專(zhuān)利名稱：一種親和篩選菠蘿蛋白酶的親和配基的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬親和配基篩選方法領(lǐng)域，特別是涉及一種親和篩選菠蘿蛋白酶的親和配 基的方法。
背景技術(shù)：
目前，親和色譜技術(shù)已經(jīng)愈發(fā)成熟，也更多的運(yùn)用到生產(chǎn)實(shí)踐中去，但同時(shí)，也遇 到了相應(yīng)的瓶頸問(wèn)題。隨著生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和壯大，市場(chǎng)上對(duì)于高純度的生物大分 子的需求也是越來(lái)越大，然后落后的傳統(tǒng)色譜技術(shù)不能完全跟上市場(chǎng)的需求分離成本大， 純化時(shí)間長(zhǎng)，操作工序繁瑣等問(wèn)題一直困擾著色譜領(lǐng)域的科學(xué)家。如何找到一個(gè)合適的配基，能夠一對(duì)一單獨(dú)吸附一種生物大分子比如某種蛋白質(zhì) 或者酶，這是目前色譜領(lǐng)域亟待解決的一個(gè)難題。近十幾年來(lái)，由于化學(xué)上的組合化學(xué)技術(shù) 和生物學(xué)上的高通量生物篩選技術(shù)的蓬勃發(fā)展，仿生配基的研究也應(yīng)運(yùn)而生，研究者們?cè)O(shè) 法變被動(dòng)為主動(dòng)，從以前的盲目通過(guò)試誤法一個(gè)個(gè)篩選尋找目標(biāo)蛋白配基的方法逐漸向利 用高通量技術(shù)隨機(jī)尋找仿生配基來(lái)替代以前的三嗪染料配基和金屬螯合物配基。例如已經(jīng) 有研究者利用組合篩選方法，通過(guò)大量試驗(yàn)與淘洗，篩選出小分子仿生配基作為目標(biāo)蛋白 的親和配基。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種親和篩選菠蘿蛋白酶的親和配基的方法， 該方法簡(jiǎn)單，成本低廉，大腸桿菌與噬菌體的生物資源豐富；選出來(lái)的對(duì)菠蘿蛋白酶有親和 作用的7肽配基對(duì)菠蘿蛋白酶有較高的親和作用，并且能夠發(fā)現(xiàn)其一致序列，對(duì)于蛋白質(zhì) 組學(xué)中的蛋白質(zhì)互相作用提供豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本發(fā)明的一種親和篩選菠蘿蛋白酶的親和配基的方法，包括(1)生物淘洗(篩選)酶標(biāo)板包被100 300 μ 1菠蘿蛋白酶溶液，4°C輕微震 蕩，孵育12-24h，之后沖洗包被液，加滿封阻液，0 4°C靜置1 2h，完成后去除封阻液，用 TBST緩沖液迅速洗酶標(biāo)板2 10次；噬菌體7肽庫(kù)以5 10倍稀釋度加入所述酶標(biāo)板的 酶標(biāo)孔中，搖動(dòng)1 池，TBST緩沖液迅速洗酶標(biāo)板2 10次，用50 100 μ g/ml游離菠蘿 蛋白酶分子TBS洗脫液競(jìng)爭(zhēng)性洗脫吸附在固相酶標(biāo)板上的噬菌體，室溫?fù)u動(dòng)1 池，洗脫下 來(lái)的噬菌體作滴度測(cè)試；(2)噬菌體定向擴(kuò)增與富集挑取ER2738菌株培養(yǎng)于LB-Tet培養(yǎng)液中，25 37°C 180 200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日用LB培養(yǎng)液(不加抗生素I~et)l 50 1 100 稀釋并再次培養(yǎng)待用，步驟(1)噬菌體洗脫液定量加入至上述大腸桿菌菌液中，25 37°C， 60 IOOrpm感染1 2h，0 4°C，離心10 20min，去上清，菌體重懸至100 200ml LB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)8 14h，取培養(yǎng)后的菌液0 4°C，離心10 20min，取上清，加入體積比為 1 3 1 6的聚乙二醇和氯化鈉，震蕩混勻后冰置1 2h，在0 4°C，8000 15000rpm 離心10 20min去上清，沉淀物重懸于1 ^iil TBS溶液，再加體積比為1 3 1 6的聚乙二醇和氯化鈉溶液進(jìn)行再沉淀，冰置1 2h后，0 4°C，8000 12000rpm離心10 20min,棄上清，再快速離心移去殘余上清液，沉淀重懸于100 200 μ 1 TBS, 0. 01 0. 02%
NaR3中，得擴(kuò)增后的噬菌液；(3)滴度測(cè)試將上述擴(kuò)增后的噬菌液分別用TBS緩沖液稀釋10 IO3倍，噬菌 液加入到大腸桿菌菌液，快速震蕩混勻，室溫溫育2 5min，然后將感染的菌液注入40 50°C的頂層瓊脂試管中，快速震蕩混勻并立即傾注于25 37°C預(yù)溫的LB/IPTG/Xgal平板 上，均勻鋪開(kāi)，25 37°C倒置培養(yǎng)12-24h，之后計(jì)數(shù)平板；(4)單克隆噬菌體擴(kuò)增挑取上述LB-IPTG/Xgal平板上藍(lán)色噬菌斑10 20個(gè)分 別裝入上述1 2ml ER2738菌液中(0D A600 = 0 . 2 0. 5)，25 37°C 180 220rpm震蕩 培養(yǎng)4 5h，離心后取上清液即得單克隆擴(kuò)增液；(5)ELISA測(cè)試100 300 μ 1 ρΗ 8. 6菠蘿蛋白酶0 4°C包被12_24h，吸出包被 液，加滿封阻液，25 37°C靜置1 2h，完成后吸出封閉液，用TBST快速洗板2 10次，每 孔加入100 300 μ 1 TBST，每排第二孔加入10-20 μ 1的單克隆擴(kuò)增液，并稀釋至12孔， 25 37°C緩慢震蕩1 池，甩出單克隆擴(kuò)增液，TBST洗滌6 10次后，每孔加入100 300ul抗fd噬菌體生物素復(fù)合物(Anti-fd-Biotin)，輕輕混勻20 30sec，封板后25 37°C溫育1 池，TBST再次洗滌6 10次，每孔加入100 300ul抗生物素辣根過(guò)氧化物 酶復(fù)合物(EXTRAVIDIN-PEROXIDASE)，輕輕混勻20 30sec，封板，25 37°C同樣溫育1 2h, TBST再次洗板6 10次，每孔加入100 300ul鄰苯二胺(OPD)顯色液，輕輕混勻5 1086(；，25 371暗處顯色0.2 111，顯色后每孔加入100 30(^1 1 2M H2SO4終止液， 輕輕混勻20 30sec ；20 30min內(nèi)測(cè)OD值；(6)DNA測(cè)序挑取ELISA陽(yáng)性單克隆噬菌體以_96引物進(jìn)行測(cè)序，解讀7肽氨基 酸排列序列。所述步驟(1)中的酶標(biāo)板為96孔酶標(biāo)板。所述步驟O)中洗脫下來(lái)的噬菌液5 10μ 1用作滴度測(cè)試，待用的宿主大腸桿 菌ER2738的菌種濃度為OD A600 = 0 . 2 0. 5。所述步驟O)中的噬菌體擴(kuò)增計(jì)算的有效值為每個(gè)平板含有噬菌斑1 100個(gè)。所述步驟( 中的滴度測(cè)試中，噬菌液體積為5 10 μ 1，大腸桿菌ER2738的體積 為 100 ~ 200 μ Io所述步驟(4)中離心后取上清液后，再次短暫離心10 30sec，取60 80%上清 液，即為單克隆噬菌體擴(kuò)增液。所述步驟(5)中的ELISA測(cè)試用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在OD 492nm處測(cè)定。有益效果(1)本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉，大腸桿菌與噬菌體的生物資源豐富；(2)所篩選出來(lái)的對(duì)菠蘿蛋白酶有親和作用的7肽配基對(duì)菠蘿蛋白酶有較高的親 和作用，并且能夠發(fā)現(xiàn)其一致序列，對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)中的蛋白質(zhì)互相作用提供豐富的實(shí)驗(yàn) 數(shù)據(jù)；(3)對(duì)菠蘿蛋白酶高親和力的7肽配基更可用于對(duì)菠蘿蛋白的分離純化研究。


圖1是大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線與菌體含量圖；圖2是靶分子(菠蘿蛋白酶)濃度的選擇優(yōu)化；圖3是去污劑濃度的選擇優(yōu)化；圖4是噬菌體第四輪淘洗的噬菌斑；圖5四輪淘洗中噬菌體回收量及回收率；圖6是18個(gè)噬菌體單克隆陽(yáng)性克隆的ELISA檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定 的范圍。實(shí)施例1噬菌體宿主菌ER2738的培養(yǎng)與生長(zhǎng)曲線測(cè)定，具體步驟如下圖1所示在接種至液體培養(yǎng)基2.證后，大腸桿菌度過(guò)了遲緩期，進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在 大約培養(yǎng)3-3. 5h，OD A600達(dá)到0. 5，從圖示中我們發(fā)現(xiàn)大腸桿菌ER2738菌群開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù) 前期，OD值上升速度極快，這個(gè)培養(yǎng)時(shí)間3. 5h和大多數(shù)研究者經(jīng)驗(yàn)所得所需要花費(fèi)的時(shí)間 是一致的。說(shuō)明一般挑取單菌落液體培養(yǎng)或者稀釋后一般3. 5h進(jìn)行噬菌體感染是最適合 的。實(shí)施例2M13絲狀噬菌體的擴(kuò)增，具體步驟如下(1)挑取ER2738菌株培養(yǎng)于LB-Tet培養(yǎng)液中，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日 1 100稀釋的培養(yǎng)液使用LB培養(yǎng)液(不加抗生素Tet)搖床至OD A600 = 0 . 5待用。(2)噬菌體洗脫液定量加入至LB菌液中，37°C，85rpm感染lh。4°C，5000rpm離心 15min。去上清，菌體重懸至200ml LB培養(yǎng)液(注此處LB培養(yǎng)液不加抗生素，增加噬菌體 感染力和活力)中培養(yǎng)12h。(3)次日取菌液4°C，5000rpm離心15min，取上清，轉(zhuǎn)入新鮮離心管后加入1/5 (V/ V)PEG/NaCl，震蕩混勻后冰置lh。4°C，12000rpm離心20min去上清，沉淀物重懸于Iml TBS 溶液，轉(zhuǎn)入微量離心管，再加l/5(V/V)PEG/NaCl溶液進(jìn)行再沉淀，冰置Ih后，4°C，12000rpm 離心20min，棄上清，再快速離心移去殘余上清液。沉淀重懸于200 μ 1 TBS，0. 02% NaN3中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1顯示第一種擴(kuò)增方法是由于NEB公司設(shè)計(jì)的擴(kuò)增方法時(shí)間段，只 有4.紐，但是它大大降低了序列偏嗜現(xiàn)象。第二種方法是本發(fā)明自行設(shè)計(jì)，在保證大腸桿菌 ER2738在1 內(nèi)完成生長(zhǎng)曲線的期限內(nèi)，立刻停止擴(kuò)增，這樣也能降低序列偏嗜現(xiàn)象，但同時(shí) 保證噬菌體增殖完成一定的數(shù)量級(jí)。由于感染時(shí)間長(zhǎng)于方法1，因此得到了更好的擴(kuò)增效果。實(shí)施例3對(duì)生物淘洗方法條件優(yōu)化，具體步驟如下(1)靶分子濃度選擇優(yōu)化設(shè)計(jì)同時(shí)進(jìn)行四個(gè)平行淘洗過(guò)程，以BSA作為靶分子溶液，溫育酶標(biāo)板的濃度分別為100μ g/ml,80y g/ml,50y g/ml,20y g/ml/0隨機(jī)挑取每個(gè)淘洗篩選出來(lái)的噬菌體10 個(gè)，對(duì)其進(jìn)行ELISA檢測(cè)，如圖2所示整體上可以發(fā)現(xiàn)濃度最低的20 μ g/ml的靶分子濃度 所篩選的OD值普遍偏高，預(yù)示著低濃度靶分子溶液包被的酶標(biāo)板所篩選出來(lái)的配基親和 性相對(duì)來(lái)說(shuō)更高。因此設(shè)計(jì)在淘洗菠蘿蛋白酶的四輪淘洗過(guò)程中，逐級(jí)降低菠蘿蛋白酶溶液的濃 度，從 100 μ g/ml，80 μ g/ml，50 μ g/ml，20 μ g/ml 依次進(jìn)行篩選。(2)去污劑濃度選擇優(yōu)化在淘洗過(guò)程中去污劑洗滌清洗酶標(biāo)孔(本實(shí)驗(yàn)為T(mén)BS-Tween-20)，只有逐漸增強(qiáng) 去污劑的濃度，又不超出其限度，才能篩選出理想的配基來(lái)。結(jié)果如圖3所示去污劑濃 度達(dá)到1. 0 %時(shí)候，洗脫力太強(qiáng)，導(dǎo)致篩選結(jié)果不理想，濃度0. 05 %的洗脫力不夠，導(dǎo)致不 能屏蔽非特異性吸附帶來(lái)的假陽(yáng)性結(jié)果。因此本實(shí)驗(yàn)選擇不同濃度的去污劑濃度0. 5%, 0.2%,0. 分別對(duì)應(yīng)第三/四，第二和第一輪。(3)洗脫方法選擇優(yōu)化—般洗脫法分為非特異性洗脫法和特異性競(jìng)爭(zhēng)性洗脫法兩種。本實(shí)驗(yàn)采用非特異 性洗脫法0.2M Glycine-HCl (pH 2. 2), lmg/ml BSA作為洗脫劑，以及特異性洗脫劑100 μ g/ ml游離菠蘿蛋白酶分子TBS洗脫劑，對(duì)每次生物淘洗后的酶標(biāo)孔進(jìn)行洗脫，結(jié)果如表2所 示洗脫的效果幾乎持平，但是考慮到酸性洗脫法的低PH值會(huì)使噬菌體的感染系數(shù)降低， 通常洗脫時(shí)間不能超過(guò)lOmin，否則噬菌體將失去感染能力。另外，短時(shí)間的洗脫，只能篩選 到親和力底下，解離常數(shù)小k的短肽配基。因此，綜合考慮下，本文選取特異性洗脫劑對(duì)以 下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行洗脫。實(shí)施例4生物淘洗對(duì)菠蘿蛋白酶的親和7肽配基，具體步驟如下(1)噬菌體7肽庫(kù)篩選96孔酶標(biāo)板包被300 μ 1將100 μ g/ml的菠蘿蛋白酶精酶 (XlMNaHCO3溶液(pH 8. 6)，旋轉(zhuǎn)酶標(biāo)板濕潤(rùn)整個(gè)板孔。將酶標(biāo)板置于增濕容器中4°C輕微 震蕩，孵育過(guò)夜。挑ER2738單克隆菌種于20ml LB-Tet液體培養(yǎng)液Q50ml錐形瓶，以增加 氧氣量)中，37°C，200rpm震蕩培養(yǎng)。(2)次日沖洗包被液，加滿封阻液，4°C靜置lh。完成后去封阻液，用TBST(0. 1% [ν/ν]第一輪，0. 2% [ν/ν]第二輪，0. 5% [ν/ν]第三四輪)緩沖液迅速洗板6次。100 μ 1 TBST緩沖液稀釋IO12數(shù)量級(jí)數(shù)的噬菌體量，以10倍稀釋度一直稀釋到酶標(biāo)板每排的11個(gè) 孔(每排第一個(gè)孔為空白液)，室溫溫和搖動(dòng)lh。傾倒除去未結(jié)合噬菌體后，TBST緩沖液 迅速洗板10次。(3)洗脫為特異性洗脫，即100 μ g/ml游離菠蘿蛋白酶分子TBS洗脫液競(jìng)爭(zhēng)性洗脫 吸附在固相酶標(biāo)板上的噬菌體。室溫溫和搖動(dòng)lh。洗脫下來(lái)的噬菌體可作滴度測(cè)試。結(jié)果如圖4和圖5顯示圖4是四輪篩選第四輪中對(duì)菠蘿蛋白酶有親和作用的 噬菌體單克隆擴(kuò)增后的滴度測(cè)試，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，由于文庫(kù)噬菌體源于常規(guī)克隆載體 M13mpl9，其含有IacZa基因，當(dāng)鋪在含IPTG和Χ-gal的平板上時(shí)，噬菌斑將呈現(xiàn)藍(lán)色，說(shuō) 明實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。圖5則是四輪淘洗過(guò)程中噬菌體回收量和回收率的圖譜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示此法篩 選克服了傳統(tǒng)篩選流程富集程度不高的缺點(diǎn)第二輪的噬菌體回收率比第一輪高出13. 77倍，而第三輪的回收率比之第一輪高出可以發(fā)現(xiàn)153. 06倍，第四輪的回收率有所降低，說(shuō) 明了富集已經(jīng)到了臨界點(diǎn)。因此本實(shí)驗(yàn)共選擇4輪淘洗過(guò)程，選擇陽(yáng)性單克隆進(jìn)行ELISA 測(cè)試。實(shí)施例5隨機(jī)挑選第四輪淘洗中的噬菌體單克隆18個(gè)進(jìn)行ELISA，具體步驟如下(1)首先將目標(biāo)蛋白菠蘿蛋白酶包被在酶標(biāo)板的微孔固相上；(2)混合第四輪中隨機(jī)挑取的18個(gè)單克隆噬菌體，使單克隆噬菌體展示的7肽與 目標(biāo)蛋白進(jìn)行親和作用；(3)第三步加入Anti-fd-Biotin (SIGMA)，此類(lèi)抗體能夠?qū)d和M13噬菌體有抗 原反應(yīng)，并且鏈接生物素；(4)第四步加入EXTRAVIDIN-PEROXIDASE(SIGMA)，此二抗的抗生物素蛋白能夠特 異性的與生物素結(jié)合，酶標(biāo)抗體上的酶是辣根過(guò)氧化物酶(HRP)；(5)最后加入HRP底物OPD溶液。在492nm波長(zhǎng)處測(cè)定底物含量的變化。結(jié)果如圖6所示以上的18個(gè)單克隆噬菌體中其中姊，5#，6#在49211111處有強(qiáng)烈 吸收峰。其中6#的OD值達(dá)到了 1. 9，證明底物OPD被大量HRP所催化，也就意味著這三個(gè) 單克隆所展示的7肽對(duì)菠蘿蛋白酶的親和作用較高?？梢詫?duì)2#’ 5#，6#，10#，14#，18#6個(gè)陽(yáng) 性克隆進(jìn)行DNA/氨基酸測(cè)序。實(shí)施例66個(gè)陽(yáng)性克隆的DNA測(cè)序挑取ELISA6個(gè)陽(yáng)性單克隆噬菌體以_96引物進(jìn)行測(cè)序，解讀7肽氨基酸排列序 列。結(jié)果如表3所示6個(gè)陽(yáng)性克隆的氨基酸序列有共同的一致序列Ile-XXX-Ser-Pr0-XX X-XXX-XXX(LXSPXXX)。表1不同擴(kuò)增方法的選擇優(yōu)化
擴(kuò)增方法噬菌體投入量(cfu)噬菌體洗脫量(Cfu)擴(kuò)增倍數(shù)
1IO36.7χ108-IO52IO35.3χ10η-IO9
表2洗脫方法的選擇優(yōu)化洗脫方法噬菌體投入量(Cfu)噬菌體洗脫量(cfu)
1IO33552IO3478表3菠蘿蛋白酶高親和性的7肽氨基酸序列展示
8
權(quán)利要求
1.一種親和篩選菠蘿蛋白酶的親和配基的方法，包括(1)酶標(biāo)板包被100 300μ1菠蘿蛋白酶溶液，4°C輕微震蕩，孵育1214h，之后沖洗 包被液，加滿封阻液，0 4°C靜置1 2h，完成后去除封阻液，用TBST緩沖液迅速洗酶標(biāo) 板2 10次；噬菌體7肽庫(kù)以5 10倍稀釋度加入上述酶標(biāo)板的酶標(biāo)孔中，搖動(dòng)1 2h， TBST緩沖液迅速洗酶標(biāo)板2 10次，用50 100 μ g/ml游離菠蘿蛋白酶分子TBS洗脫液 競(jìng)爭(zhēng)性洗脫吸附在固相酶標(biāo)板上的噬菌體，室溫?fù)u動(dòng)1 2h，洗脫下來(lái)的噬菌體作滴度測(cè) 試；(2)挑取ER2738菌株培養(yǎng)于LB-Tet培養(yǎng)液中，25 37°C180 200rpm振蕩培養(yǎng) 12-24h，之后用不加抗生素Tet的LB培養(yǎng)液1 50 1 100稀釋并再次培養(yǎng)待用，步驟 (1)噬菌體洗脫液定量加入至上述大腸桿菌菌液中，25 37°C，60 IOOrpm感染1 2h， 0 4°C，離心10 20min，去上清，菌體重懸至100 200ml LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)8 14h，取 培養(yǎng)后的菌液0 4°C，離心10 20min，取上清，加入體積比為1 3 1 6的聚乙二 醇和氯化鈉，震蕩混勻后冰置1 2h，在0 4°C，8000 15000rpm離心10 20min去上 清，沉淀物重懸于1 anl TBS溶液，再加體積比為1 3 1 6的聚乙二醇和氯化鈉溶 液進(jìn)行再沉淀，冰置1 2h后，0 4°C，8000 12000rpm離心10 20min，棄上清，再快 速離心移去殘余上清液，沉淀重懸于100 200 μ 1 TBS,0. 01 0. 02% NaN3中，得擴(kuò)增后 的噬菌液；(3)將上述擴(kuò)增后的噬菌液分別用TBS緩沖液稀釋10 IO3倍，噬菌液加入到大腸桿菌 菌液，快速震蕩混勻，室溫溫育2 5min，然后將感染的菌液注入40 50°C的頂層瓊脂試 管中，快速震蕩混勻并立即傾注于25 37°C預(yù)溫的LB/IPTG/Xgal平板上，均勻鋪開(kāi)，25 37°C倒置培養(yǎng)12-24h，之后計(jì)數(shù)平板；(4)挑取上述LB-IPTG/Xgal平板上藍(lán)色噬菌斑10 20個(gè)分別裝入上述1 2ml ER2738菌液中，25 37°C 180 220rpm震蕩培養(yǎng)4 5h，離心后取上清液即得單克隆擴(kuò) 增液；(5)100 300 μ 1 pH 8. 6菠蘿蛋白酶0 4°C包被12_Mh，吸出包被液，加滿封阻液， 25 37°C靜置1 2h，完成后吸出封閉液，用TBST快速洗板2 10次，每孔加入100 300 μ 1TBST,每排第二孔加入10-20 μ 1的單克隆擴(kuò)增液，并稀釋至12孔，25 37°C緩慢 震蕩1 濁，甩出單克隆擴(kuò)增液，TBST洗滌6 10次后，每孔加入100 300ul抗fd噬菌 體生物素復(fù)合物，輕輕混勻20 30sec，封板后25 37°C溫育1 2h，TBST再次洗滌6 10次，每孔加入100 300ul抗生物素辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物，輕輕混勻20 30sec，封板， 25 37°C同樣溫育1 2h，TBST再次洗板6 10次，每孔加入100 300ul鄰苯二胺顯 色液，輕輕混勻5 10sec，25 37°C暗處顯色0. 2 lh，顯色后每孔加入100 300 μ 1 1 2MH2S04終止液，輕輕混勻20 30sec ；20 30min內(nèi)測(cè)OD值；(6)挑取步驟(5)中的ELISA陽(yáng)性單克隆噬菌體以-96引物進(jìn)行測(cè)序，解讀7肽氨基酸 排列序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種親和篩選菠蘿蛋白酶的親和配基的方法，其特征在于 所述步驟(1)中的酶標(biāo)板為96孔酶標(biāo)板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種親和篩選菠蘿蛋白酶的親和配基的方法，其特征在于 所述步驟O)中洗脫下來(lái)的噬菌液5 10 μ 1用作滴度測(cè)試，待用的宿主大腸桿菌ER2738的菌種濃度為OD A600 = 0 . 2 0. 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種親和篩選菠蘿蛋白酶的親和配基的方法，其特征在于 所述步驟(2)中的噬菌體擴(kuò)增計(jì)算的有效值為每個(gè)平板含有噬菌斑1 100個(gè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種親和篩選菠蘿蛋白酶的親和配基的方法，其特征在于 所述步驟(3)中的滴度測(cè)試中，噬菌液體積為5 10 μ 1，大腸桿菌ER2738的體積為100 200 μ 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種親和篩選菠蘿蛋白酶的親和配基的方法，其特征在于 所述步驟(4)中離心后取上清液，再次短暫離心10 30sec，取60 80%上清液，即為單 克隆噬菌體擴(kuò)增液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種親和篩選菠蘿蛋白酶的親和配基的方法，其特征在于 所述步驟(5)中的ELISA測(cè)試用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在OD 492nm處測(cè)定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種親和篩選菠蘿蛋白酶的親和配基的方法，包括(1)生物淘洗；(2)噬菌體定向擴(kuò)增與富集(3)滴度測(cè)試；(4)單克隆噬菌體擴(kuò)增；(5)ELISA測(cè)試；(6)DNA測(cè)序，Ile-XXX-Ser-Pro-XXX-XXX-XXX(LXSPXXX)。本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉，大腸桿菌與噬菌體的生物資源豐富；選出來(lái)的對(duì)菠蘿蛋白酶有親和作用的7肽配基對(duì)菠蘿蛋白酶有較高的親和作用，并且能夠發(fā)現(xiàn)其一致序列，對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)中的蛋白質(zhì)互相作用提供豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；菠蘿蛋白酶高親和力的7肽配基更可用于對(duì)菠蘿蛋白的分離純化研究。
文檔編號(hào)C12Q1/37GK102121043SQ20101059161
公開(kāi)日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者朱利民, 汪雯, 聶華麗, 陳天翔 申請(qǐng)人:東華大學(xué)