<210>55<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>55GGCGAGTGCG TGGACGGGC 19<210>56<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)及Tm值設(shè)計(jì)<400>56TGCGTGGACG GGCTCCGCA 19。
權(quán)利要求
1 一種HLA-A基因中分辨度分型方法，其特征在于根據(jù)中國人群HLA-A類常見的基因位點(diǎn)以及臨床應(yīng)用中對(duì)分型分辨度的實(shí)際需要，設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸中分辨度分型探針，制成基因分型芯片。采用帶熒光標(biāo)記的引物，用合適的PCR方法擴(kuò)增HLA-A類抗原上的多態(tài)性區(qū)域，產(chǎn)物與芯片上探針雜交。雜交結(jié)果經(jīng)熒光掃描并用特定軟件分析判斷陽性探針，以此確定樣品基因型，以及該方法的試劑組成和在臨床及科學(xué)研究中的應(yīng)用。芯片試劑盒組分如下檢測(cè)用片基、信號(hào)標(biāo)記系統(tǒng)、寡核苷酸探針、引物、洗滌液、點(diǎn)樣液。
2 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，片基上每孔固相化的探針為寡核苷酸探針，其序列依據(jù)第十三屆國際組織相容性工作會(huì)議報(bào)告及相關(guān)文獻(xiàn)，同時(shí)考慮遺傳的連鎖不平衡，及強(qiáng)脊炎，幼年型糖尿病等與HLA密切相關(guān)的遺傳病等因素，選擇了中國人群基因頻率較高的等位基因，根據(jù)HLA-A不同基因亞型的獨(dú)特序列，完成了探針的設(shè)計(jì)與篩選，最后設(shè)計(jì)了HLA-A的56條探針制成基因分型芯片，其長度范圍在14-30個(gè)堿基，一般為18個(gè)堿基，其Tm值在滿足上述基因中等分辨度分型需要。
3 根據(jù)權(quán)利要求1所述的辦法，其各種引物是根據(jù)HLA-A基因序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)，在HLA-A座位的exon2和exon3區(qū)域分別設(shè)計(jì)上下游引物，為雙下游和雙上游引物進(jìn)行嵌套氏PCR，引物長度在18-25個(gè)堿基之間，分別用于上述基因的擴(kuò)增。
4 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的辦法，用于信號(hào)顯示的信號(hào)分子標(biāo)記是針對(duì)HLA-A基因序列擴(kuò)增的引物。
5 根據(jù)權(quán)利要求書4，用于信號(hào)顯示的信號(hào)分子為CY3。
6 根據(jù)權(quán)利要求書1所述方法，可應(yīng)用于醫(yī)院或血站對(duì)人群HLA-A基因所有座位進(jìn)行分型，為組織配型和干細(xì)胞移植提供依據(jù)。也可應(yīng)用于科研單位、法醫(yī)領(lǐng)域?yàn)榉治雠cHLA-A相關(guān)的遺傳疾病及個(gè)人識(shí)別提供依據(jù)。
全文摘要
根據(jù)中國人群HLA－A類常見的基因位點(diǎn)以及臨床應(yīng)用中對(duì)分型分辨度的實(shí)際需要，設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸中分辨度分型探針，制成基因分型芯片。采用帶熒光標(biāo)記的引物，用合適的PCR方法擴(kuò)增HLA－A類抗原上的多態(tài)性區(qū)域，產(chǎn)物與芯片上探針雜交。雜交結(jié)果經(jīng)熒光掃描并用特定軟件分析判斷陽性探針，以此確定樣品基因型，以及該方法的試劑組成和在臨床及科學(xué)研究中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1995381SQ20061001301
公開日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2006年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月6日
發(fā)明者郭剛, 張瑞, 張鏡宇, 梁東春, 王寶利 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)