一種高效液相色譜法檢測(cè)阿卡波糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，具體涉及一種高效液相色譜法檢測(cè)阿卡波糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿卡波糖(Acarbose)是一種從放線菌中分離得到的由四個(gè)單糖構(gòu)成的寡糖，對(duì)小 腸壁細(xì)胞刷狀緣的α-葡萄糖苷酶具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，能阻礙腸道內(nèi)的多糖和低聚糖的水 解，從而減少小腸對(duì)單糖的吸收，達(dá)到降低餐后血糖濃度的目的，是II型糖尿病的常用藥物 之一。
[0003] 2015版中國(guó)藥典增收了阿卡波糖的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其含量測(cè)定的方法為高效液相色譜 法，與歐洲藥典中收錄的方法一致。該方法采用氨基色譜柱，紫外檢測(cè)器，以乙腈-磷酸鹽緩 沖液(75:25)為流動(dòng)相，在2mL · mirT1的流速，210nm檢測(cè)波長(zhǎng)，35°C柱溫的條件下進(jìn)行測(cè)定。 但采用這種方法進(jìn)行測(cè)定無(wú)法實(shí)現(xiàn)阿卡波糖(其結(jié)構(gòu)式為下式I)與雜質(zhì)A(其結(jié)構(gòu)式為下式 II)的完全分離，因此只能采用峰谷比進(jìn)行限定，并且存在有關(guān)物質(zhì)干擾大、及柱流失嚴(yán)重 等問(wèn)題。
[0005] 目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于阿卡波糖的檢測(cè)方法有HPLC-UV、HPLC-ELSD、HPLC-RID及CE法。 Xie等將C18水相柱用于阿卡波糖的含量測(cè)定，但流動(dòng)相中需添加離子對(duì)試劑;HPLC-ELSD/ RID法主要用于阿卡波糖原料藥或發(fā)酵液中無(wú)生色團(tuán)雜質(zhì)（葡萄糖、麥芽糖）的分離。 B. Lachmann等利用CE法對(duì)阿卡波糖及其代謝物進(jìn)行了分析研究。這些方法主要是針對(duì)于阿 卡波糖或阿卡波糖代謝物等，并未很好地解決阿卡波糖及其雜質(zhì)分離效果差、有關(guān)物質(zhì)干 擾大、及柱流失嚴(yán)重等問(wèn)題。
[0006] 現(xiàn)有阿卡波糖檢測(cè)方法中阿卡波糖無(wú)法與雜質(zhì)A實(shí)現(xiàn)完全分離，不能更好地控制 阿卡波糖的產(chǎn)品質(zhì)量;且現(xiàn)有檢測(cè)方法流速快、運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)、試劑消耗量大；以及氨基柱鍵 合相易流失，色譜柱壽命短，給分析工作帶來(lái)不便，檢測(cè)成本高等一系列問(wèn)題。因此，迫切需 要一種分離度良好、柱穩(wěn)定性高的測(cè)定阿卡波糖及其雜質(zhì)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種準(zhǔn)確度高、柱穩(wěn)定性好的高效液相色譜法檢測(cè)阿卡波糖的方法， 實(shí)現(xiàn)了阿卡波糖與雜質(zhì)A的完全分離，從而可以更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。
[0008] 本發(fā)明提供了一種高效液相色譜法檢測(cè)阿卡波糖的方法，采用如下色譜條件：
[0009] 色譜柱：XBridge Amide柱（waters,4.6mmX250mm,3·5μηι);
[0010] 流動(dòng)相:有機(jī)相-水相；
[0011] 流速：1.0-1.4mL/min;
[0012] 檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm;
[0013] 柱溫：60-70°C;
[0014] 進(jìn)樣量：10-20yL;
[0015] 檢測(cè)器采用紫外檢測(cè)器；
[0016] 所述流動(dòng)相中的有機(jī)相為乙腈，所述流動(dòng)相中含有乙酸銨，乙酸銨濃度范圍為5-10mM，pH 范圍為 5.0-10.0;
[0017]所述流動(dòng)相中有機(jī)相-水相的體積比例為75:25-80:20。
[0018]所述流動(dòng)相優(yōu)選為預(yù)混流動(dòng)相，即提前將乙腈、水和乙酸銨緩沖液按比例混合均 勻后使用。與在先混合緩沖鹽相比，預(yù)混流動(dòng)相可以避免高濃度時(shí)乙腈鹽析出，重現(xiàn)性好， 可以更好地減少基線噪音和溶劑峰。
[0019] 本發(fā)明提供的一種高效液相色譜法檢測(cè)阿卡波糖的方法，色譜條件優(yōu)選為:流動(dòng) 相中有機(jī)相-水相的體積比例為75:25;流動(dòng)相中乙酸銨濃度為10mM，pH為9.0;流速:1.2mL/ min，柱溫:65 °C，進(jìn)樣體積：20yL。
[0020] 本發(fā)明提供的一種高效液相色譜法檢測(cè)阿卡波糖的方法，其特征為：
[0021] (1)稱取適量的阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品溶解于流動(dòng)相中，得阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液備用；
[0022] (2)稱取適量的阿卡波糖樣品溶解于流動(dòng)相中，得阿卡波糖樣品溶液備用；
[0023] (3)取阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液，注入高效液相色譜儀，按照上述色譜條件 進(jìn)行高效液相色譜分析。
[0024]本發(fā)明選用的色譜柱為XBridge Amide色譜柱，使用了化學(xué)穩(wěn)定的、三鍵鍵合式的 酰胺官能團(tuán)，其選擇性與氨基柱相近，且基于亞乙基橋雜化顆粒技術(shù)，色譜柱耐受性更強(qiáng)， PH2-11條件下均可以檢測(cè)，極端pH條件下最高柱溫可達(dá)90°C，相對(duì)于現(xiàn)有方法中規(guī)定的氨 基鍵合相的穩(wěn)定性更高，柱流失減少，壽命更長(zhǎng)。
[0025]本發(fā)明提供的高效液相色譜法檢測(cè)阿卡波糖的方法，與現(xiàn)有方法相比，具有明顯 的優(yōu)點(diǎn)：實(shí)現(xiàn)了阿卡波糖與雜質(zhì)A的完全分離，并且多分離出一種未知雜質(zhì)，更好的實(shí)現(xiàn)阿 卡波糖的質(zhì)量控制，提高了分析的準(zhǔn)確性;各雜質(zhì)的專屬性、線性及范圍、回收率、精密度、 耐用性等試驗(yàn)均良好;所選色譜柱柱穩(wěn)定性好;且流動(dòng)相配制簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為雜質(zhì)A與阿卡波糖對(duì)照品混合液色譜圖；其中，1-阿卡波糖，4-雜質(zhì)A;
[0027] 圖2為峰鑒別阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；其中，1-阿卡波糖，2-雜質(zhì)D，3_雜質(zhì)B，4_雜 質(zhì)A，5-新雜質(zhì)，6-雜質(zhì)C，7-雜質(zhì)E，8-雜質(zhì)F，9-雜質(zhì)G;
[0028] 圖3為EDQM提供的峰鑒別阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；
[0029] 圖4為實(shí)施例1的阿卡波糖供試品色譜圖；其中，1-阿卡波糖，4-雜質(zhì)A，5_新雜質(zhì)；
[0030] 圖5為對(duì)比例1的阿卡波糖供試品色譜圖；其中，1-阿卡波糖，4-雜質(zhì)A。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 本發(fā)明一種高效液相色譜法檢測(cè)阿卡波糖的方法，步驟包括:配置阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn) 品溶液備用;配置阿卡波糖樣品溶液備用;取阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液，注入高效液 相色譜儀，進(jìn)行高效液相色譜分析。
[0032] 其中，高效液相色譜分析中的色譜條件的選擇，對(duì)本發(fā)明提高分析的準(zhǔn)確性而言 是重要的。尤其是本發(fā)明將XBridge Amide柱作為高效液相色譜法檢測(cè)阿卡波糖的色譜柱， 較之現(xiàn)有的高效液相色譜法檢測(cè)阿卡波糖的氨基柱效果好。具體而言，色譜條件為：色譜 柱：XBridge Amide柱(waters，4·6mmX 250mm，3· 5μηι);流動(dòng)相組成：乙臆-水（75: 25，v/v)， 含10mM乙酸銨緩沖鹽(pH 9.0);所用紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng):210nm;流速：1.2mL/min;柱 溫:65°C;進(jìn)樣體積:20yL。本發(fā)明通過(guò)前期大量實(shí)驗(yàn)摸索，綜合考慮阿卡波糖的保留時(shí)間及 與雜質(zhì)的分離情況，最終確定流動(dòng)相中乙腈-水的體積比為75:25-80:20，優(yōu)選流動(dòng)相中乙 腈-水的體積比為75: 25。選用L934正交表，考察流動(dòng)相pH、柱溫、鹽濃度和流速4個(gè)高效液相 色譜方法條件參數(shù)，具體如下：
[0033] 因素 A:流動(dòng)相pH。考察酸性、中性和堿性條件對(duì)阿卡波糖峰型及保留的影響，故設(shè) 定以下水平:①3.0②6.8③9.0。
[0034]因素 B:柱溫。預(yù)實(shí)驗(yàn)中35°C條件下阿卡波糖存在雙峰現(xiàn)象，考慮到糖類α、β異構(gòu)體 間的轉(zhuǎn)化率隨溫度變化而變化，提高溫度可使分裂峰合并為單峰。故考察的水平為①45°C ②55°C ③65°C。
[0035] 因素 C:流動(dòng)相中的鹽濃度。為得到良好的峰型和保留作用，在流動(dòng)相中添加緩沖 鹽，結(jié)合所用色譜柱性質(zhì)，優(yōu)選乙酸銨。考察水平為①5mM②10mM③20mM。
[0036] 因素 D:流速。流速不僅影響著保留時(shí)間，也與化合物間的分離情況有關(guān)。設(shè)定以下 水平考察:①1.0mL/min ②1.2mL/min ③1.4mL/min。
[0037] 每個(gè)試驗(yàn)條件下進(jìn)樣順序分別如下：
[0038] (1)空白（流動(dòng)相）
[0039] (2)雜質(zhì)A與阿卡波糖對(duì)照品混合液
[0040] (3)峰鑒別阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液
[0041]優(yōu)劣判斷因素 :①可分離的雜質(zhì)個(gè)數(shù)η;②阿卡波糖色譜峰的拖尾因子T;③雜質(zhì)A 與主峰的分離度R。
[0042] 表1列出了正交試驗(yàn)的因素與水平組合及相應(yīng)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，按照主峰拖尾因子越 接近1.0越好、雜質(zhì)個(gè)數(shù)越多越好、雜質(zhì)A與主峰分離度越大越好的原則，對(duì)它們分別按單指 標(biāo)進(jìn)行極差分析，計(jì)算結(jié)果如表2所示。
[0043]表1方法條件參數(shù)的正交試驗(yàn)結(jié)果
[0044]
[0045] 備注:試驗(yàn)序號(hào)1條件下，阿卡波糖峰為雙峰，主峰拖尾因子以"一一"表示
[0046] 表2極差分析表
[0047]
[0048] 根據(jù)表2和表3的結(jié)果顯示，對(duì)于主峰拖尾因子而言，因素主次順序?yàn)?D>A(B)> C，優(yōu)選方案為:A3B3C3D1;
[0049]對(duì)于雜質(zhì)個(gè)數(shù)而言，因素主次順序?yàn)?A>B(D)>C，優(yōu)選方案為：A3B2C1(C2)D1 (D2);
[0050] 對(duì)于雜質(zhì)A與主峰分離度而言，因素主次順序?yàn)椋篈>D>C>B，優(yōu)選方案為： A3B2C2D1。
[0051] 由于對(duì)于不同指標(biāo)而言，因素主次、水平優(yōu)劣差異較大，確定整體最優(yōu)因素水平， 有一定難度，因此綜合各指標(biāo)的優(yōu)選方案初步確定整體較優(yōu)組合，通過(guò)再次試驗(yàn)，確定最優(yōu) 組合。其中因素 A選定水平3;因素 B可選水平2或3;因素 C在三項(xiàng)指標(biāo)中影響均較小，選定中 間值水平2;因素 D可選水平1或2。故綜合平衡因素水平初步確定的較優(yōu)組合為A3B3C2D1、 A3B2C2D1、A3B3C2D2或A3B2C2D2。
[0052] 為了確定最優(yōu)組合，對(duì)四種可能的組合進(jìn)行再次試驗(yàn)，具體結(jié)果見(jiàn)表3數(shù)據(jù)所示。
[0053] 表3組合篩選再試驗(yàn)結(jié)果
[0055] 表3顯示，四種條件下，主峰均有良好的對(duì)稱性，從雜質(zhì)A與主峰分離度來(lái)看， A3B3C2D1、A3B3C2D2 優(yōu)于 A3B2C2DUA3B2C2D2,而 A3B3C2D2 的保留時(shí)間要比 A3B3C2D1 的更短 一些，所以選定的最優(yōu)組合為A3B3C2D2。故本發(fā)明最優(yōu)選的色譜條件參數(shù)為:pH 9.0，柱溫 65°C，鹽濃度為 10mM，流速 1.2mL/min。
[0056] 本發(fā)明色譜條件中色譜柱和流動(dòng)相的配合使用，更好的實(shí)現(xiàn)阿卡波糖的質(zhì)量控 制，提高了分析的準(zhǔn)確性。
[0057] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于實(shí) 施例。
[0058]在下面的各實(shí)施例中，所用儀器的信息如下：
[0059] 高效液相色譜儀系統(tǒng)：型號(hào)：島津LC-20A，包括LC-20AT栗;DGU-20A脫氣機(jī);SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器;CTO-lOASvp柱溫箱；SPD-20A紫外檢測(cè)器;Lab solution色譜工作站；
[0060] Waters XBridge Amide色譜柱：規(guī)格4.6mmX250mm,3·5μηι粒徑；
[0061 ]萬(wàn)分之一電子天平:AR1140型，Ohaus Corp.Brook，NJ，USA;
[0062] 十萬(wàn)分之一電子天平:MS105Du型，METTLER TOLEDO;
[0063] 電子pH計(jì):pH Meter PHS-3C型，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；
[0064] 超聲波清洗器:SK250HP型，無(wú)錫建儀實(shí)驗(yàn)器材有限公司。
[0065]在下面的實(shí)施例中，所用的各試劑信息如下：
[0066] 阿卡波糖對(duì)照品：中國(guó)食品藥品檢定研究所，批號(hào)：100808-201203，含量95.8% ;
[0067] 峰鑒別阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品：ACARB0SE FOR PEAK IDENTIFICATION CRS(20mg，含有A、 B、C、D、E、F