猶他游動放線菌及其在制備阿卡波糖中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株猶他游動放線菌(Actinoplanes utahensis)MYIH97及其應(yīng)用，該菌種由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NO：M 2016237，保藏日期為：2016年05月03日。本發(fā)明還公開了一種由此菌株發(fā)酵制備阿卡波糖的方法。本發(fā)明提供的發(fā)酵工藝經(jīng)大生產(chǎn)實(shí)踐，證明其發(fā)酵單位高且雜質(zhì)較少，大大地降低了后提取的難度，適宜工業(yè)化大生產(chǎn)且獲得的阿卡波糖產(chǎn)品質(zhì)量高。CCTCC NO: M 201623720160503
【專利說明】
猶他游動放線菌及其在制備阿卡波糖中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一株新型微生物及其用途和應(yīng)用，尤其涉及一株能代謝產(chǎn)生阿卡波糖 的菌種及其在制備阿卡波糖中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，由于生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變、日趨緊張的生活節(jié)奏以及少動多 坐的生活方式等諸多因素，全球糖尿病發(fā)病率增長迅速，糖尿病已經(jīng)成為繼腫瘤、心血管病 變之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)，到2025年，全球成人糖 尿病患者人數(shù)將增至3億，而中國糖尿病患者人數(shù)將達(dá)到4000萬，未來50年內(nèi)糖尿病仍將是 中國一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。臨床研究中發(fā)現(xiàn)，Π 型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病）占 糖尿病總體人群95%以上，它是以高血糖為特征的一種代謝性疾病，患病率高，起病隱匿， 早期癥狀不明顯。對于Π 型糖尿病的病人，在采用控制飲食的方法不能有效地控制血糖時， 需要口服降糖藥物。
[0003] 阿卡波糖是一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，其作用機(jī)制為:競爭性抑制位于小腸的各 種α-葡萄糖苷酶，從而具有抑制多糖及低聚糖等的水解，延緩和減少葡萄糖的生成，控制餐 后血糖濃度的升高。作為臨床治療Π 型糖尿病類藥物，阿卡波糖具有作用機(jī)制新穎、臨床療 效好、毒副作用小等特點(diǎn)，市場前景廣闊。目前國內(nèi)市場在售的，除了原研公司德國拜耳外， 幾乎全為杭州中美華東制藥有限公司生產(chǎn)。杭州中美華東制藥有限公司也是國內(nèi)最早生產(chǎn) 阿卡波糖的公司，基本可以代表國內(nèi)阿卡波糖的最高水平。但依然存在發(fā)酵雜質(zhì)多，產(chǎn)量 低。在大生產(chǎn)上進(jìn)一步的降低成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量一直是急需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一株發(fā)酵單位高、能穩(wěn)定生產(chǎn)且副產(chǎn)物少的 阿卡波糖產(chǎn)生菌。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供該菌株在制備阿卡波糖中的應(yīng)用，以及具體的發(fā)酵制 備方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明提供的猶他游動放線菌ΜΥΙΗ97,分類命名為Actinoplanes utahensis，由 中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏（簡稱CCTCC)，地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏號為：CCTCC Ν0:Μ 2016237,保藏日期為：2016年5月3日。所述的保藏號為：CCTCC Ν0:Μ 2016237的菌株 是成都市郊區(qū)土壤中篩選得到的。
[0008] 所述的保藏號為CCTCC Ν0:Μ 2016237的菌株的菌落特征：菌落近圓形，直徑3- 5mm，表面隆起，菌落呈橘黃色，并有水溶性色素產(chǎn)生。
[0009] 根據(jù)微生物形態(tài)學(xué)及國外相關(guān)資料的描述，結(jié)合保藏號為CCTCC Ν0:Μ 2016237的 菌株的各種培養(yǎng)特征和形態(tài)特征，該保藏號為CCTCC NO:M 2016237的菌株應(yīng)屬于猶他游動 放線菌，定名為Actinoplanes utahensis MYIH97。
[0010] 本發(fā)明的另一目的是提供該菌株在制備阿卡波糖中的應(yīng)用。
[0011] 所述的保藏號為CCTCC Ν0:Μ 2016237菌株可應(yīng)用于發(fā)酵制備阿卡波糖。該制備方 法包括下列步驟：
[0012] a.菌株采用保藏編號為CCTCC NO:M 2016237的菌株；
[0013] b.按常規(guī)方法制備斜面，斜面鏟下少量菌苔接入搖瓶種子培養(yǎng)基，250rpm，培養(yǎng)2- 3天，得搖瓶種子液;將搖瓶種子液按種子罐培養(yǎng)基體積0.1-0.5 %的接種量接種于種子罐， 120-200rpm，培養(yǎng)2-3天，得罐種子液;將罐種子液按發(fā)酵體積的6-15%的接種量接種于發(fā) 酵罐培養(yǎng)基，150_200rpm，發(fā)酵培養(yǎng)168h，收集發(fā)酵液;其中培養(yǎng)溫度均為26~30°C。
[0014]其中所述的搖瓶種子培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為:每100mL培養(yǎng)基中，碳源 1.2~2.5g，氮源2.5~4.0g，無機(jī)鹽0.2~0.6g，其余為水;優(yōu)選為每100mL培養(yǎng)基中，碳源 1.5~2.0g，氮源3.0~3.5g，無機(jī)鹽0.3~0.5g，其余為水，pH值6.5~7.5。
[0015] 種子罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為:每100mL培養(yǎng)基中，碳源2.0~3.5g，氮 源3.5~6.0g，無機(jī)鹽0.2~0.6g，其余為水;優(yōu)選為每100mL培養(yǎng)基中，碳源2.5~3.0g，氮源 4.5~5.5g，無機(jī)鹽0.3~0.5g，其余為水，pH值6.5~7.5。
[0016]發(fā)酵培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為:每100mL培養(yǎng)基中，碳源物質(zhì)5~10g，氮 源物質(zhì)1. 〇~3.5g，無機(jī)鹽0.2~2.0g，其余為水，pH值6.5~7.5;優(yōu)選為每100mL培養(yǎng)基中， 碳源物質(zhì)7~9g，氮源物質(zhì)1.5~3.0g，無機(jī)鹽0.8~1.5g，其余為水，pH值6.5~7.5。
[0017] 其中所述的：碳源選自葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、玉米淀粉、面粉、可溶性 淀粉、糊精、甘油中的一種或多種;優(yōu)選麥芽糖、葡萄糖、糊精、蔗糖、甘油中的一種或幾種。
[0018] 氮源選自蛋白胨、玉米漿粉、酵母粉、酵母浸出粉、黃豆餅粉、豆柏粉、棉籽餅粉、谷 氨酸鈉、賴氨酸中的一種或者多種;優(yōu)選蛋白胨、黃豆餅粉、酵母粉、玉米漿粉、谷氨酸鈉中 的一種或幾種。
[0019] 無機(jī)鹽選自硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鐵、硫 酸亞鐵、氯化鈣、碳酸鈣中的一種或幾種;優(yōu)選磷酸氫二鉀、氯化鉀、氯化鐵、氯化鈣、碳酸鈣 中的一種或幾種。
[0020] 本發(fā)明所述的保藏號為CCTCC Ν0:Μ 2016237的菌株是目前高發(fā)酵單位阿卡波糖 的產(chǎn)生菌，發(fā)酵性能優(yōu)良，可用于大規(guī)模生產(chǎn)。發(fā)酵過程是阿卡波糖生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，其發(fā) 酵水平與工藝優(yōu)劣直接相關(guān)，本發(fā)明提供的發(fā)酵工藝經(jīng)過搖瓶和發(fā)酵罐中進(jìn)行試驗(yàn)，其生 產(chǎn)能力穩(wěn)定。經(jīng)檢測，用本發(fā)明提供的菌種及發(fā)酵培養(yǎng)方法制備的阿卡波糖的發(fā)酵單位可 高達(dá)8.386g/L左右或以上，從而為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供了良好的基礎(chǔ)。同時本發(fā)明的發(fā) 酵副產(chǎn)物相對較少，并降低了后提取的難度，從而有利于高品質(zhì)的阿卡波糖的獲得，在應(yīng)用 于工業(yè)化生產(chǎn)上具有優(yōu)勢。
[0021 ]菌株保藏情況:保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC)，地址：中國武漢武 漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2016237,分類命名為猶他游動放線菌MYIH97 (Actinoplanes utahensis MYIH97)，保藏日期為2016年05月03日。
【附圖說明】
[0022] 圖1為保藏編號為CCTCC NO:M 2016237的菌落形態(tài)；
[0023] 圖2為保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2016237的菌絲形態(tài)；
[0024]圖3按本申請實(shí)施例7制備得到含量HPLC檢測圖；
[0025] 圖4按菌種保藏號為CCTCC N0:M209200菌株制備得到的含量HPLC檢測圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實(shí)施例為本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，但不能將方案中所涉及的方法 及技術(shù)參數(shù)理解為對本發(fā)明的限制。
[0027] 實(shí)施例1:保藏號為CCTCC Ν0:Μ 2016237菌株的培養(yǎng)及生理生化特征和碳氮源利 用情況
[0028] 1、保藏號為CCTCC NO:M 2016237菌株培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)特征
[0029] 將保藏號為CCTCC Ν0:Μ 2016237菌株接種于固體培養(yǎng)基，26-30°C培養(yǎng)6-12天，觀 察其菌落形態(tài)及菌絲形態(tài)分別如圖1、圖2所示。
[0030] CCTCC Ν0:Μ 2016237菌株在固體培養(yǎng)基上26-30°C培養(yǎng)10天，菌落直徑3-4mm，為 橘黃色，邊緣為規(guī)則圓形，中間隆起，培養(yǎng)前期表面光滑濕潤，培養(yǎng)后期表面出現(xiàn)干燥褶皺， 有水溶性色素產(chǎn)生。CCTCC Ν0:Μ 2016237菌株的菌絲舒展呈網(wǎng)狀，不產(chǎn)孢子。
[0031] 2、菌株生理生化特征一一碳、氮源利用
[0032]在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入各種碳、氮源，26~30°C培養(yǎng)，定期進(jìn)行觀察。結(jié)果如下表1所 示，碳源利用試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株能同化玉米淀粉、糊精、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖等， 不能利用半乳糖、D-核糖、肌醇、阿拉伯糖、棉子糖、甘露糖、鼠李糖、甘露醇、D-果糖、山梨 糖等。氮源利用試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株能利用硝酸鈉、氯化銨、硝酸銨等無機(jī)氮源和黃豆餅 粉、玉米漿、酵母粉、蛋白胨、酪氨酸等有機(jī)氮源。
[0033] 表1 CCTCC NO:M 2016237的碳、氮源利用情況 [0034]
[0035]
[0036] +:生長一般;++:生長中等;一:不長
[0037] 3.基因測序
[0038] CCTCC Ν0:Μ 2016237菌株16sRNA序列與GenBank中保存的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，與 Actinoplanes utahensis同源性達(dá)99%，根據(jù)微生物分子遺傳學(xué)鑒定原則，鑒定該菌屬于 Actinoplanes屬的utahensis種，中文名稱為猶他游動放線菌。
[0039] 實(shí)施例2:碳氮源對發(fā)酵效價的影響
[0040] 采用保藏號為CCTCC NO:M 2016237的菌株。
[0041] 1.1碳源對阿卡波糖效價的影響
[0042] 1.1.1不同碳源種類對阿卡波糖合成能力的影響
[0043]發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源分別采用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、玉米淀粉、面粉、可 溶性淀粉、糊精、甘油10種碳源為唯一碳源，培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH至7.2,滅菌待用。用接種環(huán)從固 體培養(yǎng)基上挑取菌苔接入上述各類碳源發(fā)酵培養(yǎng)基中，250r/min轉(zhuǎn)速28 °C培養(yǎng)7天，對發(fā)酵 液中的阿卡波糖含量進(jìn)行HPLC檢測。
[0044]表2不同碳源對阿卡波糖產(chǎn)生菌發(fā)酵能力的影響
[0045]
[0046]
[0047] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，游動放線菌可以利用以上10種物質(zhì)產(chǎn)阿卡波糖，其利用能力依次 是麥芽糖，葡萄糖，糊精，蔗糖，甘油，玉米淀粉，乳糖，果糖，面粉和可溶性淀粉，因此碳源優(yōu) 選麥芽糖、葡萄糖、糊精、蔗糖、甘油中的一種或幾種，其中以麥芽糖為唯一碳源時產(chǎn)量最 尚。
[0048] 1.1.2不同碳源濃度對阿卡波糖合成能力的影響
[0049] 選擇麥芽糖、葡萄糖、糊精、蔗糖、甘油中的一種或幾種作為碳源，配制成不同總濃 度的碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表3所示，在一定范圍內(nèi)，阿卡波糖合成能力隨著 碳源濃度的增大而增加，當(dāng)碳源濃度為8%時阿卡波糖產(chǎn)量達(dá)到最大值，碳源優(yōu)選濃度范圍 為7%~9%〇
[0050] 表3碳源濃度對阿卡波糖產(chǎn)生菌發(fā)酵能力的影響
[0051]
[0052] 1.2氮源對阿卡波糖合成能力的影響
[0053] 1.2.1不同氮源種類對阿卡波糖合成能力的影響
[0054]在優(yōu)選碳源的基礎(chǔ)上，分別采用豆柏粉、棉籽餅粉、黃豆餅粉、玉米漿粉、酵母粉、 酵母浸出粉、蛋白胨、谷氨酸鈉和賴氨酸9種氮源為唯一氮源進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)。用接種環(huán)從固 體培養(yǎng)基上挑取菌苔接入上述各類氮源發(fā)酵培養(yǎng)基中，250rpm轉(zhuǎn)速28.0 °C培養(yǎng)7天，對發(fā)酵 液中的阿卡波糖含量進(jìn)行HPLC檢測。
[0055]表4不同氮源阿卡波糖產(chǎn)生菌發(fā)酵能力的影響
[0056]
[0057] 由表4實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，游動放線菌可以利用以上9種物質(zhì)，發(fā)酵產(chǎn)生阿卡波糖的能 力依次是黃豆餅粉，酵母粉，玉米漿粉，谷氨酸鈉，蛋白胨，棉籽餅粉，酵母浸出粉，豆柏粉和 賴氨酸，因此根據(jù)發(fā)酵單位的高低氮源優(yōu)選黃豆餅粉、酵母粉、玉米漿粉、谷氨酸鈉和蛋白 胨中的一種或幾種，其中以黃豆餅粉為唯一氮源時產(chǎn)量最高。
[0058] 1.2.2不同氮源濃度對阿卡波糖合成能力的影響
[0059] 為了探索發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源濃度對阿卡波糖合成能力的影響，本實(shí)例選擇黃豆餅 粉、酵母粉、玉米漿粉、谷氨酸鈉和蛋白胨中的一種或幾種作為氮源，配制成不同總濃度的 氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表5所示，在一定范圍內(nèi)，阿卡波糖合成能力隨著氮源 濃度的增大而增加，氮源濃度為2.0 %時阿卡波糖發(fā)酵單位達(dá)到最大值，氮源優(yōu)選濃度范圍 為 1.5% ~3.0%〇
[0060] 表5氮源濃度對阿卡波糖產(chǎn)生菌發(fā)酵能力的影響
[0061]
[0063]實(shí)施例3:菌株發(fā)酵放大培養(yǎng)
[0064] 采用保藏號為CCTCC NO:M 2016237的菌株
[0065] 1、搖瓶種子培養(yǎng)
[0066] 培養(yǎng)基：麥芽糖0.7g，乳糖0.2g，面粉0.3g，棉籽餅粉3.0g，賴氨酸1.0g，碳酸鈣 0 · 5g;加水 100mL，pH值7 · 0。
[0067] 裝液量:500mL三角瓶裝100mL培養(yǎng)基
[0068]搖瓶種子培養(yǎng)方法:將斜面挖塊接入搖瓶種子培養(yǎng)基中，27.5 °C恒溫培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn) 速250rpm，待菌絲長起，有明顯掛壁現(xiàn)象時，鏡檢無雜菌，菌絲呈網(wǎng)狀，染色深，將搖瓶種子 培養(yǎng)液接入種子罐中。
[0069] 2、種子罐種子培養(yǎng)基
[0070]培養(yǎng)基:麥芽糖0.35Kg，果糖0.5Kg，可溶性淀粉0.15Kg，酵母浸出粉lKg，棉籽餅粉 0.75Kg，碳酸鈣0.25Kg，加水40L至100L種子罐，pH值6.8，經(jīng)121°C，30min滅菌后培養(yǎng)基體積 約為50L。
[0071 ]種子罐培養(yǎng)方法:按種子罐培養(yǎng)體積0.2% (v/v)接入培養(yǎng)好的搖瓶種子培養(yǎng)液， 27.5°C培養(yǎng)，達(dá)到移種條件時移種(鏡檢菌絲粗壯，染色深，無染菌）。培養(yǎng)過程中控制罐壓： 0.0510^，攪拌速度180印111，通氣量1:1.3(￥八〇。
[0072] 3、發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0073]培養(yǎng)基:玉米淀粉9Kg，麥芽糖22.5Kg，果糖13.5g，棉籽餅粉3.6Kg，賴氨酸2.25Kg， 硫酸錳0.45Kg，氯化鈉0.45Kg，加水380L至1噸發(fā)酵罐，pH值7.2，經(jīng)121°C，30min滅菌后培養(yǎng) 基體積約為450L。
[0074]發(fā)酵罐培養(yǎng)方法：按發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積11% (v/v)接入培養(yǎng)好的種子罐培養(yǎng)液， 28.0°C培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵終點(diǎn)判斷:菌絲染色淺，空泡較多，菌絲有斷裂現(xiàn)象。
[0075] 培養(yǎng)過程中控制罐壓:0.05MPa，攪拌速度160rpm，通氣量1:1.3(V/V)。
[0076] 按照上述的發(fā)酵條件和工藝，在1噸罐上進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵單位為5.96g/L。
[0077] 實(shí)施例4:菌株發(fā)酵放大培養(yǎng)
[0078] 采用保藏號為CCTCC NO:M 2016237的菌株
[0079] 1、搖瓶種子培養(yǎng)
[0080]培養(yǎng)基:玉米淀粉5.0g，果糖10.0g，可溶性淀粉10.0g，酵母浸出粉10.0g，豆柏粉 15 · 0g，碳酸鈣 5 · 0g;加水 1 OOOrnL，pH值6 · 6。
[0081 ] 裝液量:500mL三角瓶裝100mL培養(yǎng)基
[0082]搖瓶種子培養(yǎng)方法:將斜面挖塊接入搖瓶種子培養(yǎng)基中，27.0°C恒溫培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn) 速250rpm，待菌絲長起，有明顯掛壁現(xiàn)象時，鏡檢無雜菌，菌絲呈網(wǎng)狀，染色深，將搖瓶種子 培養(yǎng)液接入種子罐中。
[0083] 2、種子罐種子培養(yǎng)基
[0084]培養(yǎng)基：玉米淀粉7.5Kg，乳糖5Kg，面粉5Kg，豆柏粉25Kg，賴氨酸5g，碳酸鈣2.5Kg， 加水400L至1噸種子罐，pH值7.2,經(jīng)121°C，30min滅菌后培養(yǎng)基體積約為500L。
[0085]種子罐培養(yǎng)方法:按種子罐培養(yǎng)體積0.3% (v/v)接入培養(yǎng)好的搖瓶種子培養(yǎng)液， 28.0°C培養(yǎng)，達(dá)到移種條件時移種(鏡檢菌絲粗壯，染色深，無染菌）。培養(yǎng)過程中控制罐壓： 0.0510^，攪拌速度180印111，通氣量1:1.3(￥八〇。
[0086] 3、發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0087] 培養(yǎng)基：葡萄糖180Kg，乳糖22.5Kg，面粉22.5Kg，酵母浸出粉45Kg，豆柏粉 112.5Kg，硫酸亞鐵22.5Kg，磷酸二氫鉀47.25Kg，硫酸鎂20.25Kg，加水3.8噸至10噸發(fā)酵罐， pH值7.2，經(jīng)121°C，30min滅菌后培養(yǎng)基體積約為4.5噸。
[0088] 發(fā)酵罐培養(yǎng)方法：按發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積10% (v/v)接入培養(yǎng)好的種子罐培養(yǎng)液， 28.0°C培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵終點(diǎn)判斷:菌絲染色淺，空泡較多，菌絲有斷裂現(xiàn)象。
[0089] 培養(yǎng)過程中控制罐壓:0.05MPa，攪拌速度160rpm，通氣量1:1.3(V/V)。
[0090] 按照上述的發(fā)酵條件和工藝，在10噸罐上進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵單位為5.99g/L。
[0091] 實(shí)施例5:菌株發(fā)酵放大培養(yǎng)
[0092] 1、搖瓶種子培養(yǎng)
[0093]培養(yǎng)基:麥芽糖1 · 75g，蛋白胨2 · 0g，酵母粉1 · 0g，磷酸氫二鉀0 · 05g，碳酸鈣0 · 3g; 加水10〇1^，？田直7.2。
[0094] 裝液量:500mL三角瓶裝100mL培養(yǎng)基
[0095]搖瓶種子培養(yǎng)方法:將斜面挖塊接入搖瓶種子培養(yǎng)基中，27.5 °C恒溫培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn) 速250rpm，待菌絲長起，有明顯掛壁現(xiàn)象，鏡檢無雜菌，菌絲呈網(wǎng)狀，染色深，將搖瓶種子培 養(yǎng)液接入種子罐中。
[0096] 2、種子罐種子培養(yǎng)基
[0097]培養(yǎng)基：麥芽糖0.9Kg，糊精0.4Kg，蛋白胨1.25Kg，酵母粉1. OKg，磷酸氫二鉀 0.05Kg，碳酸鈣0.15Kg，加水40L至100L種子罐，pH值7.0，經(jīng)121°C，30min滅菌后培養(yǎng)基體積 約為50L。
[0098]種子罐培養(yǎng)方法:按種子罐培養(yǎng)體積0.2% (v/v)接入培養(yǎng)好的搖瓶種子培養(yǎng)液， 28°C培養(yǎng)，達(dá)到移種條件時移種(鏡檢菌絲粗壯，染色深，無染菌）。培養(yǎng)過程中控制罐壓： 0.0510^，攪拌速度160印111，通氣量1:1.3(￥八〇。
[0099] 3、發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0100]培養(yǎng)基：葡萄糖22 · 5Kg，糊精18 · OKg，玉米漿粉4 · 5Kg，酵母粉2 · 25Kg，磷酸氫二鉀 1.8Kg，碳酸鈣3.6Kg，加水380L至1噸發(fā)酵罐，pH值7.2，經(jīng)121°C，30min滅菌后培養(yǎng)基體積約 為450L。
[0101 ]發(fā)酵罐培養(yǎng)方法：按發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積11 % (v/v)接入培養(yǎng)好的種子罐培養(yǎng)液， 28.5°C培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵終點(diǎn)判斷:菌絲染色淺，空泡較多，菌絲有斷裂現(xiàn)象。
[0102] 培養(yǎng)過程中控制罐壓:0.04MPa，攪拌速度160rpm，通氣量1:1.1 (V/V)。
[0103]按照上述的發(fā)酵條件和工藝，在1噸罐上進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵單位為7.988g/L。
[0104] 實(shí)施例6:菌株發(fā)酵放大培養(yǎng)
[0105] 1、搖瓶種子培養(yǎng)
[0106] 培養(yǎng)基：葡萄糖20.0g，糊精10.0g，黃豆餅粉60.0g，谷氨酸鈉10g，氯化鈣2.0g，碳 酸鈣4 · 0g;加水2000mL，pH值7 · 2。
[0107] 裝液量:500mL三角瓶裝100mL培養(yǎng)基
[0108] 搖瓶種子培養(yǎng)方法:將斜面挖塊接入搖瓶種子培養(yǎng)基中，28.0 °C恒溫培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn) 速250rpm，待菌絲長起，有明顯掛壁現(xiàn)象時，鏡檢無雜菌，菌絲呈網(wǎng)狀，染色深，將搖瓶種子 培養(yǎng)液接入種子罐中。
[0109] 2、種子罐種子培養(yǎng)基
[0110] 培養(yǎng)基：葡萄糖13.75Kg，黃豆餅粉27.5Kg，谷氨酸鈉2.75Kg，氯化鈣0.55Kg，碳酸 鈣l.lKg，加水480L至1噸種子罐，pH值7.0,經(jīng)121°C，30min滅菌后培養(yǎng)基體積約為550L。
[0111] 種子罐培養(yǎng)方法:按種子罐培養(yǎng)體積0.35 % (v/v)接入培養(yǎng)好的搖瓶種子培養(yǎng)液， 28.0°C培養(yǎng)，達(dá)到移種條件時移種(鏡檢菌絲粗壯，染色深，無染菌）。培養(yǎng)過程中控制罐壓： 0.0510^，攪拌速度160印111，通氣量1:1.3(￥八〇。
[0112] 3、發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0113]培養(yǎng)基:麥芽糖225Kg，蔗糖90Kg，甘油45Kg，黃豆餅粉81Kg，谷氨酸鈉9Kg，氯化鉀 18Kg，氯化鈣27Kg，碳酸鈣22.5Kg，加水4噸至10噸發(fā)酵罐，pH值7.2，經(jīng)121°C，30min滅菌后 培養(yǎng)基體積約為4.5噸。
[0114] 發(fā)酵罐培養(yǎng)方法:按發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積12% (v/v)接入培養(yǎng)好的種子罐培養(yǎng)液，28 °C培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵終點(diǎn)判斷:菌絲染色淺，空泡較多，菌絲有斷裂現(xiàn)象。
[0115] 培養(yǎng)過程中控制罐壓:0.04MPa，攪拌速度160rpm，通氣量1:1.1(V/V)。
[0116] 按照上述的發(fā)酵條件和工藝，在10噸罐上進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵單位為:8.386g/L。
[0117] 實(shí)施例7 :菌株發(fā)酵放大培養(yǎng)
[0118] 采用保藏號為CCTCC NO:M 2016237的菌株
[0119] 1、搖瓶種子培養(yǎng)
[0120]培養(yǎng)基：蔗糖50.0 g，甘油50.0 g，玉米漿粉165g，碳酸鈣25g;加水5000mL，pH值6.8。
[0121] 裝液量:500mL三角瓶裝100mL培養(yǎng)基
[0122] 搖瓶種子培養(yǎng)方法:將斜面挖塊接入搖瓶種子培養(yǎng)基中，28°C恒溫培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn) 速250rpm，待菌絲長起，有明顯掛壁現(xiàn)象，鏡檢無雜菌，菌絲呈網(wǎng)狀，染色深，將搖瓶種子培 養(yǎng)液接入種子罐中。
[0123] 2、種子罐種子培養(yǎng)基
[0124] 培養(yǎng)基：蔗糖100Kg，甘油50Kg，玉米漿粉240Kg，碳酸鈣25Kg，加水4噸至10噸種子 罐，pH值7.0，經(jīng)121°C，30min滅菌后培養(yǎng)基體積約為5噸。
[0125] 種子罐培養(yǎng)方法:按種子罐培養(yǎng)體積0.2% (v/v)接入培養(yǎng)好的搖瓶種子培養(yǎng)液， 28 °C培養(yǎng)，達(dá)到移種條件時移種(鏡檢菌絲粗壯，染色深，無染菌，菌濃多30 % )。培養(yǎng)過程中 控制罐壓:0.04MPa，攪拌速度160rpm，通氣量1:1.1(V/V)。
[0126] 3、發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0127] 培養(yǎng)基：麥芽糖3150Kg，黃豆餅粉1125Kg，蛋白胨225Kg，氯化鐵135Kg，碳酸鈣 225Kg，加水36噸至60噸發(fā)酵罐，pH值7.2，經(jīng)121°C，30min滅菌后培養(yǎng)基體積約為45噸。
[0128] 發(fā)酵罐培養(yǎng)方法:按發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積11 % (v/v)接入培養(yǎng)好的種子罐培養(yǎng)液，28 °C培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵終點(diǎn)判斷:菌絲染色淺，空泡較多，菌絲有斷裂現(xiàn)象。
[0129] 培養(yǎng)過程中控制罐壓:0.03MPa，攪拌速度150rpm，通氣量1:0.9(V/V)。
[0130]按照上述的發(fā)酵條件和工藝，在60噸罐上進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵單位為6.89g/L。
[0131 ]發(fā)酵液進(jìn)行固液分離，得濾液，經(jīng)樹脂解吸附解析，脫色，濃縮，噴霧干燥得純阿卡 波糖。本發(fā)明所述的菌株由于發(fā)酵單位高，提取和純化的工藝較簡單，在大生產(chǎn)上更具有優(yōu) 勢。
[0132] 實(shí)施例8:對比研究:阿卡波糖高產(chǎn)菌株與生產(chǎn)菌株發(fā)酵單位和產(chǎn)物雜質(zhì)比較
[0133] 采用本申請的阿卡波糖高產(chǎn)菌株保藏號為CCTCC Ν0:Μ 2016237的菌株，和目前使 用的菌株，比如菌種保藏號為CCTCC N0:M209200(中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2009 年2月16日）進(jìn)行發(fā)酵單位和產(chǎn)物雜質(zhì)比較。
[0134] 兩個菌株采用相同的方法和條件進(jìn)行培養(yǎng)和處理，搖瓶種子、種子罐種子和發(fā)酵 培養(yǎng)均按照實(shí)施例7中的配比和條件進(jìn)行，培養(yǎng)后調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至5~6,加助濾劑過濾，濾 液經(jīng)過脫鹽、層析、濃縮后，HPLC檢測，圖譜如圖3、4所示。依據(jù)HPLC檢測，對本申請CCTCC Ν0:Μ 2016237的菌株與現(xiàn)有菌種的雜質(zhì)主峰阿卡波糖含量對比如下：
[0135] 表6:CCTCC Ν0:Μ 2016237的菌株和保藏號為CCTCC N0:M209200的菌株發(fā)酵產(chǎn)物 的雜質(zhì)和主峰阿卡波糖含量對比
[0136]
[0137] 從HPLC檢測結(jié)果來看，本發(fā)明的CCTCC Ν0:Μ 2016237菌株發(fā)酵不僅發(fā)酵單位高， 而且發(fā)酵液中的雜質(zhì)明顯低于和少于保藏號為CCTCC N0:M209200的菌株，因此，該發(fā)明提 供的阿卡波糖產(chǎn)生菌具有發(fā)酵單位高、能穩(wěn)定生產(chǎn)且副產(chǎn)物少的特性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株猶他游動放線菌(Actinoplanes utahensis)MYIH97,由中國典型培養(yǎng)物保藏中 心保藏，保藏號為CCTCC N0:M 2016237,保藏日期為:2016年05月03日。2. 如權(quán)利要求1所述的保藏號為CCTCC N0:M 2016237的菌株在發(fā)酵制備阿卡波糖的應(yīng) 用。3. 應(yīng)用權(quán)利要求1所述的保藏號為CCTCC N0:M 2016237的菌株發(fā)酵制備阿卡波糖的方 法，其特征在于包括下列步驟： a. 發(fā)酵菌株采用保藏編號為CCTCC N0:M 2016237的菌株； b. 按常規(guī)方法制備斜面，斜面鏟下少量菌苔接入搖瓶種子培養(yǎng)基，250rpm，培養(yǎng)2-3天， 得搖瓶種子液； 將搖瓶種子液按種子罐培養(yǎng)基體積0.1-0.5 %的接種量接種于種子罐，120-200rpm，培 養(yǎng)2-3天，得罐種子液； 將罐種子液按發(fā)酵體積的6-15 %的接種量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基，150-200rpm，發(fā)酵培 養(yǎng)168h，收集發(fā)酵液； 其中培養(yǎng)溫度均為26~30 °C。4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟b中搖瓶種子培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基 中的比例為:每100mL培養(yǎng)基中，碳源1.2~2.5g，氮源2.5~4.0g，無機(jī)鹽0.2~0.6g，其余為 水;優(yōu)選為每l〇〇mL培養(yǎng)基中，碳源1.5~2.0g，氮源3.0~3.5g，無機(jī)鹽0.3~0.5g，其余為 水，pH值6.5~7.5。5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟b中種子罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中 的比例為：每100mL培養(yǎng)基中，碳源2.0~3.5g，氮源3.5~6.0g，無機(jī)鹽0.2~0.6g，其余為 水;優(yōu)選為每l〇〇mL培養(yǎng)基中，碳源2.5~3.0g，氮源4.5~5.5g，無機(jī)鹽0.3~0.5g，其余為 水，pH值6.5~7.5。6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟b中發(fā)酵培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的 比例為:每100mL培養(yǎng)基中，碳源5~10g，氮源1.0~3.5g，無機(jī)鹽0.2~2.0g，其余為水，pH值 6.5~7.5;優(yōu)選為每10〇111]^培養(yǎng)基中，碳源7~98，氮源1.5~3.(^，無機(jī)鹽().8~1.58，其余為 水，pH值6.5~7.5。7. 如權(quán)利要求3至6任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于 所述碳源選自碳源選自葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、玉米淀粉、面粉、可溶性淀 粉、糊精、甘油中的一種或多種;優(yōu)選麥芽糖、葡萄糖、糊精、蔗糖、甘油中的一種或幾種。8. 如權(quán)利要求3至6任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于 所述氮源選自蛋白胨、玉米漿粉、酵母粉、酵母浸出粉、黃豆餅粉、豆柏粉、棉籽餅粉、谷 氨酸鈉、賴氨酸中的一種或者多種;優(yōu)選蛋白胨、黃豆餅粉、酵母粉、玉米漿粉、谷氨酸鈉中 的一種或幾種。9. 如權(quán)利要求3至6任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于 所述選自硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鐵、硫酸亞 鐵、氯化鈣、碳酸鈣中的一種或幾種;優(yōu)選磷酸氫二鉀、氯化鉀、氯化鐵、氯化鈣、碳酸鈣中的 一種或幾種。
【文檔編號】C12R1/045GK105838645SQ201610292358
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月4日
【發(fā)明人】李娜, 陳曉霞, 何志勇, 徐亞強(qiáng), 謝海松, 王子寶, 李偉偉
【申請人】杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)新藥研究院有限公司, 杭州中美華東制藥有限公司, 華東醫(yī)藥股份有限公司