枯草芽孢桿菌jtfm1001及其在防控玉米黃曲霉毒素污染中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物肥料技術(shù)領(lǐng)域，具體公開枯草芽孢桿菌JTFM1001、菌劑及其在防控玉米黃曲霉毒素污染中的應(yīng)用。本發(fā)明公開的解淀粉芽胞桿菌由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2016145。本發(fā)明公開的解淀粉芽胞桿菌對(duì)侵染玉米的黃曲霉菌及毒素污染防治效果明顯，該菌株具有較強(qiáng)的抑菌和解毒活性。本發(fā)明還提供一種含有該菌種的微生物有機(jī)肥，該有機(jī)肥施入土壤后，拮抗菌能夠在作物根際快速繁殖并長(zhǎng)期生存，形成優(yōu)勢(shì)菌群，施用本微生物有機(jī)肥能有效防治黃曲霉菌對(duì)玉米的污染，同時(shí)能減少化學(xué)農(nóng)藥的殘留，在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全應(yīng)用中前景廣闊。CCTCC NO:M 201614520160328
【專利說明】
枯草芽孢桿菌JTFM1001及其在防控玉米黃曲霉毒素污染中的 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物肥料技術(shù)領(lǐng)域，具體公開一種抗菌解毒的枯草芽孢桿菌 JTFM1001、含菌有機(jī)肥及其在防控玉米黃曲霉毒素污染中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米是世界上重要的糧食作物，也是重要的飼料原材料。目前，在玉米的儲(chǔ)藏過程 中不可避免的產(chǎn)生霉菌毒素，解決霉菌毒素，特別是黃曲霉毒素對(duì)玉米等糧食和飼料的污 染是一個(gè)世界性難題。黃曲霉毒素(AF)是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn) 物，是一類理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)相似的真菌毒素。黃曲霉毒素污染給玉米、花生等農(nóng)作物的生產(chǎn) 帶來嚴(yán)重?fù)p失，每年導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億美元。黃曲霉毒素是廣泛污染農(nóng)產(chǎn)品的一 類強(qiáng)致癌、劇毒性真菌毒素，其中JTFM1最普遍且毒性最強(qiáng)，人或動(dòng)物食用受毒素污染的農(nóng) 產(chǎn)品后會(huì)導(dǎo)致機(jī)體病變甚至死亡，嚴(yán)重威脅消費(fèi)者健康與生命安全。因此，加強(qiáng)玉米等農(nóng)產(chǎn) 品中黃曲霉毒素污染的防控刻不容緩。
[0003] 黃曲霉菌對(duì)玉米的侵染主要發(fā)生在田間生長(zhǎng)時(shí)期，毒素產(chǎn)生和污染主要在儲(chǔ)藏時(shí) 期，因此，如何防控好田間黃曲霉菌對(duì)玉米的侵染至關(guān)重要。目前，對(duì)玉米生長(zhǎng)時(shí)期黃曲霉 菌侵染的防控沒有理想的措施，一般以化學(xué)防治為主。由于化學(xué)防治成本較高和易污染環(huán) 境，而且病原物易對(duì)殺菌劑產(chǎn)生耐藥性甚至抗藥性，所以，尋找一種對(duì)人體健康、對(duì)環(huán)境友 好的防控措施勢(shì)在必行。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)自然界中有許多種微生物能抑制和降解生長(zhǎng)期和 儲(chǔ)藏期玉米或飼料中的黃曲霉毒素，這些微生物包括細(xì)菌、酵母菌、霉菌、放線菌及藻類等。 采用微生物制劑或其產(chǎn)生的酶類抑菌降毒，不會(huì)破壞生態(tài)環(huán)境，不降低農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，而且有 些種類還能增加產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
[0004] 以黃曲霉菌及毒素為研究對(duì)象，從健康的玉米籽粒中分離內(nèi)生細(xì)菌，并采用活體 方法篩選拮抗細(xì)菌，研究其抗菌活性，以期為玉米黃曲霉毒素污染的防控瓶頸問題的解決 探索新的途徑。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種具有較強(qiáng)的抑菌和解毒活性的枯草芽孢桿菌JTFM1001。
[0007] 本發(fā)明的另外目的是提供該菌株在防控黃曲霉菌對(duì)玉米污染中的應(yīng)用，以及發(fā)酵 制備防控黃曲霉菌對(duì)玉米污染的微生物有機(jī)肥及其發(fā)酵制備方法。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 一種抗菌解毒的枯草芽孢桿菌JTFM1001，保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2016145,由中國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期:2016年3月28日。
[0009] 枯草芽孢桿菌JTFM1001的分離及篩選方法如下： 選取河北、山東、山西及吉林等省份健康玉米籽粒，將稱重后的玉米籽粒在無菌三角瓶 中用3%次氯酸鈉溶液浸泡10分鐘，最后無菌水沖洗5次，瀝干水分。用鑷子夾住玉米籽粒，將 籽粒用無菌剪刀平均分成3等份，放置在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板中，于28°C恒溫培養(yǎng)，每 天觀察菌落生長(zhǎng)狀況，并及時(shí)挑取特征差異明顯、分離良好的單菌落，進(jìn)一步純化獲得單菌 株，在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上保藏備用。
[0010] 形態(tài)學(xué)特征： 形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，菌株JTFM1001在LJTFM培養(yǎng)基上菌落圓形，邊緣不規(guī)則，表面較光滑，不 產(chǎn)色素;菌體桿狀，大小為(0.9~1.2) umX(2.8~3.2) um;革蘭氏染色陽(yáng)性;產(chǎn)芽孢，芽孢 橢圓形;具有運(yùn)動(dòng)性，證明該菌株為芽孢桿菌。
[0011] 生理生化特征： 菌株JTFM1001接觸酶反應(yīng)、葡萄糖、甘油、D-木糖、淀粉水解、山梨醇、甘露糖、果糖、肌 醇及纖維二糖均為陽(yáng)性，氧化酶、D-阿拉伯糖等試驗(yàn)均為陰性。菌株生理生化測(cè)定結(jié)果見表 1，發(fā)現(xiàn)該菌株與枯草芽孢桿菌的特征基本相似，因此判斷該菌株可能為枯草芽孢桿菌。
[0012] 表1菌株JTFM1001生理生化特性
16S rDNA分子鑒定： 以菌株JTFM1001基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增得到該菌株1.48 kb左右的16S rDNA。 測(cè)序結(jié)果表明該菌株16S rDNA序列長(zhǎng)度為1477 bp(見附件XBLAST分析發(fā)現(xiàn)該菌株的16S rDNA序列與芽孢桿菌屬細(xì)菌的16S rDNA相似，調(diào)出其中已鑒定菌株的16S rDNA，用Clustal W進(jìn)行多重序列對(duì)比。結(jié)合JTFM1001形態(tài)特征及生理生化指標(biāo)測(cè)定等鑒定結(jié)果，通過16S rDNA方法（其16S rDNA如SEQ ID N0:1所示將菌株JTFM1001鑒定為枯草芽孢桿菌。
[0013] 本發(fā)明還提供一種保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2016145的菌株在防控黃曲霉菌對(duì)玉 米污染中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還提供一種保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2016145的菌株在制備防控黃曲霉菌 對(duì)玉米污染的微生物有機(jī)肥中的應(yīng)用。
[0015] 采用保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2016145的菌株發(fā)酵制備防控黃曲霉菌對(duì)玉米污染 的微生物有機(jī)肥。
[0016] 本發(fā)明還提供一種微生物有機(jī)肥，所述有機(jī)肥中保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2016145 的菌株含量在1.5 X 108cfu/g以上，有機(jī)質(zhì)含量為38-45%。
[0017] 本發(fā)明還提供了采用保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2016145的菌株制備的微生物有機(jī) 肥的工業(yè)化生產(chǎn)方法，包括步驟如下： 1)將保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2016145的菌株接種到液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。
[0018] 該液體培養(yǎng)基為：玉米粉3.3%、蛋白胨1.45%、1(2冊(cè)〇4+1012?〇4〇.45%，水100〇1111，口!1 7.0-7.3。
[0019]該發(fā)酵生產(chǎn)的條件為:培養(yǎng)溫度31-34 °C，攪拌速度185-225 rpm，發(fā)酵后使發(fā)酵 液中菌株含量在1 X 1〇9 cfu/ml以上。
[0020] 2)將步驟1)所得發(fā)酵菌液與木薯渣與畜禽糞便混合物進(jìn)行固體發(fā)酵，調(diào)節(jié)含水 量，每噸固體有機(jī)肥中加入發(fā)酵菌液20L，發(fā)酵兩天后進(jìn)行翻料，以后每天進(jìn)行翻堆，5-7天 即可發(fā)酵結(jié)束。
[0021] 3 )將固體發(fā)酵后的有機(jī)肥在彡60 °C干燥至含水量彡30%即可包裝成品。
[0022] 本發(fā)明提供的微生物有機(jī)肥的工業(yè)化生產(chǎn)方法的優(yōu)選技術(shù)方案如下： 步驟1)中所述K2HP〇4和KH2P〇4的重量比為1:1。
[0023] 步驟1)中所述液體培養(yǎng)基在115-125°C滅菌15-30min，優(yōu)選在121°C滅菌20min。
[0024] 步驟2 )中所述木薯渣與畜禽糞便混合物經(jīng)過85 °C腐熟。
[0025]步驟2)中所述木薯渣與畜禽糞便的發(fā)芽指數(shù)多95%，有機(jī)質(zhì)含量多35%，含水量質(zhì) 量比 20-25%。
[0026]本發(fā)明還提供一種所述微生物有機(jī)肥料在防治玉米上黃曲霉菌中的應(yīng)用。
[0027] 采用上述技術(shù)方案的本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益的技術(shù)效果如下： 1、保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2016145枯草芽孢桿菌JTFM1001是從河北玉米籽粒中分離 獲得，經(jīng)室內(nèi)對(duì)峙拮抗實(shí)驗(yàn)、活體抑菌解毒實(shí)驗(yàn)和田間防治試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株抑菌能力較 強(qiáng)，抑菌解毒效果好且穩(wěn)定，容易培養(yǎng)，無污染，對(duì)環(huán)境安全。
[0028] 2、本發(fā)明提供含有該菌株的有機(jī)肥，該有機(jī)肥施入土壤后，該菌株能夠在作物根 際快速繁殖并長(zhǎng)期生存，形成優(yōu)勢(shì)菌群，施用本微生物有機(jī)肥既能防治黃曲霉毒素對(duì)農(nóng)產(chǎn) 品的污染，同時(shí)能減少化學(xué)農(nóng)藥的殘留，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)種植及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全應(yīng)用中前景廣 闊。
[0029] 菌株保藏情況:保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)，保藏地址為中國(guó). 武漢.武漢大學(xué)。保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2016145,分類命名為枯草芽孢桿菌JTFM1001，拉 丁文名稱：Bacillus amyloliquefaciens JTFM1001。保藏日期為 2016年3月28日。
[0030]
【附圖說明】
[0031] 圖1為本發(fā)明枯草芽孢桿菌JTFM1001對(duì)黃曲霉的拮抗作用圖。
[0032]圖2為本發(fā)明枯草芽孢桿菌JTFM1001對(duì)玉米籽粒上黃曲霉毒素的抑制能力。
[0033] 圖3為本發(fā)明雙抗生防菌株存活時(shí)間圖。
[0034]
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合具體實(shí)施例為本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，但不能將方案中所涉及的方法 及技術(shù)參數(shù)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0036] 實(shí)施例1:保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2016145的菌株的分離和鑒定 選取河北、山東、山西及吉林等省份健康玉米籽粒，將稱重后的玉米籽粒在無菌三角瓶 中用3%次氯酸鈉溶液浸泡10分鐘，最后無菌水沖洗5次，瀝干水分。用鑷子夾住玉米籽粒，將 籽粒用無菌剪刀平均分成3等份，放置在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板中，于28°C恒溫培養(yǎng)，每 天觀察菌落生長(zhǎng)狀況，并及時(shí)挑取特征差異明顯、分離良好的單菌落，進(jìn)一步純化獲得單菌 株，在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上保藏備用。
[0037] 形態(tài)學(xué)特征： 形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，菌株JTFM1001在LJTFM培養(yǎng)基上菌落圓形，邊緣不規(guī)則，表面較光滑，不 產(chǎn)色素;菌體桿狀，大小為(0.9~1.2) umX(2.8~3.2) um;革蘭氏染色陽(yáng)性;產(chǎn)芽孢，芽孢 橢圓形;具有運(yùn)動(dòng)性，證明該菌株為芽孢桿菌。
[0038] 生理生化特征： 菌株JTFM1001接觸酶反應(yīng)、葡萄糖、甘油、D-木糖、淀粉水解、山梨醇、甘露糖、果糖、肌 醇及纖維二糖均為陽(yáng)性，氧化酶、D-阿拉伯糖等試驗(yàn)均為陰性。菌株生理生化測(cè)定結(jié)果見表 1，發(fā)現(xiàn)該菌株與枯草芽孢桿菌的特征基本相似，因此判斷該菌株可能為枯草芽孢桿菌。
[0039] 表1菌株JTFM1001牛理?；匦?br>16SrDNA分子鑒定： 以菌株JTFM1001基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增得到該菌株1.48 kb左右的16S rDNA。 測(cè)序結(jié)果表明該菌株16S rDNA序列長(zhǎng)度為1477 bp(見附件XBLAST分析發(fā)現(xiàn)該菌株的16S rDNA序列與芽孢桿菌屬細(xì)菌的16S rDNA相似，調(diào)出其中已鑒定菌株的16S rDNA，用Clustal W進(jìn)行多重序列對(duì)比。結(jié)合JTFM1001形態(tài)特征及生理生化指標(biāo)測(cè)定等鑒定結(jié)果，通過16S rDNA方法（其16S rDNA如SEQ ID N0:1所示將菌株JTFM1001鑒定為枯草芽孢桿菌。
[0040] 實(shí)施例2:保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2016145的菌株對(duì)玉米黃曲霉菌的抑制效果實(shí) 驗(yàn) 枯草芽孢桿菌JTFM1001等生防菌株的生物活性測(cè)定： (1)枯草芽孢桿菌JTFM1001作用:采用對(duì)峙培養(yǎng)法對(duì)黃曲霉菌內(nèi)生拮抗細(xì)菌進(jìn)行篩選。 將預(yù)先準(zhǔn)備好的黃曲霉菌菌碟置于斜面培養(yǎng)基平板中央，然后用高溫滅菌的牙簽蘸取內(nèi)生 細(xì)菌，等距離(距病原菌2cm處)對(duì)稱點(diǎn)接到斜面培養(yǎng)基平板上，于28°C黑暗培養(yǎng)，3-7d觀察 抑菌帶的有無及大小，重復(fù)3次。選出抑菌帶較寬的內(nèi)生細(xì)菌菌株在花生顆粒上進(jìn)行復(fù)篩。 所實(shí)驗(yàn)的350株菌株中，枯草芽孢桿菌JTFM1001菌株對(duì)黃曲霉菌的抑制作用最強(qiáng)，見圖1，表 2指出所應(yīng)用的效果較好10株生防菌對(duì)黃曲霉菌的抑制率。
[0041 ] 表2枯草芽孢桿菌JTFM1001等生防菌株對(duì)黃曲霉菌的抑制率(％)
注:表中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為三次重復(fù)的平均值。
[0042] (2)枯草芽孢桿菌JTFM1001等8株生防菌活體生防效果實(shí)驗(yàn) :⑩拮抗菌發(fā)酵液的準(zhǔn)備：用挑針挑取離體試驗(yàn)中具有抑菌活性的拮抗細(xì)菌菌株 JTFM1001等菌株的單菌落，轉(zhuǎn)移至裝有50mL NB培養(yǎng)液的三角瓶中，于28°C、150r · min-1振 蕩培養(yǎng)Id。吸lmL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至裝有50mL NB培養(yǎng)液的三角瓶中，28°C、150r · min-1振蕩培 養(yǎng)2d，獲得拮抗菌株的發(fā)酵液。
[0043] 拮抗細(xì)菌的活體篩選:把上述發(fā)酵2天的拮抗菌發(fā)酵液，孢子最終濃度為1.5.0 X106孢子· ml/1和培養(yǎng)7天生長(zhǎng)旺盛的黃曲霉菌菌懸液，孢子最終濃度為1.5.0X106孢 子· ml/1分別浸泡玉米種30min，陰涼處被干后放入無菌平板，每板30粒玉米，放入光照培養(yǎng) 箱培養(yǎng)l〇d。
[0044] 培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為:溫度28°C，濕度70-80%，光照為12 h黑暗/12 h光照。以不浸菌 液為空白對(duì)照，每處理設(shè)3次重復(fù)。計(jì)算生防菌對(duì)黃曲霉菌防治效果及抑毒率，見表3和圖2。
[0045] 結(jié)果表明獲得的內(nèi)生細(xì)菌在籽粒上表現(xiàn)出較好防病效果，對(duì)黃曲霉菌毒素污染抑 制率較高。較好的8株拮抗細(xì)菌對(duì)黃曲霉菌的防病效果分別達(dá)42.5%-75.0%，其中，菌株 JTFM1001對(duì)黃曲霉菌的防效最高，達(dá)75.0%，其次為菌株JTFM96-1和JTFM88-5，防效分別為 71.5%和68.5%。抑毒效果較好的菌株分別為1^11001、1^121-3及1^141-1，抑制率分別為 70.5%、68.5%及62.7%。
[0046] 表3 8株拮抗菌對(duì)黃曲霉菌的防治效果及抑毒率 ' 注:i據(jù)為三沒重復(fù)的平均值 '
' ' ' ' ' 實(shí)施例3:保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2016145的菌株發(fā)酵制備微生物有機(jī)肥及其制備方 法 采用保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2016145的菌株發(fā)酵制備防控田間黃曲霉菌對(duì)玉米污染 的微生物有機(jī)肥，該有機(jī)肥中保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2016145的菌株含量在1.5X 108cfu/g以上，有機(jī)質(zhì)含量為38-45%。
[0047]該微生物有機(jī)肥的工業(yè)化生產(chǎn)方法，步驟如下： 1) 將保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2016145的菌株接種到液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。 [0048] 該液體培養(yǎng)基為:玉米粉3.3%(按重量比計(jì)）、蛋白胨1.45%(按重量比計(jì)）、K2HP〇4+ ΚΗ2Ρ〇4〇·45%(按重量比計(jì)），水 1000ml，pH 7.2。
[0049] 其中K2HP〇4和KH2P〇4的重量比為1:1。
[0050] 其中液體培養(yǎng)基在121Γ滅菌20min。
[00511該發(fā)酵生產(chǎn)的條件為:培養(yǎng)溫度32-35 °C，攪拌速度185-225 rpm，發(fā)酵后使發(fā)酵 液中菌株含量在1X109 cfu/ml以上； 2) 將步驟1)所得發(fā)酵菌液與木薯渣與畜禽糞便混合物進(jìn)行固體發(fā)酵，調(diào)節(jié)含水量，每 噸固體有機(jī)肥中加入發(fā)酵菌液20L，發(fā)酵兩天后進(jìn)行翻料，以后每天進(jìn)行翻堆，6天即可發(fā)酵 結(jié)束。
[0052]其中木薯渣與畜禽糞便混合物經(jīng)過85 °C腐熟。
[0053]其中木薯渣與畜禽糞便的發(fā)芽指數(shù)多95%，有機(jī)質(zhì)含量多35%，含水量質(zhì)量比20- 25%〇
[0054] 3 )將固體發(fā)酵后的有機(jī)肥在彡60 °C干燥至含水量彡30%即可包裝成品。
[0055]實(shí)施例4:保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2016145的菌株發(fā)酵制備微生物有機(jī)肥對(duì)玉米 黃曲霉菌的抑制效果實(shí)驗(yàn) 枯草芽孢桿菌JTFM1001生物菌肥田間防效、抑毒率及促生作用 田間試驗(yàn)小區(qū)隨機(jī)設(shè)計(jì)，3個(gè)重復(fù)，每個(gè)小區(qū)的面積為15mX3m。將生防制劑以每畝4公 斤（1.5X108孢子)，于玉米播種時(shí)隨肥料施入，設(shè)置化學(xué)防治方法(70 %甲基托布津 可濕性粉劑〇.5g/棵）及對(duì)照，農(nóng)藥的施用方法同生防制劑。花生收獲后每處理隨機(jī)調(diào)查4 個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)10株。計(jì)算拮抗菌抑毒率及對(duì)玉米促生效果，結(jié)果見表4和圖3。
[0056]結(jié)果表明獲得的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)玉米生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的促生效果，對(duì)黃曲霉菌毒素污 染抑制率較高。較好的8株拮抗細(xì)菌對(duì)玉米促生效果最高可達(dá)6.5%，其中，菌株JTFM1001對(duì) 黃曲霉菌的效果最高，為6.5%，其次為菌株1^121-3和1^196-1，促生效果分別為3.5%和 3.1%。抑毒效果較好的菌株分別為JTFM1001、JTFM96-1及JTFM41-1，抑制率分別為55.0%、 44.5%及33.2%。
[0057]表4拮抗菌對(duì)黃曲霉菌產(chǎn)毒抑制率及對(duì)玉米促生效果
代謝物對(duì)黃曲霉菌的抑制作用 生防菌代謝產(chǎn)物的制備 生防菌JTFM1001在LB斜面上活化后，取一環(huán)于LB培養(yǎng)液中，100mL/300 mL裝液量，37 °C，160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，制備成以下處理液:上清液:培養(yǎng)液在12000 r/min下離心 15 min，取上清，用0.22μπι細(xì)菌過濾器過濾后得到無菌的上清液。
[0058] 菌懸液:培養(yǎng)液在12000 r/min下離心15 min，棄上清，用無菌水清洗3次再離心， 加入無菌水。
[0059] 蛋白粗提液:培養(yǎng)液于4°C下12000 r/min離15min棄沉淀，在上清液中加固體硫酸 銨至70%飽和度，4 °C靜置過夜，于4 °C下10000 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀用1/25 體積10 mmol/L，pH7.0磷酸緩沖液懸浮，然后用0.22μπι細(xì)菌過濾器過濾除掉可能存在的細(xì) 菌。
[0060] 生防菌代謝產(chǎn)物對(duì)黃曲霉菌菌絲生長(zhǎng)的影響 測(cè)定方法:取黃曲霉菌菌懸液1 X 1〇6 5mL，放入溫度降到45°C左右斜面培養(yǎng)基三角瓶 中（100mL/350mL)，搖晃2min后，均勻的倒入培養(yǎng)皿中。用打孔器在斜面培養(yǎng)基平板周圍等 距離打3個(gè)孔，用移液槍分別加入3 mL上清液、過濾液、冷凍上清液、冷凍過濾液及蛋白粗提 液，30 °C培養(yǎng)5天待CK長(zhǎng)滿平板時(shí)檢測(cè)各處理抑菌圈的半徑，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。
[0061 ] 同時(shí)，研究了生防菌上清液和過濾液在50、60、70、80、90、100 °C下的熱穩(wěn)定性實(shí) 驗(yàn)，熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)在水浴鍋中浸加熱1 h，121°C溫度下處理20 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5和表6。 [0062]結(jié)果顯示生防菌培養(yǎng)液對(duì)黃曲霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用均為100%;蛋白粗提液的 抑制作用也很強(qiáng)，達(dá)到90%以上;生防菌過濾液和凍過濾抑菌率均在35%以上，其中JTFM1001 抑菌率最強(qiáng)，分別達(dá)到62.5%和55.5%，其次是JTFM96-1，達(dá)到56.5%和52.0%;生防菌的上清 液和凍上清抑菌率在50%以上，其中JTFM1001抑菌率最強(qiáng)，分別達(dá)到67.0%和68.5%，其次是 JTFM96-1，達(dá)到 62.5% 和 55.2%，見表 5。
[0063]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高溫對(duì)一些生防菌代謝產(chǎn)物能產(chǎn)生顯著影響，其中菌株JTFM1001、 JTFM88-5和JTFM101-1，超過60°C將失去對(duì)黃曲霉菌孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，說 明這3株生防菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)對(duì)熱敏感，見表6。
[0064]表5生防菌代謝產(chǎn)物對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)的抑制作用 ? ?： ? ；：i S：
S ? 表5溫度對(duì)生防菌代謝產(chǎn)物的影響作用
生防菌的定殖試驗(yàn) Rif和Nal雙抗標(biāo)記菌株的制備 在LB液體培養(yǎng)基中37 °C過夜搖培JTFM1001菌株，5000rpm，離心2min收集菌體，均勻的 涂在含有Nal抗生素（終濃度為SOyg/mL )的LB平板上，35°C靜置培養(yǎng)。待平板上長(zhǎng)出抗Nal 的單菌落時(shí)，挑選出長(zhǎng)勢(shì)好的單菌落劃線接種在含有Nal的LB平板上，連續(xù)轉(zhuǎn)接3代，如果該 菌落長(zhǎng)勢(shì)穩(wěn)定且與野生型菌株差異不大，則選為誘導(dǎo)得到抗Nal的突變菌株，命名為 JTFM1001-N。
[0065]在含有Nal抗生素(終濃度為50 yg/rnL )的LJTFM液體培養(yǎng)基上35°C過夜搖培突變 菌株JTFM1001-N，5000rpm，離心2min收集菌體，均勻的涂在含有Nal + Rif抗生素(Nal，50 ug/ml;Rif，150 ug/ml)的LB雙抗平板上，35°C靜置培養(yǎng)。待平板上長(zhǎng)出抗Nal+Rif的單菌 落時(shí)，挑選出長(zhǎng)勢(shì)最好的單菌落劃線接種在含有Nal + Rif的LB平板上，連續(xù)轉(zhuǎn)接3代，如果 該菌落長(zhǎng)勢(shì)穩(wěn)定且與野生型菌株差異不大，則為誘導(dǎo)得到抗Nal+Rif的突變菌株，命名為 JTFM JTFM1001-NR。
[0066] JTFM1001-NR菌株孢懸液的制備及玉米種子土壤處理 玉米種子用1.5X108 CFU/ml JTFM1001-NR菌株的孢懸液浸泡5min，種植于準(zhǔn)備好的 土壤中，兩天后再用孢懸液灌根，每穴l〇ml。澆灌1天后采集第一次的樣品，3天后第二次采 集樣品，以后每5天收集一次，連續(xù)檢測(cè)6周。準(zhǔn)確稱取待測(cè)土樣1克，放入裝有9ml無菌水的 試管中，渦旋振蕩3min，使土壤中的微生物充分分散，靜置lmin，即為ΠΓ1稀釋液，用10-3和 10一4的稀釋液涂雙抗LJTFM平板(Nal，12. Syg/mL ; Rif，50此/ml)，35°C培養(yǎng)48h，對(duì)生防菌 定殖量的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，見圖3。
[0067] 本領(lǐng)域技術(shù)人員不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和精神，可以有多種方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，以上 所述僅為本發(fā)明較佳可行的實(shí)施例而已，并非因此局限本發(fā)明的權(quán)利范圍，凡運(yùn)用本發(fā)明 說明書及附圖內(nèi)容所作的等效變化，均包含于本發(fā)明的權(quán)利范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗菌解毒的枯草芽孢桿菌JTFM1001菌株，其特征在于，保藏編號(hào)為CCTCC NO:Μ 2016145，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期:2016年3月28日。2. 如權(quán)利要求1所述的保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2016145的菌株在防控黃曲霉菌對(duì)玉米 污染中的應(yīng)用。3. 如權(quán)利要求1所述的保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2016145的菌株在制備防控黃曲霉 菌對(duì)玉米污染的微生物有機(jī)肥中的應(yīng)用。4. 一種微生物有機(jī)肥，其特征在于，所述有機(jī)肥中保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2016145的 菌株含量在1.5 X 108cfu/g以上，有機(jī)質(zhì)含量為38-45%。5. 如權(quán)利要求3或4所述的微生物有機(jī)肥的工業(yè)化生產(chǎn)方法，包括步驟如下： 1) 將保藏編號(hào)為CCTCC N0:M 2016145的菌株接種到液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)； 該液體培養(yǎng)基為：玉米粉3.3%、蛋白胨1.45%、K2HP〇4+KH 2P〇4 0.45%，水 1000ml，pH 7.0- 7.3； 該發(fā)酵生產(chǎn)的條件為:培養(yǎng)溫度31-34 °C，攪拌速度185-225 rpm，發(fā)酵后使發(fā)酵液中 菌株含量在1X109 cfu/ml以上； 2) 將步驟1)所得發(fā)酵菌液與木薯渣與畜禽糞便混合物進(jìn)行固體發(fā)酵，調(diào)節(jié)含水量，每 噸固體有機(jī)肥中加入發(fā)酵菌液20L，發(fā)酵兩天后進(jìn)行翻料，以后每天進(jìn)行翻堆，5-7天即可發(fā) 酵結(jié)束； 3) 將固體發(fā)酵后的有機(jī)肥在彡60°C干燥至含水量彡30%即可包裝成品。6. 如權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟1)中所述K2HP〇4和KH2P〇4的重量比為 1:1〇7. 如權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟1)中所述液體培養(yǎng)基在115-125 °C 滅菌15-30 min，優(yōu)選在121°C滅菌20min。8. 如權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟2 )中所述木薯渣與畜禽糞便混合物 經(jīng)過85 °C腐熟。9. 如權(quán)利要求5或8所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟2)中所述木薯渣與畜禽糞便的 發(fā)芽指數(shù)彡95%，有機(jī)質(zhì)含量彡35%，含水量質(zhì)量比20-25%。10. 如權(quán)利要求3至9任一項(xiàng)所述微生物有機(jī)肥在防治玉米上黃曲霉菌中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C05F15/00GK105838643SQ201610282974
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月3日
【發(fā)明人】姚彥坡, 鄭百芹, 李愛軍, 張建民, 董李學(xué), 蒙君麗
【申請(qǐng)人】唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心