一種雞滑液囊支原體的培養(yǎng)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種雞滑液囊支原體的培養(yǎng)方法，包括一級(jí)種子繁殖、種子液的制備和菌液制備三個(gè)步驟。其中使用的液體培養(yǎng)基，其組分濃度為PPLO肉湯21.0g/L、葡萄糖5.0g/L、滅活馬血清200ml/L、25％酵母浸出液200ml/L、1％酚紅溶液1.0ml/L、1％輔酶I溶液30ml/L、1％L?半胱氨酸溶液30ml/L，pH值調(diào)至7.6～7.8。本發(fā)明的工藝方法不僅縮短了雞滑液囊支原體的培養(yǎng)時(shí)間，而且也降低了中間多次取樣檢測(cè)的程序，減少了培養(yǎng)過(guò)程中污染的可能性，并降低了由于人工操作帶來(lái)的誤差，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有進(jìn)步性。CCTCC NO:M 201608020160303
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種雞滑液囊支原體的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于病原菌培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞滑液囊支原體的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞滑液囊支原體(Mycoplasma synoviae，MS)又稱(chēng)雞傳染性滑膜炎，是由雞滑液囊 支原體引起雞和火雞等的一種急性或慢性傳染病。雞傳染性滑膜炎是Olson等（1964)首先 報(bào)道的。本病以侵害關(guān)節(jié)滑液，腱鞘膜為主，其特征為關(guān)節(jié)、腱鞘和足掌腫脹等。雞群感染該 病可導(dǎo)致明顯的跛行、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩及胴體降級(jí)等，本病可垂直傳播，導(dǎo)致種雞發(fā)病期間所 產(chǎn)種蛋孵出的雛雞發(fā)病。雞滑液囊支原體感染已遍及全球，呈世界性分布，主要侵害商品肉 雞、蛋雞和種雞，本病一年四季均可發(fā)生，但以冬春季節(jié)易發(fā)。雞滑液囊支原體感染一般多 見(jiàn)于4~16周齡雞，發(fā)病率一般為5%~15%，死亡率約為1 %~10%。由于本病發(fā)展緩慢，病 程長(zhǎng)，一旦在雞群中感染，根除很困難，因此在雞群中長(zhǎng)期蔓延，導(dǎo)致飼料利用率低、生長(zhǎng)發(fā) 育遲緩、淘汰率增高、產(chǎn)蛋量下降等。雞群如存在該病原時(shí)，易發(fā)生混合感染，加劇病情，死 亡率增高，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近幾年該病在我國(guó)的發(fā)病有發(fā)展及蔓延的趨勢(shì)，已引起了 養(yǎng)殖界專(zhuān)家的關(guān)注。國(guó)內(nèi)目前既無(wú)預(yù)防雞滑液囊支原體的活疫苗也無(wú)滅活疫苗上市，由于 雞滑液囊支原體的培養(yǎng)存在一定的難度，傳統(tǒng)靜止的培養(yǎng)工藝耗時(shí)長(zhǎng)，并且活菌含量也不 高，不能用于雞滑液囊支原體疫苗規(guī)?；a(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種雞滑液囊支原體的培養(yǎng)方法，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不 足。
[0004] 為了解決目前現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種新的用于雞滑液囊支原 體的培養(yǎng)工藝，具體包括以下步驟：
[0005] 1)-級(jí)種子繁殖及鑒定將雞滑液囊支原體凍干種子用液體培養(yǎng)基復(fù)原，按10%將 種子液接種于雞滑液囊液體培養(yǎng)基中，置37 °C，150r/min振蕩培養(yǎng)24~30小時(shí)，收獲培養(yǎng) 物，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，作為一級(jí)種子。
[0006] 2)二級(jí)種子和多級(jí)種子繁殖取一級(jí)種子液按10%接種液體培養(yǎng)基，置37°C，150r/ min振蕩培養(yǎng)24~30小時(shí)，收獲培養(yǎng)物，經(jīng)鏡檢合格后，作為二級(jí)種子，置2~8 °C保存?zhèn)溆谩?以此方法逐步做種子擴(kuò)大培養(yǎng)，一直到所需要的種子量。經(jīng)鏡檢純粹后，作為擴(kuò)大培養(yǎng)用 種子液。
[0007] 3)菌液制備按照培養(yǎng)瓶容積60 %~80 %加入雞滑液囊支原體液體培養(yǎng)基、pH值為 7.6~7.8、種子接種量為10%、培養(yǎng)溫度為37°(：、振蕩速度為90~10(^/1^11，培養(yǎng)24~30小 時(shí)收獲菌液，取樣進(jìn)行半成品檢驗(yàn)。
[0008] 其中本發(fā)明的液體培養(yǎng)基，其組分濃度為PPL0肉湯21. Og/L、葡萄糖5 . Og/L、滅活 馬血清200ml/L、25%酵母浸出液200ml/L、l%酚紅溶液1.0ml/L、l%輔酶I溶液30ml/L、l% L-半胱氨酸溶液30ml/L，pH值調(diào)至7.6~7.8。
[0009] 作為優(yōu)選，上述的培養(yǎng)基中還添加有青霉素;其添加濃度為80萬(wàn)單位/L。
[0010] 上述培養(yǎng)基的制備方法如下：
[0011] 1)基礎(chǔ)液配制：
[0012] 取PPL0肉湯、葡萄糖加水溶液后，再加入酚紅溶液，混合溶解后，在116 °C高壓滅菌 30分鐘，冷卻后置2~8°C保存；
[0013] 2)培養(yǎng)基配制：
[0014] 將基礎(chǔ)液冷卻后，無(wú)菌條件下加入滅活馬血清、酵母浸出液、青霉素溶液、輔酶I溶 液、L-半胱氨酸溶液，用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.6~7.8，2~8°C保存。
[0015] 本發(fā)明的工藝方法不僅縮短了雞滑液囊支原體的培養(yǎng)時(shí)間，而且也降低了中間多 次取樣檢測(cè)的程序，減少了培養(yǎng)過(guò)程中污染的可能性，并降低了由于人工操作帶來(lái)的誤差， 相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有進(jìn)步性。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合具體實(shí)施案例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
[0017] 實(shí)施例1按照不同配方制備本發(fā)明培養(yǎng)基
[0018] 1培養(yǎng)基制備
[0019] 1.1基礎(chǔ)液配制取PPL0肉湯21.0g、葡萄糖5.0g、去離子水加至1000ml、l%酚紅溶 液1.0ml，上述成分混合溶解后，116°C高壓滅菌30分鐘，冷卻后置2~8°C保存。
[0020] 1.2培養(yǎng)基制備將基礎(chǔ)液冷卻后無(wú)菌加入不同量滅活馬血清、25%酵母浸出液、 1 %輔酶I溶液、1 %L-半胱氨酸溶液，80萬(wàn)單位/ml青霉素溶液均加入1.2ml，用lmol/L的氫 氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.6，制備了 6種液體培養(yǎng)基。具體配方見(jiàn)表1。
[0021] 表1:液體培養(yǎng)基制備方法
[0022]
[0023]實(shí)施例2不同配方液體培養(yǎng)基的篩選：
[0024]將雞滑液囊支原體菌液，分別按10%接種上述6種液體培養(yǎng)基，置37°C，150r/min 振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間均為36小時(shí)，于培養(yǎng)不同時(shí)間分別取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。不同配方液體培 養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)結(jié)果表明，按照配方二、配方三、配方五、配方六制備的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)效 果較好，24~30小時(shí)活菌數(shù)均不低于109(XU/ml，配方三和配方六因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的血清等輔 液成分加入量較高，使培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)過(guò)于豐富，導(dǎo)致YBF-MS1株生長(zhǎng)過(guò)快，同時(shí)衰老的也快;且 血清等輔液成分加入量高，也增加了生產(chǎn)成本，配方二培養(yǎng)時(shí)間略長(zhǎng)，綜合考慮，最終選擇 配方五制備的液體培養(yǎng)基來(lái)驗(yàn)證培養(yǎng)效果。結(jié)果見(jiàn)下表。
[0025] 表2:6種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時(shí)間活菌計(jì)數(shù)結(jié)果
[0026]
[0027]
[0028] 實(shí)施例3:本發(fā)明培養(yǎng)基與改良Frey氏液體培養(yǎng)基培養(yǎng)效果比較
[0029]將雞滑液囊支原體YBF-MS1株(YBF-MS1株已保藏于位于武漢、武漢大學(xué)的中國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2016年3月3日，保藏號(hào)為:CCTCC Μ 2016080。）凍干種子復(fù) 蘇后，按1 〇 %將種子液分別接種改良F r e y氏液體培養(yǎng)基和本發(fā)明的配方五的液體培養(yǎng)基， 分別置37°C，150r/min振蕩培養(yǎng)36小時(shí)，于培養(yǎng)不同時(shí)間分別取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果 表明，應(yīng)用本發(fā)明培養(yǎng)基，不同培養(yǎng)時(shí)間的活菌量均高于應(yīng)用改良Frey氏液體培養(yǎng)基，不同 培養(yǎng)時(shí)間的活菌量。結(jié)果見(jiàn)表3。
[0030] 表3:培養(yǎng)基的選擇試驗(yàn)結(jié)果
[0031]
[0032] 實(shí)施例4:采用本發(fā)明的工藝制備雞滑液囊支原體
[0033] 1菌種雞滑液囊支原體YBF-MS1株。
[0034] 2雞滑液囊支原體液體培養(yǎng)基制備取PPL0肉湯21.0g、葡萄糖5g、去離子水加至 1000ml、1 %酚紅溶液lml，上述成分混合溶解后，116°C高壓滅菌30分鐘，基礎(chǔ)液冷卻后無(wú)菌 加入滅活馬血清200ml、25%酵母浸出液200ml、80萬(wàn)單位/ml青霉素溶液1.2ml、1 %輔酶I溶 液30ml、1 %L-半胱氨酸溶液30ml，用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.6~7.8。2~8°C保 存。
[0035] 3雞滑液囊支原體YBF-MS1株鑒定雞滑液囊支原體YBF-MS1株經(jīng)姬姆薩染色形態(tài)為 多形態(tài)球狀菌，將雞滑液囊支原體菌株接種于上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)24~30小時(shí)，呈輕度渾濁 生長(zhǎng)，能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基pH值下降0.7及以上，在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落呈煎蛋 狀。在雞滑液囊支原體液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中加入雞滑液囊支原體陽(yáng)性血清，均出現(xiàn) 特異性抑制作用。用PCR特異性引物進(jìn)行鑒定，雞滑液囊支原體菌株為陽(yáng)性。
[0036] 4種子液的制備
[0037] 4.1 一級(jí)種子繁殖及鑒定將雞滑液囊支原體YBF-MS1株凍干種子用液體培養(yǎng)基復(fù) 原，按10%將種子液接種于雞滑液囊液體培養(yǎng)基中，置37°C，150r/min振蕩培養(yǎng)24~30小時(shí) (待培養(yǎng)基顏色由猩紅變成橘黃停止培養(yǎng)），收獲培養(yǎng)物，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，作為一級(jí)種 子。
[0038] 4.2二級(jí)種子和多級(jí)種子繁殖取一級(jí)種子液按10%接種液體培養(yǎng)基，置置37°C， 150r/min振蕩培養(yǎng)24~30小時(shí)(待培養(yǎng)基顏色由猩紅變成橘黃停止培養(yǎng)），收獲培養(yǎng)物，經(jīng) 鏡檢合格后，作為二級(jí)種子，置2~8°C保存?zhèn)溆谩Ｒ源朔椒ㄖ鸩阶龇N子擴(kuò)大培養(yǎng)，一直到所 需要的種子量。經(jīng)鏡檢純粹后，作為擴(kuò)大培養(yǎng)用種子液。
[0039] 4.3菌液制備按照培養(yǎng)瓶容積60 %~80 %加入雞滑液囊支原體液體培養(yǎng)基、pH值 為7.6~7.8、種子接種量為10 %、培養(yǎng)溫度為37 °C、振蕩速度為90~100r/min (由于大容量 搖床的振蕩速度受培養(yǎng)瓶大小和裝量體積的影響，振蕩速度不宜過(guò)高，通過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)條件 的選擇試驗(yàn)可知，大容量培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)的振蕩速度調(diào)節(jié)為90~100r/min，培養(yǎng)24~30小 時(shí)活菌量最高。）培養(yǎng)24~30小時(shí)收獲菌液，取樣進(jìn)行半成品檢驗(yàn)，半成品菌液活菌數(shù)均不 低于 l〇9CCU/ml。
[0040]實(shí)施例5常用的靜止培養(yǎng)工藝制備雞滑液囊支原體
[0041 ] 1菌種雞滑液囊支原體YBF-MS1株由青島易邦生物工程有限公司保存。
[0042] 2液體培養(yǎng)基制備取PPLO肉湯21. Og、葡萄糖5g、去離子水加至1000ml、1 %酚紅溶 液lml，上述成分混合溶解后，116 °C高壓滅菌30分鐘，基礎(chǔ)液冷卻后無(wú)菌加入滅活馬血清 200ml、25 %酵母浸出液200ml、80萬(wàn)單位/ml青霉素溶液1.2ml、1 %輔酶I溶液30ml、1 %L-半 胱氨酸溶液30ml，用ImoVL的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.6~7.8,2~8°C保存(與實(shí)施例4一 致)。
[0043] 3種子液的制備
[0044] 3.1-級(jí)種子繁殖將YBF-MS1株凍干種子用液體培養(yǎng)基復(fù)原，按10%將種子液分別 接種于液體培養(yǎng)基中，置37°C，靜止培養(yǎng)48小時(shí)，收獲培養(yǎng)物，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，作為一級(jí) 種子。
[0045] 3.2二級(jí)種子和多級(jí)種子繁殖按10%將一級(jí)種子液接種液體培養(yǎng)基，置37°C，靜止 培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)鏡檢合格后，作為二級(jí)種子，置2~8°C保存?zhèn)溆?。以此方法逐步做種子擴(kuò)大 培養(yǎng)，一直到所需要的種子量。經(jīng)鏡檢純粹后，作為擴(kuò)大培養(yǎng)用種子液。
[0046] 3.3菌液制備以合格的種子液按10 %的量接種至ljpH7.6~7.8的液體培養(yǎng)基，37°C 靜止培養(yǎng)48小時(shí)，半成品菌液活菌數(shù)為108CCU/ml。
[0047] 采用兩種工藝方法制備的雞滑液囊支體菌液活菌量的比較
[0048] 采用本發(fā)明工藝(實(shí)施例4)和靜止培養(yǎng)工藝(實(shí)施例5)進(jìn)行的不同時(shí)間的對(duì)比試 驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明工藝方法培養(yǎng)的雞滑液囊支原體YBF-MS1株菌液的活菌量均能達(dá) 到109CCU/ml及以上，根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，我們隨后又采用本發(fā)明工藝擴(kuò)大培養(yǎng)了4批雞滑 液囊支原體YBF-MS1株菌液進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果表明，本發(fā)明的培養(yǎng)工藝是可行的。試驗(yàn)結(jié) 果見(jiàn)表4、表5。
[0049] 表4靜止培養(yǎng)工藝與本發(fā)明培養(yǎng)工藝的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果
[0050]
[0051 ] 表5培養(yǎng)工藝驗(yàn)證測(cè)定結(jié)果
[0052]
[0053]
[0054]試驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明進(jìn)行的雞滑液囊支原體的培養(yǎng)工藝，不僅能夠縮短雞 滑液囊支原體培養(yǎng)時(shí)間，還能提高了半成品菌液的活菌量，并降低中間多次取樣檢測(cè)pH值 的程序，減少了培養(yǎng)過(guò)程中污染的可能性，降低了操作人員勞動(dòng)強(qiáng)度。
[0055]使用本發(fā)明的方法，對(duì)其它雞滑液囊支原體進(jìn)行培養(yǎng)，效果也類(lèi)似，表明本發(fā)明的 方法具有通用性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雞滑液囊支原體的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 1) 一級(jí)種子繁殖及鑒定將雞滑液囊支原體凍干種子用液體培養(yǎng)基復(fù)原，按10%將種子 液接種于雞滑液液體培養(yǎng)基中，置37°C，150r/min振蕩培養(yǎng)24~30小時(shí)，收獲培養(yǎng)物，經(jīng)純 粹檢驗(yàn)合格后，作為一級(jí)種子； 2) 二級(jí)種子和多級(jí)種子繁殖取一級(jí)種子液按10%接種液體培養(yǎng)基，置37°C，150r/min 振蕩培養(yǎng)24~30小時(shí)，收獲培養(yǎng)物，經(jīng)鏡檢合格后，作為二級(jí)種子，置2~8°C保存?zhèn)溆?將二 級(jí)種子進(jìn)行逐步擴(kuò)大培養(yǎng)，得到擴(kuò)大培養(yǎng)用種子液； 3) 菌液制備按照培養(yǎng)瓶容積60 %~80 %加入雞滑液囊支原體液體培養(yǎng)基、pH值為7.6 ~7.8、種子接種量為10 %、培養(yǎng)溫度為37 °C、振蕩速度為90~100r/min;培養(yǎng)24~30小時(shí)收 獲菌液。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液體培養(yǎng)基，其組分濃度為PPL0肉湯 21.0g/L、葡萄糖5.0g/L、滅活馬血清200ml/L、25%酵母浸出液200ml/L、l%酚紅溶液 1.0ml/L、1 %輔酶I溶液30ml/L、1 %L-半胱氨酸溶液30ml/L，pH值調(diào)至7.6~7.8。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的液體培養(yǎng)基中還添加有抗生素。4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗生素為青霉素。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的青霉素的添加濃度為80萬(wàn)單位/L。6. 如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基的制備方法包括如下 的步驟： 1) 基礎(chǔ)液配制： 取PPL0肉湯、葡萄糖加水溶液后，再加入酚紅溶液，混合溶解后，在116 °C高壓滅菌30分 鐘，冷卻后置2~8°C保存； 2) 培養(yǎng)基配制： 將基礎(chǔ)液冷卻后，無(wú)菌條件下加入滅活馬血清、酵母浸出液、輔酶I溶液、L-半胱氨酸溶 液，再用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.6~7.8完成制備。7. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，在步驟2)中同時(shí)添加青霉素溶液。
【文檔編號(hào)】C12R1/35GK105838641SQ201610160611
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年3月21日
【發(fā)明人】馬爽, 于國(guó)營(yíng), 胡瀟, 郭莉莉, 鄒桂榮, 陶曉珊, 宋新宇, 宮曉, 王麗萍
【申請(qǐng)人】青島易邦生物工程有限公司