一種植酸酶及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種新型植酸酶及其應用，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1。本發(fā)明的重組植酸酶作為飼料添加劑，能顯著提高肉雞的日采食、日增重，降低料肉比，增加養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益。此外，在日糧中添加本發(fā)明的重組植酸酶可使肉雞的磷排泄量比對照組降低13.8%，說明本發(fā)明的植酸酶能有效提高肉雞對飼料中磷的吸收率，減少含磷廢物的排泄，有利于保護生態(tài)環(huán)境。
【專利說明】一種植酸酶及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于功能基因篩選【技術領域】，具體涉及一種植酸酶及其應用。
【背景技術】
[0002]植酸酶(Phytase)即肌醇六磷酸水解酶(EC3.1.3.8)，是催化植酸以及植酸鹽水解成肌醇與磷酸(或磷酸鹽)的一類酶的總稱。
[0003]植酸酶作為一種優(yōu)良的飼料添加劑目前被廣泛地應用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中，它能夠提高動物對磷元素的利用率，以及蛋白質(zhì)、氨基酸、各種礦物元素的利用率，解除動物植物性飼料中植酸的抗營養(yǎng)作用，提高植物性飼料的營養(yǎng)價值，同時降低動物排泄物對環(huán)境的污染，在動物生產(chǎn)以及在環(huán)境保護中，是極為有效的一種添加劑，具有重要的應用價值。另外，農(nóng)業(yè)部、環(huán)保部聯(lián)合印發(fā)的《全國畜禽養(yǎng)殖污染防治“十二五”規(guī)劃》中指出，將重點治理畜禽養(yǎng)殖污染，這也給植酸酶應用提供了更有利的機遇。
[0004]目前研究的植酸酶主要來源于Saccharomyces cerevisiae (Bajwa etal.,1984;Meyhack et al., 1982) > Aspergillus niger(MacRae, 1998) > A.terreus 和Myceliophthora thermophila(Van Loon, 1995)>A.niger(ficuum)(Van Hartimgsveldt etal., 1993;Ehlich et al., 1993;Bin Y et al.，1998)等。不同來源的植酸酶具有不同的酶學性質(zhì)，但目前的植酸酶普遍存在耐熱性不高，表達量低的問題，制約了植酸酶在飼料領域更為廣泛的應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā) 明的目的是提供一種新型植酸酶及其應用，本發(fā)明從黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)中得到一個編碼植酸酶的基因，并將該基因進行克隆,在黑曲霉(Aspergillus niger)中表達，篩選得到高效表達植酸酶的基因工程菌株，從而為高密度發(fā)酵和工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。
[0006]本發(fā)明一方面提供了一種來源于黑葡萄穗霉的植酸酶，其特征在于:
[0007]I)其氨基酸序列為SEQ ID NO:1的植酸酶；
[0008]2)在I)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個或數(shù)個氨基酸得到的，具有I)中植酸酶活性的酶。
[0009]本發(fā)明另一方面提供了編碼上述植酸酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQ IDN0:2。
[0010]本發(fā)明還提供了一種表達載體，其包含上述編碼植酸酶基因的核苷酸序列。
[0011]本發(fā)明另一方面提供了一種表達宿主細胞，其攜帶有表達上述植酸酶基因的表達載體。
[0012]上述表達宿主細胞為黑曲霉(Aspergillus niger)。
[0013]本發(fā)明的植酸酶用于制備飼料添加劑。
[0014]本發(fā)明構建的黑曲霉工程菌能高效表達植酸酶，搖瓶發(fā)酵結果顯示其酶活為434U/mL。本發(fā)明的植酸酶作為飼料添加劑，能顯著提高肉雞的日采食、日增重，降低料肉t匕，增加養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益。此外，在日糧中添加本發(fā)明的重組植酸酶可使肉雞的磷排泄量比對照組降低13.8%，說明本發(fā)明的植酸酶能有效提高肉雞對飼料中磷的吸收率，減少含磷廢物的排泄，有利于保護生態(tài)環(huán)境。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1:本發(fā)明構建的pGm-Scphy重組表達載體質(zhì)粒圖譜。
[0016]圖2:黑曲霉WLScphy發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳分析圖，其中箭頭所指59kD處為
重組表達的植酸酶。
[0017]圖3:重組表達的植酸酶相對酶活-溫度曲線圖。
[0018]圖4:重組表達的植酸酶相對酶活-pH曲線圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結合實例對本發(fā)明的方法做進一步說明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。本領域相關的技術人員可以借助實施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護和權利要求范圍不僅限于所提供的具體案例，而應包括本領域技術人員 在本說明書基礎上，不需經(jīng)過創(chuàng)造性勞動就能擴展的保護范圍。
[0020]實施例1:植酸酶基因的克隆
[0021]使用真菌基因組DNA提取試劑盒(Omega)從黑葡萄穗霉過夜培養(yǎng)物中提取基因組DNA。
[0022]以黑葡萄穗霉基因組DNA為擴增模板擴增黑葡萄穗霉中的植酸酶基因，其中所用到的正向引物P-F序列為(下劃線所示序列為AflII酶切位點)；
[0023]5' -AAACTTAAGATCATGGCCTGCGTCGCCTTCCTGCTCG-3'
[0024]反向引物P-R序列為(下劃線所示序列為XbaI酶切位點):
[0025]5' ~TCGTCTAGATCAAGCGGGTGCGCCGTCCGTCACAGTG_3'
[0026]將該基因用Phusion DNA聚合酶(Thermo scientific)從黑葡萄穗霉基因組DNA中擴增出來。
[0027]使用凝膠純化試劑盒(Fermentas)將上述PCR產(chǎn)物純化。用限制性內(nèi)切酶AflII和XbaI (Fermentas)對純化后的PCR產(chǎn)物進行酶切；同時，用限制性內(nèi)切酶Af III和XbaI對質(zhì)粒pGm進行酶切。使用凝膠純化試劑盒將酶切產(chǎn)物純化,并用T4DNA連接酶(Fermentas)將上述兩個酶切產(chǎn)物連接。將連接產(chǎn)物轉化進Trans5 α大腸桿菌(Transgen),用氨節(jié)青霉素進行選擇。為確保準確，對若干克隆進行測序(InvitiOgen)。測序結果顯示，黑葡萄穗霉植酸酶的基因序列為SEQ ID NO: 2，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:1;多個克隆的測序結果都一致。
[0028]通過NCBI中的BLAST進行蛋白質(zhì)序列比對發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的植酸酶為一新的等位基因，與現(xiàn)有的植酸酶序列有明顯的區(qū)別。
[0029]使用質(zhì)粒中量制備試劑盒(Axygen)從測序結果正確的大腸桿菌克隆中純化質(zhì)粒。所得I個重組質(zhì)粒為pGm-Scphy (見圖1),
[0030]實施例2:黑曲霉工程菌株構建及驗證
[0031]吸取黑曲霉Gl孢子懸浮液于CMA平板中心(9cm培養(yǎng)皿)，待菌落長滿整個培養(yǎng)皿，切1/4大小的培養(yǎng)基于200mL CMA液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm的條件培養(yǎng)14~16h。
[0032]用無菌Miracloth濾布收集菌絲體,并用溶液A清洗一次,在無菌條件下將清洗過的菌絲體轉移到40mL原生質(zhì)體化溶液，在30°C、200rpm的條件下溫浴I~2h，用顯微鏡觀察檢測原生質(zhì)體轉化進展。
[0033]用無菌Miracloth濾布過濾上述溫浴液體，所得濾液即為原生質(zhì)體溶液。將原生質(zhì)體溶液分裝于兩個50mL無菌的一次性離心管中，并將每管的體積用溶液B定容至45mL,在4000rpm條件下離心8min以獲得沉淀并棄去上清液。用20mL溶液B再清洗沉淀兩次。將沉淀重懸浮于IOmL溶液B中，并用血球計數(shù)板對原生質(zhì)體計數(shù)。將原生質(zhì)體再次離心并棄去上清液，根據(jù)血球計數(shù)板計數(shù)結果，加入適量溶液B重懸沉淀，使得原生質(zhì)體數(shù)目在I X IO7個/mL左右。
[0034]在冰上，將100 μ L上述原生質(zhì)體溶液加入預冷的無菌15mL離心管中，每個轉化反應用I管，加入10 μ g重組質(zhì)粒pGm-Scphy,加入12.5 μ L溶液C,溫和混勻后再冰上放置20mino
[0035]將麗SA頂層瓊脂試管熔化并保持在55°C。從冰中移出上述15mL離心管，并向管中加入ImL溶液C和2mL溶液B，溫和混勻各管，所得混合物即為原生質(zhì)體混合物。向3個頂層瓊脂試管中的每一個中加入ImL上述原生質(zhì)體混合物，并立即傾倒與MMSA平板上，并將平板在30°C下培養(yǎng)7~IOd至有轉化子長出。
[0036]按照實施例1中的方法提取轉化子基因組DNA，以此為模板，利用實施例1中引物進行PCR擴增目的基因。PCR擴增條件為98°C 30S ；98°C 10S,60°C 30S，72°C 120S，30個循環(huán)；72°C IOmin0利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物并進行測序分析，經(jīng)過PCR反應選育和測序驗證陽性轉化子。將所獲得的陽性工程菌命名為黑曲霉WLScphy (Aspergillusniger WLScphyX
[0037]溶液A:2.5mLlM K2HPO4, 2.5mLIM KH2PO4,48.156g MgSO4，加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0038]溶液B:5mLlM Tris (ρΗ7.5)，2.77g CaCl2,109.32g 山梨醇，加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0039]溶液C:250g PEG4000,2.77g CaCl2, 5mLlM Tris (ρΗ7.5)，加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0040]原生質(zhì)體化溶液:將0.6g裂解酶(Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum,Sigma)溶解于40mL溶液A中，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0041]MMSA 平板:0.59g 乙酰胺(Sigma) ,3.4g CsCl (Sigma)，0.52g KCl，1.52gKH2P04,218.5g山梨醇，Iml微量元素(見下)，20g瓊脂，加入dlH20至終體積972.5mL,高壓蒸汽滅菌后加入用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgS04。
[0042]MMSA 頂層瓊脂試管:0.59g 乙酰胺(Sigma), 3.4g CsCl (Sigma), 0.52g KCl,
1.52g KH2PO4, 218.5g山梨醇，Iml微量元素(見下)，IOg低熔點瓊脂糖，加入dlH20至終體積972.5mL,高壓蒸汽滅菌后，在培養(yǎng)基未凝固時，加入用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgS04,之后立即分裝于無菌試管中，每管10mL。
[0043]微量元素:在250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4.7Η20，8.8g ZnSO4.7Η20，0.4gCuSO4.5Η20，0.15g MnSO4.4Η20，0.Ig Na2B4O7.IOH2O, 50mg (NH4) 6Μο7024.4Η20，0.2mL 濃 HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0044]CMA平板:20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，Ig蛋白胨，15g瓊脂，加入dlH20至終體積1000mL,高壓蒸氣滅菌。
[0045]CMA液體培養(yǎng)基:20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，Ig蛋白胨，加入dlH20至終體積1000mL,高壓蒸氣滅菌。
[0046]實施例3:黑曲霉工程菌的發(fā)酵和植酸酶的表達
[0047]挑取實施例2獲得的陽性轉化子黑曲霉WLScphy，接種于30mL TSB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)5d ;所得發(fā)酵液用8層紗布過濾，濾液在14000g條件下離心IOmin,收集上清液；將上清液在濃度為12%的SDS-PAGE膠上進行電泳。結果如圖2所示，泳道2所示為黑曲霉宿主蛋白表達情況；泳道I所示為本發(fā)明黑曲霉WLScphy蛋白表達情況，其中箭頭所指59kDa處有目的蛋白條帶，與預期相符，說明本發(fā)明的植酸酶在黑曲霉中得到成功表達。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒(Solarbio)測定顯示其表達量約為1.Sg/L0
[0048]實施例4:植酸酶酶活測定
[0049]1.檢測方法
[0050]取甲、乙兩支25mL比色管，各加入1.8mL乙酸緩沖液(PH5.0),0.2mL樣品反應液，混勻，37°C預熱5min。在甲管中加入4mL底物溶液，乙管中加入4mL終止液，混勻，37°C反應30min，反應結束后甲管中加入4mL終止液，乙管中加入4mL底物溶液，混勻。靜置lOmin，分別在415nm波長處測定吸光值，通過`標準曲線用回歸直線方程計算植酸酶活性。
[0051]酶活X = FXC/(mX 30)
[0052]其中:X——酶活力單位，U/g (mL);
[0053]F—試樣溶液反應前的總稀釋倍數(shù)；
[0054]C—根據(jù)實際樣液的吸光值由直線回歸方程計算出的酶活性，U;
[0055]m-試樣質(zhì)量或體積，g/mL;
[0056]30——反應時間；
[0057]2.酶活檢測
[0058]按照上述測定方法，取Iml上述發(fā)酵上清液進行酶活測定。結果顯示其酶活為434U/mL，說明植酸酶基因在黑曲霉中得到高效表達。
[0059]實施例5:植酸酶酶學性質(zhì)分析
[0060]在ΡΗ5.0條件下，分別在30°C、40°C、50°C、55°C、6(rC條件下測定上述發(fā)酵上清液的酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活。結果如圖3所示，本發(fā)明的植酸酶的最適作用溫度為55°C。
[0061]在37°C條件下，分別用 pH為 2.0,2.5,3.0,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5、7.0 的緩沖
液稀釋上述發(fā)酵上清液，測定酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活。結果如圖4所示，本發(fā)明的植酸酶的最適作用pH為5.5。
[0062]實施例6:重組植酸酶在飼料中的應用[0063]1、材料
[0064]植酸酶:本發(fā)明重組表達的植酸酶，3000U/g。
[0065]試驗動物:山東六和集團種雞場羅斯肉雞。
[0066]2、試驗方法
[0067]試驗選擇健康、體重均勻的AA肉雛雞300只，共分3個處理組，每個處理組100只肉雞，每個處理組5個重復，每個重復20只雞。試驗分O~18d、18~35d兩個飼養(yǎng)階段，分別飼喂處理A (正對照組)、處理B (負對照組)、處理C (添加本發(fā)明重組表達的植酸酶)。各處理組日糧配方及營養(yǎng)成分見表1、表2。
[0068]表1;基礎飼糧配方及營養(yǎng)水平
[0069]
【權利要求】
1.一種植酸酶，包含有: 1)氨基酸序列為SEQID NO:1的植酸酶； 2)在I)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個或數(shù)個氨基酸得到的，且具有I)中植酸酶活性的酶。
2.一種核苷酸，所述的核苷酸編碼權利要求1所述的植酸酶。
3.如權利要求2所述核苷酸，其特征在于所述核苷酸序列為SEQID N0:2。
4.一種表達載體，所述的表達載體攜帶有權利要求2所述的核苷酸。
5.—種表達宿主細胞，所述的表達宿主細胞為攜帶有權利要求4所述的表達載體的宿主細胞。
6.如權利要求5所述的表達宿主細胞，其特征在于所述的宿主細胞為里氏木霉。
7.權利要求1所述的植酸酶在制備飼料添加劑中的應用。
8.—種飼料添加劑，所述的`飼料添加劑包含有權利要求1所述的植酸酶。
【文檔編號】C12N15/80GK103589700SQ201310567641
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月14日 優(yōu)先權日:2013年11月14日
【發(fā)明者】王華明, 徐娟, 黃亦鈞 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司, 濰坊康地恩生物科技有限公司