專利名稱：一種表達(dá)β-半乳糖苷酶的重組菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)β-半乳糖苷酶的重組菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于生物 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
β -半乳糖苷酶(EC 3. 2. 1. 23)學(xué)名為β -D-半乳糖苷半乳糖水解酶(以下簡稱 半乳糖苷酶)，常用名為乳糖酶，該酶能將乳糖水解成為半乳糖與葡萄糖。半乳糖苷酶最早用于乳制品產(chǎn)業(yè)，由于牛奶在西方人的飲食結(jié)構(gòu)中占有很大比 重，所以國外對半乳糖苷酶的研究較早，許多研究工作主要集中在低乳糖奶加工和乳糖不 耐癥(Lactose Intolerance)的診斷治療上。乳糖是哺乳動物乳汁中特有的糖類，哺乳動物 乳汁中乳糖含量因種類而異，人乳中乳糖含量為6. 7% .，牛乳中乳糖平均含量為4. 5-5%。 盡管牛乳及其乳制品具有“近乎完美的食物”的美譽(yù)，但在我國，乳制品的發(fā)展仍處于初級 階段，其中乳糖不耐癥是限制其發(fā)展的主要原因之一。由于乳糖需經(jīng)過由小腸粘膜上皮細(xì) 胞分泌的半乳糖苷酶水解成半乳糖和葡萄糖后才能被人體吸收利用，所以乳糖不耐癥的病 因主要是由于小腸粘膜上半乳糖苷酶活力較低所致。牛乳中乳糖得不到水解，小腸內(nèi)乳糖 濃度提高，使?jié)B透壓增高，從而導(dǎo)致進(jìn)入腸腔內(nèi)的水分含量提高，其產(chǎn)生的癥狀是腹部壓力 增高、氣脹、腹痛和腹瀉。絕大多數(shù)哺乳動物出生之后小腸粘膜乳糖酶活性較高，可以消化 吸收來自母乳或其他乳制品的乳糖，斷乳之后，乳糖酶活性隨年齡增長逐漸下降，到成人之 后半乳糖苷酶活性僅為正常嬰兒水平的5-10%，并逐漸發(fā)展成為乳糖不耐癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)乳糖 不耐癥影響著全世界約70%的人(尤其是亞洲和非洲人)對乳的攝入。生產(chǎn)低乳糖奶，是目前克服乳糖不耐癥的最好方法。經(jīng)典方法是將新鮮牛乳經(jīng)巴 氏滅菌后，冷卻至40-45°C，加入半乳糖苷酶并保溫，使乳糖水解。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)乳糖水解率為 70-80%時(shí)，既能解決乳糖不耐癥問題，又能生產(chǎn)出風(fēng)味良好的產(chǎn)品。低乳糖奶的生產(chǎn)國外 早已商業(yè)化，國內(nèi)則剛起步。低乳糖奶的生產(chǎn)方式有多種，上述只是其中多生產(chǎn)方法中的一 種。從理論上講，低乳糖奶生產(chǎn)方法有物理去除法、化學(xué)酸水解法、酶水解法和基因工程技 術(shù)方法。其中酶水解法由于反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物簡單，不破壞牛乳中其他營養(yǎng)成分，生成的 副反應(yīng)產(chǎn)物較少，而且口感較好，得到了廣泛的推廣。迄今為止，酶水解法是生產(chǎn)低乳糖牛 乳最安全、實(shí)用、有效的方法。酶水解法生產(chǎn)低乳糖奶的過程中，酶的添加有2種方式。一 種是將原料乳經(jīng)過巴氏殺菌后冷卻至半乳糖苷酶作用的最佳溫度，添加酶并在此溫度下保 溫一段時(shí)間，使其達(dá)到所要求的乳糖水解度，然后將產(chǎn)品進(jìn)行滅菌，進(jìn)行無菌灌裝。這種方 法操作簡單，產(chǎn)品不容易受到污染，但滅菌處理時(shí)發(fā)生的美拉德反應(yīng)(食物中的還原糖與 胺類物質(zhì)在高溫下產(chǎn)生黑褐色物質(zhì)的一種反應(yīng))容易引起產(chǎn)品的褐變，從而影響產(chǎn)品的感 官質(zhì)量，而且耗時(shí)較長。另一種方法是將原料乳滅菌、冷卻后，在產(chǎn)品灌裝前按一定比例將 半乳糖苷酶加入到產(chǎn)品中，在貯存過程中，半乳糖苷酶將牛乳中的乳糖分解為葡萄糖和半 乳糖。這種方法所需設(shè)備投資低，產(chǎn)品的色澤變化不大，但是添加酶時(shí)，滅菌后的牛乳容易 受到微生物的污染，而且酶的作用時(shí)間較難控制，酶反應(yīng)后可能需要額外的殺菌步驟，例如UHT或UV等。Thermus thermophilus HB27是一種研究十分廣泛的嗜熱菌種，其中的基因資源 十分豐富。由于它的生存環(huán)境溫度高，營養(yǎng)貧乏，造成其代謝途徑中的酶系的性質(zhì)及其特 殊。目前為止，已經(jīng)有許多來自Thermus thermophilus HB27的基因被克隆并在不同的 表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)出來，包括許多糖苷水解酶，例如淀粉酶和葡萄糖苷酶等。這些酶的耐熱 性都很高，最適溫度在60-95度之間。目前還沒有任何來自Thermus thermophilus HB27 的半乳糖苷酶基因被克隆并表達(dá)的報(bào)道，且此酶的蛋白質(zhì)序列與其它物種差異較 大，即使是與同一亞種的Hiermus thermophilus A4菌種的同源性也不大于30 %。利用 Thermusthermophilus HB27的β -半乳糖苷酶的耐高溫的性質(zhì)，可以建立適用于乳制品巴 氏消毒法工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種表達(dá)β -半乳糖苷酶的重組菌株，該菌株 所表達(dá)的耐高溫β-半乳糖苷酶適用于乳制品巴氏消毒法。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述重組菌株的構(gòu)建方法。本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供上述重組菌株在生產(chǎn)耐高溫β -半乳糖苷 酶中的應(yīng)用。一種表達(dá)β-半乳糖苷酶的重組菌株，該菌株為基因組DNA上整合了來源于嗜熱 棲熱菌(Thermus thermophilus)ΗΒ27的β -半乳糖苷酶基因bgal的畢赤酵母。上述表達(dá)β-半乳糖苷酶的重組菌株的構(gòu)建方法，將來自嗜熱棲熱菌 (Thermusthermophilus)ΗΒ27的β -半乳糖苷酶基因bgal克隆到畢赤酵母表達(dá)載體 PPIC9K中，利用Mcl限制性內(nèi)切酶線性化載體后，將其轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中，利用G418抗生 素進(jìn)行多拷貝轉(zhuǎn)化子篩選得到。上述表達(dá)β-半乳糖苷酶的重組菌株高效表達(dá)β-半乳糖苷酶的方法，其特征在 于以甲醇為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)重組菌株產(chǎn)酶。以3L發(fā)酵液培養(yǎng)菌體生長35h，OD600達(dá)到450 后，以流加形式加入甲醇，加入總量為1. 0 1. 5L，誘導(dǎo)時(shí)間為40 48小時(shí)。上述表達(dá)半乳糖苷酶的重組菌株在發(fā)酵生產(chǎn)半乳糖苷酶中的應(yīng)用。本發(fā) 明的重組菌株所產(chǎn)的β-半乳糖苷酶水解乳糖的條件為最適ρΗ為6.5，在ρΗ5.3和7.6處 該半乳糖苷酶達(dá)到最大酶活的一半，該P(yáng)H范圍符合大部分食品的酸堿范圍；最適溫度 為70°C，當(dāng)溫度繼續(xù)增高時(shí)，酶蛋白的變性作用使酶活劇烈下降。無論是否外加半胱氨酸， 該酶的最適溫度都沒有明顯變化。本發(fā)明所用的畢赤酵母是一種高效的真核表達(dá)系統(tǒng)，用它來高效表達(dá)半乳糖苷酶 有著多方面的優(yōu)勢(1)畢赤酵母曾作為單細(xì)胞蛋白廣泛應(yīng)用，本身就具有很好的安全性， 并且，酵母培養(yǎng)基中不含有毒物質(zhì)和致熱源。( 畢赤酵母具有高效的蛋白分泌系統(tǒng)。我們 采用酵母的a因子信號膚序列將表達(dá)的半乳糖苷酶直接分泌到培養(yǎng)基中，這樣將大大簡化 酶的純化工藝，降低酶的生產(chǎn)成本。(3)它的高細(xì)胞密度、低成本發(fā)酵方法已經(jīng)被普遍采用， 發(fā)酵培養(yǎng)基中所使用的碳源、氮源、鹽、微量元素等都為普通工業(yè)原料，便宜易得。利用畢赤 酵母作為半乳糖苷酶表達(dá)的生物反應(yīng)器為工業(yè)化大規(guī)模、低成本發(fā)酵生產(chǎn)半乳糖苷酶奠定 了基礎(chǔ)。(4)表達(dá)的外源蛋白在總的分泌蛋白中含量高。本發(fā)明中的半乳糖苷酶基因bgal在酵母中分泌表達(dá)，雜蛋白很少。這樣就簡化了目的蛋白的分離純化工藝，降低了成本。有益效果本發(fā)明構(gòu)建的重組菌株所產(chǎn)的β -半乳糖苷酶具有較高的熱穩(wěn)定性， 借助固定化的嗜熱的半乳糖苷酶，可以做到滅菌的同時(shí)降解乳糖，避免了滅菌后添加 酶所造成的二次污染，不需要額外的殺菌步驟，并且不容易發(fā)生美拉德反應(yīng)引起產(chǎn)品的褐 變。這樣做可以改善產(chǎn)品外觀，降低生產(chǎn)成本。


圖1重組質(zhì)粒pPIC9K_bgal構(gòu)建示意圖。圖2β-半乳糖苷酶表達(dá)過程中菌體生長及溶氧。圖3 β -半乳糖苷酶最適ρΗ的測定。圖4β -半乳糖苷酶最適溫度的測定。圖5 β -半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性。圖6乳糖標(biāo)準(zhǔn)品HPLC檢測圖譜。圖7市售牛奶中乳糖降解曲線，即乳糖剩余量和反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā) 明。實(shí)施例1 bgal基因的克隆PCR反應(yīng)采用Biometra公司PCR儀。DNA酶切、連接、轉(zhuǎn)化和細(xì)菌 感受態(tài)制備等基本基因操作技術(shù)參照有關(guān)公司提供的操作手冊進(jìn)行。采用上海華舜生物工 程有限公司的試劑盒，提取T. thermophilus HB27基因組DNA。以其為模板，引物為G-sense 和G-anti，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR在50 μ L體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為94°C變性5min，按如下參 數(shù)循環(huán)；34 次94°C變性 lmin，55°C退火 50s，72°C延伸 1. 5min。最后 72°C延伸 lOmin。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。PCR大量擴(kuò)增目的基因后，凝膠電泳分離純 化PCR產(chǎn)物，從凝膠中回收目的基因后，將目的基因連接到T-vector上。在確認(rèn)的陽性重 組子中挑選兩個(gè)送上海博亞公司測序。將測序結(jié)果和所報(bào)道的序列用ClustalW軟件進(jìn)行 序列比對分析。菌種與載體嗜熱棲熱菌Hiermus thermophilus HB27，購自中國微生物工業(yè)菌 種保藏中心。bgal基因克隆載體pMD18-T Vector (以下簡稱T-Vector)，購自Takara公 司。畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K，購自hvitrogen公司；畢赤酵母表達(dá)菌株GS115，購自 Invitrogen 公司；培養(yǎng)基的配制IOx YNB(134g/L的無氨基酸酵母氮源)134gYNB固體溶于IL去離子水，過濾滅 菌，4°C保存；500x B溶液(0. 2g/L生物素)生物素20mg溶于IOOmL去離子水，過濾滅菌，4°C
保存；IOx D溶液(200g/L葡萄糖)200g D-葡萄糖溶于IOOOmL水，過濾滅菌，4°C保存；
IOx GY(100g/L的甘油)IOOmL甘油溶于900mL水，過濾滅菌，4°C保存；IOOx AA (含0.5g/L每種氨基酸)稱取L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-亮氨酸、L-異亮 氨酸、L-賴氨酸各500g溶于IOOmL水，過濾滅菌，4°C保存；lmol/L 的磷酸緩沖液印(pH6. 0)將 132mLlmol/L 的磷酸氫二鉀和 868ml lmol/L 的磷酸二氫鉀混合，然后用磷酸和氫氧化鉀溶液調(diào)PH至6. 0，過濾滅菌，常溫保存；lmol/L的山梨醇溶液將182. Ig的D-山梨醇溶于IL的水中，過濾滅菌，4°C保 存；YPD培養(yǎng)基10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖；MM 固體培養(yǎng)基13. 4g/LYNB，0. 0004g/L 生物素，2% 葡萄糖，1. 5% 瓊脂，0. 005% 谷氨酸，0. 005%甲硫氨酸，0. 005%賴氨酸，0. 005%亮氨酸，0. 005%異亮氨酸，2%瓊脂粉， 所有氨基酸均為L型；MD固體培養(yǎng)基13. 4g/L YNB，0. 0004g/L生物素，2 %葡萄糖，1. 5 %瓊脂，0. 5 4mg/L的G418硫酸鹽(依照篩選過程采用不同的濃度)；發(fā)酵培養(yǎng)基26.7mL/L 85 % H3PO4,0. 93g/L CaSO4 · 2H20,18. 2g/LK2S04,14. 9g/ LMgSO4 · 7Η20，4· 13g/L KOH，40g/L 甘油，酵母膏 10g/L，蛋白胨 20g/L，用 25% 的氨水調(diào) pH 值到5.0。PTMl 營養(yǎng)鹽=CuSO4 · 5H20 6g/L, NaI 0. 09g/L, MnCl2 · 4H20 3g/L, H3BO3O. 02g/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g/L, CoCl2O. 5g/L, ZnCl242. 2g/L, FeSO4 · H2O 65g/L, biotin 0. 2g/L, H2S045. 0mL/L。(1L發(fā)酵培養(yǎng)基中加入4. 35mLPTMl營養(yǎng)鹽)流加液25%氨水500mL，維持發(fā)酵pH在5. 0。50%甘油500mL甘油加去離子水 至1L，滅菌后加營養(yǎng)鹽12mL。100%甲醇1L甲醇，加12mL營養(yǎng)鹽。弓丨物根據(jù)bgal基因序列信息，用I^rime premier軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物。上游弓I物(9K_sense，EcoRI)為5，_cggaattcatgcggctggaccccaaccacc_3，；下游弓丨物(9K-anti, NotI)為5，-gccaccttgcggccgcctactccgcgagaa-3，。所有引物均由上海申能博彩公司合成。畢赤酵母重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用9K-sense和9K_anti引物對重組質(zhì)粒T-bgal 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR在50 μ L體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為94°C變性5min，按如下參數(shù)循環(huán)34 次94°C變性 lmin，55°C退火 50s，72°C延伸 1. 5min。最后 72°C延伸 IOmin0 回收約 1. 8kb 的片段(bgal基因)，以EcoRI、NotI雙酶切畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K并回收。16°C連接， CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，涂于LB (Amp+)平板，挑取單菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定 篩選畢赤酵母重組表達(dá)質(zhì)粒，命名為pPIC9K-bgal。表達(dá)載體的構(gòu)建過程詳見圖1。畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取畢赤酵母受體菌GS115(His_，Mut+)的單菌落接 種于IOmLYPD液體培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)過夜，再以(ν/ν)的接種量轉(zhuǎn)接于IOOmLYPD 培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)至0D600 = 1. 3-1. 5。4°C 5000rpm離心5min，棄去上清，用IOOmL冰預(yù) 冷的無菌水將菌體重懸，再次4。C 5000m離心lOmin，棄去上清，用50mL冰預(yù)冷的無菌水將 菌體重懸，4°C 5000rpm離心lOmln，再用20mL lmol/L山梨醇洗滌1次，溶于20mL lmol/L 冰預(yù)冷的山梨醇中，以備轉(zhuǎn)化。畢赤酵母的電擊轉(zhuǎn)化用Mel內(nèi)切酶單酶切重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K_bgal，使質(zhì)粒 線性化。細(xì)胞中單位點(diǎn)多基因插入確實(shí)可自發(fā)形成，雖然比例低，占所有HIS+轉(zhuǎn)化子的1-10%，但卻是可測的。多拷貝插入事件的發(fā)生是因?yàn)榛蚩稍贏0X1、aoxl: :AGR4位點(diǎn)或 his4位點(diǎn)進(jìn)行插入。結(jié)果在GS115中產(chǎn)生Mut+表型，在KM71中產(chǎn)生Muts表型。取80 μ L 感受態(tài)細(xì)胞與線性化質(zhì)粒(1 5yg)混合后轉(zhuǎn)移到事先用冰浴預(yù)冷的0. 2cm的電擊杯中， 電擊轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞.(2. 5KV，5ms)，立即向電擊杯中加入ImL冰冷的lmol/L的山梨 醇溶液，混勻后，以每塊平板200 μ L菌液涂布到MM固體平板上，培養(yǎng)直到長出轉(zhuǎn)化子。 將MM平板上生長的His+轉(zhuǎn)化菌落按先后順序分別點(diǎn)種于酵母選擇培養(yǎng)基MD平板的相應(yīng) 位置。畢赤酵母高效表達(dá)子的篩選和表達(dá)挑取在匪平板上生長良好的轉(zhuǎn)化子編號后 分別接種于含有不同濃度G418硫酸鹽的MD固體平板中(濃度為0. 5mg/L, 1. Omg/L, 1. 5mg/ L，2. Omg/L, 2. 5mg/L, 3. Omg/L, 3. 5mg/L)，于 28°C保溫箱培養(yǎng) 24 72h (不同 G418 濃度的平 板生長時(shí)間不同)，分別挑取不同濃度G418平板中的單菌落，進(jìn)行下一步的誘導(dǎo)表達(dá)。為檢 測表達(dá)條件是否有效，以導(dǎo)入空白PPIC9K質(zhì)粒的GS115轉(zhuǎn)化子作為分泌表達(dá)的空白對照。挑取單克隆接種于種子培養(yǎng)基YPD中，搖瓶培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)接于5L的發(fā)酵罐中，攪 拌轉(zhuǎn)速lOOOrpm，通氣量4VVM，在罐中培養(yǎng)到23. 5小時(shí)DO%上升至80%，開始流加甘油，在 培養(yǎng)至35h時(shí)，0D600達(dá)到450，開始流加甲醇，通過提高溶氧和添加有機(jī)氮源的策略，重組 畢赤酵母GSl 15在5L的NBS發(fā)酵罐中，OD600達(dá)到700，發(fā)酵液中酶活性可達(dá)到14000U/L。實(shí)施例2 粗酶液的制備取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液于8000rpm，4°C離心lOmin，棄上清。沉淀用 磷酸緩沖(lOOmM，pH 6.0)洗滌兩次，洗滌后的沉淀重懸于裂解緩沖液(IOOmM的磷酸緩沖 液l.OmM PMSF)中，置冰浴中超聲破碎。以IOmm探頭，于冰上200w超聲破碎，超聲時(shí)間3s， 間隔k，總共超聲8min。經(jīng)超聲處理后的菌液于12000rpm，4°C離心15min。取上清液即為 粗酶液。表達(dá)產(chǎn)物分析用濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS聚丙烯酰 胺凝膠電泳考察蛋白的表達(dá)情況。半乳糖苷酶酶活測定方法稱取^Omg鄰硝基苯β -D-半乳吡喃糖苷(ONPG)，先 溶于ImL甲醇中，再用IOOmM ρΗ6. 0的磷酸緩沖液定容至IOOmL,配成20mM的ONPG母液。通 過分別加入不同量的ONPG母液和IOOmM pH6. 0的磷酸緩沖液來得到不同濃度的ONPG水溶 液。測量酶活前，ONPG溶液會在相應(yīng)的溫度下水浴一段時(shí)間，以保證溫度的準(zhǔn)確性。測量時(shí) 加入待測粗酶液，使總體積為200 μ 1，保溫一段時(shí)間，然后測定其在420nm的光吸收值，體 系通過加入1800 μ 1 IOOmM稀硫酸中止反應(yīng)。1單位酶活(U)定義為每分鐘水解InmONPG。結(jié)果該β -半乳糖苷酶水解鄰硝基苯β -D-半乳吡喃糖苷(ONPG)的最適pH為 6. 5。這個(gè)結(jié)果與一些來自其它酵母和細(xì)菌的半乳糖苷酶類似，大部分來自酵母和細(xì)菌的 B-半乳糖苷酶的最適pH都在6. 5至7. 5之間。在ρΗ5. 3和7. 6處該β -半乳糖苷酶達(dá)到 最大酶活的一半，該P(yáng)H范圍符合大部分食品的酸堿范圍，這說明該酶有用于水解牛奶或甜 煉乳中乳糖的潛力。來自Τ. thermophilus的β -半乳糖苷酶的最適溫度為70°C，在其最適 溫度下很穩(wěn)定。實(shí)施例3 牛奶中乳糖降解實(shí)驗(yàn)。市售牛奶，經(jīng)高效液相色譜檢測，乳糖含量為42g/L。采用Ultimate 3000色譜系 統(tǒng)，示差折光檢測器(RID)，示差溫度35度，色譜柱為漢邦NH2柱，流動相為80%乙腈，流速lml/min，檢測時(shí)間30min，出峰時(shí)間18min。乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定市售的乳糖，用容量瓶配成0g/L_50g/L濃度的乳糖溶液，用上述高效液相檢測示 差值。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，y = 0. 609x+0. 0452，R2 = 0. 9991。圖6為乳糖標(biāo)準(zhǔn)品HPLC檢測圖
■；並市售牛奶中乳糖降解實(shí)驗(yàn)將牛奶水浴加熱至60°C，加入乳糖酶(即實(shí)施例1和實(shí)施例2中得到的粗酶液)， 其單位活力達(dá)30000U/L，每5分鐘取樣，液相色譜測定乳糖的含量。30分鐘后，牛奶中乳糖 降解達(dá)85%以上。圖7是乳糖降解曲線，即乳糖剩余量和反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)β-半乳糖苷酶的重組菌株，其特征在于該菌株為基因組DNA上整合了來 源于嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)ΗΒ27的β -半乳糖苷酶基因bgal的畢赤酵母。
2.權(quán)利要求1所述的表達(dá)半乳糖苷酶的重組菌株的構(gòu)建方法，其特征在于將來自 嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)HB27的β -半乳糖苷酶基因bgal克隆到畢赤酵母 表達(dá)載體PPIC9K中，利用Mcl限制性內(nèi)切酶線性化載體后，將其轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中，利用 G418抗生素進(jìn)行多拷貝轉(zhuǎn)化子篩選得到。
3.權(quán)利要求1所述的表達(dá)半乳糖苷酶的重組菌株高效表達(dá)半乳糖苷酶的方 法，其特征在于以甲醇為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)重組菌株產(chǎn)酶，每3L發(fā)酵液培養(yǎng)菌體生長35h， OD600達(dá)到450后，以流加形式加入甲醇，加入總量為1. 0 1. 5L的甲醇，誘導(dǎo)時(shí)間為40 48h。
4.權(quán)利要求1所述的表達(dá)半乳糖苷酶的重組菌株，發(fā)酵生產(chǎn)的半乳糖苷酶在 巴氏消毒法的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)β-半乳糖苷酶的重組菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。克隆得到Thermus thermophilus HB27半乳糖苷酶基因bgal，并將其插入到真核表達(dá)載體pPIC9K上，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS 115內(nèi)，可得到β-半乳糖苷酶表達(dá)量達(dá)到14000U/ml。β-半乳糖苷酶基因bgal表達(dá)的分子量為58Dk，最適溫度為70℃，其最適溫度下很穩(wěn)定。在pH6.5時(shí)該乳糖酶水解活力最高，而且穩(wěn)定性較好。高效表達(dá)的β-半乳糖苷酶可直接用于乳制品的巴氏消毒法，可以做到滅菌的同時(shí)降解乳糖，避免了滅菌后添加酶所造成的二次污染。在60度，30分鐘，HB27半乳糖苷酶可以降解牛奶90％的乳糖。
文檔編號C12N9/38GK102115718SQ20101059143
公開日2011年7月6日 申請日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者嚴(yán)明, 劉歡, 安芳芳, 李艷, 王珊珊, 許琳, 郝寧, 魏淼 申請人:南京工業(yè)大學(xué)