產(chǎn)低溫纖維素酶的Sphingobacterium kitahiroshimense S-4的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)低溫纖維素酶的細菌，本發(fā)明屬于生物工程領域，本發(fā)明菌種為Sphingobacterium kitahiroshimense S?4(保藏號CGMCC 12301)，是采用篩選培養(yǎng)基從甘肅省蘭州市甘肅農(nóng)業(yè)大學校園草坪草地土壤中篩選而得。所述菌株經(jīng)搖瓶液體發(fā)酵可得纖維素酶，發(fā)酵48h時酶活可達87.2 U/mL，所述的纖維素酶的最適作用溫度為25℃。CGMCC No.1230120160321
【專利說明】
產(chǎn)低溫纖維素酶的5口11丨1^〇030^61^1^1<丨13|1丨「〇8|1丨11161186 3 -4
技術領域
[0001 ] 本發(fā)明屬生物工程技術領域，涉及一種產(chǎn)低溫纖維素酶的Sphingobacterium kitahiroshimense S_4〇
【背景技術】
[0002] 纖維素是植物纖維的主要成分，也是自然界中豐富的可再生資源。纖維素是多個 葡萄糖殘基以β-l，4-糖苷鍵連接而成的多聚化合物，其基本重復單位為纖維二糖，是自然 界最豐富的生物聚合物。據(jù)報道，全球每年通過光合作用產(chǎn)生的植物物質(zhì)高達15.5億噸，其 中89%尚未被利用。
[0003] 纖維素利用最大難題是由于纖維素本身的結(jié)構特點而不容易被降解，許多研究表 明利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶來分解和轉(zhuǎn)化纖維素是纖維素利用的一條有效途徑。纖維素 酶是指能降解纖維素分子生成纖維二糖和葡萄糖等小分子物質(zhì)的一組酶的總稱。目前廣泛 應用于紡織、食品、可再生資源利用等領域的纖維素酶幾乎都是中溫纖維素酶(最適作用溫 度45° C~65° C)。低溫纖維素酶主要指最適作用溫度為15° C~35° C的酶，與中溫纖維素酶 相比，低溫纖維素酶在自然條件下具有高酶活力及高催化效率，可大大縮短處理過程的時 間，節(jié)省加熱或冷卻費用，并且經(jīng)過溫和的熱處理即可使其失活，不會影響產(chǎn)品品質(zhì)。因此， 其應用對于減少工藝流程、降低生產(chǎn)成本以及節(jié)能方面有相當大的優(yōu)勢。
[0004] 本發(fā)明所涉及的Sphingobacterium kitahiroshimense S-4菌株，具有營養(yǎng)要求 低、繁殖快、發(fā)酵產(chǎn)物易于提取分離、發(fā)酵周期短、產(chǎn)酶能力強等優(yōu)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種能夠生產(chǎn)低溫纖維素酶的Sphingobacterium kitahiroshimense S-4新菌株。
[0006] 本發(fā)明中的Sphingobacterium kitahiroshimense S-4菌株從甘肅省蘭州市甘肅 農(nóng)業(yè)大學校園草坪草地土壤中篩選得到，分類命名為Sphingobacterium kitahiroshimense S-4，于2016年3月21日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心（CGMCC)保藏，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏號CGMCC N0.12301。
[0007] Sphingobacterium kitahiroshimense S-4的篩選方法是采集甘肅省蘭州市甘肅 農(nóng)業(yè)大學校園草坪草地土壤樣品，將樣品過篩，除去石礫、草等雜物后，稱取lg于99mL 無菌生理鹽水中稀釋到10-3~10-7,吸取lmL涂布于纖維素分離培養(yǎng)基上，25°C恒溫培 養(yǎng)，選擇透明圈大的菌落進行進一步劃線分離，直到分離得到純菌種為止。將透明圈大的菌 株進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，通過比較低溫纖維素酶活性的大小得到所需菌株。
[0008] 纖維素分離培養(yǎng)基組成:羧甲基纖維素鈉5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉lg/L，瓊 月旨 20g/L，pH 7.0。
[0009]本發(fā)明的Sphingobacterium kitahiroshimense S-4具有以下生物學特性： 1.形態(tài)特征:菌株S-4革蘭氏染色結(jié)果為陽性，桿狀，單個排列，無芽孢。
[0010] 2.培養(yǎng)特征：菌株S-4在纖維素分離培養(yǎng)基平板上37 °C恒溫培養(yǎng)48h，菌落不規(guī) 貝ij，淡黃色，邊緣不整齊。
[0011] 3.遺傳學特征(菌株16srRN序列）：本發(fā)明測了菌株S-4的16srRNA序列，如下， 全長為1376bp。
[0012] ACATGCTTTAGGTACCCCCAACTTTCATGGCTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGTCA TTGCTGATACGCGATTACTAGCGAATCCAACTTCATGAGGTCGAGTTGCAGACCTCAATCCGAACTGTGAACGGCTT TTAGAGATTAGCATCATATTGCTATGTAGCTGCCCGCTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCCGGACGTAA GGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCACAGCTTACGCTGGCAGTCTGTTTAGAGTCCCCATCATTAC GTGCTGGCAACTAAACATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACACCTCACGGCACGAGCTGACGACAGC CATGCAGCACCTAGTTTCGTGTCCCGAAGGACTGATCCGTCTCTGGATCATTCACTAACTTTCAAGCCCGGGTAAGG TTCCTCGCGTATCATCGAATTAAACCACATGCTCCTCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAATC TTGCGACCGTACTCCCCAGGTGGATAACTTAACGCTTTCGCTTGGACGCTTACTGTGTATCGCAAACATCGAGTTAT CATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGATCCCCACGCTTTCGTGCATCAGCGTCAATACTA ACTTAGTGAGCTGCCTTCGCAATCGGAGTTCTAAGACATATCTATGCATTTCACCGCTACTTGTCTTATTCCGCCCA CTTCAAATAGATTCAAGTCCTACAGTATCAAAGGCACTGCGACAGTTAAGCTGCCGTCTTTCACCACTGACTTATAG GACCGCCTACGCACCCTTTAAACCCAATAAATCCGGATAACGCTTGGATCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACG GAGTTAGCCGATCCTTATTCTTCAGGTACATTCAGCTTCCTACACGTAGAAAGGTTTATTCCCTGACAAAAGCAGTT TACAACCCATAGGGCAGTCATCCTGCACGCGGCATGGCTGGTTCAGAGTTGCCTCCATTGACCAATATTCCTTACTG CTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGTCCGTGTCTCAGTACCAGTGTGGGGGATTCTCCTCTCAGAGCCCCTAGACATCGTA GCCTTGGTGAGCCGTTACCTCTCCAACTAGCTAATGTCACGCGAGCCCATCCATATCCTATAAATATTTGATCAAAA ACCGATGCCGGTAAATGATGTTATGCGGTGTTAATCTCTCTTTCGAGAGGCTATCCCCCTGATATGGGTAGGTTGCT CACGCGTTACGCACCCGTGCGCCACTCTCATCAGTTCGTAGCAAGCTACTCCCTGAATCCCGTCCGA 4 .產(chǎn)酶性能：在250mL三角瓶中裝100mL種子培養(yǎng)基，接種一環(huán)Sphingobacterium kitahiroshimense S-4，25°C、搖床轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h得到種子液;取 6mL種子液轉(zhuǎn)接于裝有100mL液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，25 °C搖床培養(yǎng)、搖床轉(zhuǎn) 速為180r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，在4°C、8000r/min離心10min，得到的上清液為低溫纖維 素酶液，45h時酶活最高，達到87.2U/mL。
[0013]種子培養(yǎng)基組成:蛋白胨5g/L，酵母浸粉lg/L，pH 7.0。
[0014] 液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成:酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，CMC-Na 5g/ L，pH 7·0〇
[0015]酶活力單位的定義：以每lmL酶液每分鐘水解1% CMC-Na溶液產(chǎn)生lyg還原糖的酶 量定義為一個CMC酶活力單位。
[0016] 酶活測定方法：采用DNS法，以1 mL 1.0%CMC溶液為底物，加入lmL酶液，搖勻后于 25°C反應40min，取出后迅速加入1.5mL DNS試劑，沸水浴加熱5min終止反應，然后放入涼水 冷卻至室溫，加入1.5mL的檸檬酸緩沖溶液，在540nm測0D值，計算酶活。
[0017] 酶活=MXnX1000/VXt 式中Μ為利用吸光度在標準曲線上查得的葡萄糖量(mg); η為酶液的稀釋倍數(shù)； V為酶液體積(mL); t為時間(min)。
[0018] 葡萄糖標準曲線的繪制：采用標準葡萄糖配置一系列不同濃度的葡萄糖溶液，如 表1，利用DNS法分別在540nm處測吸光度值，以葡萄糖含量為橫坐標，以吸光度值為縱坐標， 繪制葡萄糖標準曲線。
[0019] 表1葡萄糖標準曲線的制作配方表
5.酶的最適溫度:取制備好的酶液，分別在10 °C、15 °C、20 °C、25 °C、30 °C、35 °C、40 °C、 45 °C的條件下測定纖維素酶活，經(jīng)確定酶的最適溫度為25 °C。
[0020] 【附圖說明】：圖1是本發(fā)明菌株的菌落形態(tài)圖； 圖2是本發(fā)明菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶進程圖； 圖3是本發(fā)明菌株所產(chǎn)酶液的最適溫度圖。
【主權項】
1.一種產(chǎn)低溫纖維素酶的菌株，其特征在于，所述菌株為Sphingobacterium kitahiroshimense S-4(保藏號為CGMCC 12301)，將菌株接種于搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)48h時酶活可達87.2 U/mL，酶的最適作用溫度為25°C。
【文檔編號】C12R1/01GK105838648SQ201610308290
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月11日
【發(fā)明人】張衛(wèi)兵, 姚拓, 張忠明, 其他發(fā)明人請求不公開姓名
【申請人】甘肅農(nóng)業(yè)大學