一種木聚糖酶突變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種木聚糖酶突變體，是氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1的木聚糖酶的第5位氨基酸由Pro變?yōu)锳sn，第34位氨基酸由Gln變?yōu)锳sn。上述木聚糖酶突變體的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：2，其一種編碼基因的核酸序列為SEQ?ID?NO：3。本發(fā)明的木聚糖酶突變體最適pH值為5.5，在酸性、中性范圍內(nèi)具有較高酶活，在pH2.0-5.0范圍內(nèi)，突變體的酶活殘留率均高于野生型；木聚糖酶突變體的最適作用溫度為60℃，且在70℃條件下仍能保持約80%的酶活，比野生型具有更強(qiáng)的耐熱性。此外，本發(fā)明的木聚糖酶突變體對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶也具有很強(qiáng)的耐受性，有利于其在飼料領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。
【專利說明】一種木聚糖酶突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于功能基因改造【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種木聚糖酶突變體及其應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]木聚糖(xylan)廣泛存在于自然界中，是半纖維素的重要組分，它是自然界中含量僅次于纖維素的第二豐富的多聚糖，幾乎占地球可更新有機(jī)碳含量的三分之一。在被子植物中木聚糖占干物質(zhì)重的15%-30%，在裸子植物中占干物質(zhì)重的7%-12%。但木聚糖具有很強(qiáng)的抗?fàn)I養(yǎng)作用，在動(dòng)物的消化道內(nèi)不能被消化和吸收，而且會(huì)影響其它養(yǎng)分的吸收利用，因而大大限制了富含木聚糖飼料(大麥、小麥、黑麥等)的應(yīng)用。木聚糖酶(Xylanase)是指能專一降解半纖維素木聚糖為低聚木糖和木糖的一組酶的總稱。人們對(duì)木聚糖酶的研究早在六十年代就已開始，主要研究集中在食品、飼料、造紙、能源工業(yè)等方面的木聚糖酶，已經(jīng)從不同來源的微生物中分離到大量的不同類型不同功能的木聚糖酶。并分離出多種木聚糖酶基因，已工業(yè)化生產(chǎn)多種木聚糖酶產(chǎn)品。
[0003]迄今為止發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)木聚糖酶最適作用pH值在6-7范圍內(nèi)，關(guān)于酸性木聚糖酶的報(bào)道比較少。近幾年對(duì)酸性木聚糖酶(PH4.0以下時(shí)仍保持較高酶活性)的開發(fā)已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注，對(duì)于酸性木聚糖酶的生產(chǎn)、純化、性質(zhì)、酸性特征的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及其在飼料加工、釀酒工業(yè)、 果汁加工、以及能源等領(lǐng)域的應(yīng)用等方面的研究正在不斷深入。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種木聚糖酶突變體及其應(yīng)用，通過對(duì)來源于里氏木霉(Trichoderma reesei)的木聚糖酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造,獲得了突變體蛋白，其耐熱性得到顯著提高，有利于其在飼料領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。
[0005] 申請(qǐng)人:對(duì)里氏木霉木聚糖酶的N末端進(jìn)行突變，經(jīng)過大量的篩選，發(fā)現(xiàn)P5N、Q34N這兩個(gè)突變位點(diǎn)能引起木聚糖酶耐熱性的改變，從而促成本發(fā)明。
[0006]本發(fā)明一方面提供了一種木聚糖酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO:1的木聚糖酶的第5位氨基酸由Pro變?yōu)锳sn，第34位氨基酸由Gln變?yōu)锳sn。
[0007]上述木聚糖酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO:2，其一種編碼基因的核酸序列為 SEQ ID NO:3o
[0008]本發(fā)明另一方面提供了攜帶有編碼序列為SEQ ID NO:3的木聚糖酶突變體基因的質(zhì)粒。
[0009]將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母中進(jìn)行重組表達(dá)，獲得的木聚糖酶突變體耐熱性得到很大提聞。
[0010]本發(fā)明的木聚糖酶突變體最適pH值為5.5，在酸性、中性范圍內(nèi)具有較高酶活，在PH2.0-5.0范圍內(nèi)，突變體的酶活殘留率均高于野生型；木聚糖酶突變體的最適作用溫度為60°C，且在70°C條件下仍能保持約80%的酶活，比野生型具有更強(qiáng)的耐熱性。此外，本發(fā)明的木聚糖酶突變體對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶也具有很強(qiáng)的耐受性，有利于其在飼料領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1:本發(fā)明木聚糖酶突變體XYNHlO與野生型XynII的最適作用pH比較示意圖；
[0012]圖2:本發(fā)明木聚糖酶突變體XYNHlO與野生型XynII的pH穩(wěn)定性比較圖；
[0013]圖3:為木聚糖酶突變體XYNHlO與野生型XynII的最適作用溫度比較圖；
[0014]圖4:木聚糖酶突變體XYNHlO與野生型XynII的耐熱性比較圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook,2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(AusubeI, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻(xiàn)提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在本發(fā)明所記載的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，采用本領(lǐng)域其它常規(guī)的方法、實(shí)驗(yàn)方案和試劑，而不限于本發(fā)明具體實(shí)施例的限定。
[0016]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0017]實(shí)施例1木聚糖酶突變體基因的合成及擴(kuò)增
[0018]為了提高來源于里氏木霉的木聚糖酶XynII (GenBank:AAB29346.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的耐熱性,通過定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)該酶進(jìn)行了大量突變的篩選,設(shè)計(jì)PCR 引物 Xynl1-FUXynI1-Rl 如下:·[0019]XynI1-Fl:GGCGAATTCCAGACTATCCAACCAGGAA (下劃線為限制性內(nèi)切酶 EcoRI 識(shí)別位點(diǎn))
[0020]XynI1-Rl:ATAGCGGCCGCTTAAGAAACAGTAATAGAT (下劃線為限制性內(nèi)切酶 NotI 識(shí)別位點(diǎn))
[0021]以XynII基因?yàn)槟０?，以上述引物用GeneMorph II隨機(jī)突變PCR試劑盒(Stratagene)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收PCR產(chǎn)物，EcoR1、NotI進(jìn)行酶切處理后與經(jīng)同樣酶切后的pET21a載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培養(yǎng)，待轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)后，用牙簽逐個(gè)挑至96孔板，每個(gè)孔中加入150ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培養(yǎng)基，370C 220rpm培養(yǎng)6h左右，離心棄上清，菌體用緩沖液重懸，反復(fù)凍融破壁，獲得含有木聚糖酶的大腸桿菌細(xì)胞裂解液。
[0022]分別取出30ul裂解液至兩塊新的96孔板，其中一塊于70°C處理IOmin后，兩塊96孔板都加入30ul底物，于37°C反應(yīng)30min后，DNS法測定生成的還原糖，不同的突變子高溫處理后保持的活性不同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有些突變對(duì)木聚糖酶的耐熱性沒有影響，有些突變甚至使耐熱性降低了，對(duì)依然保持高活性的突變子進(jìn)行DNA測序，最終， 申請(qǐng)人:獲得了能提高木聚糖酶耐熱性的突變組合P5N和Q34N。
[0023]含P5N和Q34N兩點(diǎn)突變的木聚糖酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID N0:2，編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:3由上海捷瑞生物公司合成。
[0024]將合成的木聚糖酶突變體基因命名為XynHIO，用引物Xynll-Fl、XynI1-Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物兩端引入EcoR 1、Not I位點(diǎn)。PCR反應(yīng)條件為:94°C變性5min ;然后94°C變性30s，56°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)后，72°C保溫lOmin。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，XynHlO基因?yàn)榇笮?76bp的片段。
[0025]通過上述同樣的PCR方法擴(kuò)增得到野生型木聚糖酶XynII的基因片段。
[0026]實(shí)施例2畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建
[0027]將上述克隆得到的木聚糖酶突變體基因XynHlO片段，通過EcoR I和Not I位點(diǎn)與表達(dá)載體PPIC9K相連接，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K-XynH10。
[0028]將表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K_XynH10用Sal I進(jìn)行線性化，表達(dá)質(zhì)粒線性化片段通過電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15，在MD平板上篩選得到畢赤酵母重組菌株GSl 15/pPIC9K-XynH10，然后在含不同濃度遺傳霉素的YPD平板上篩選多拷貝的轉(zhuǎn)化子。
[0029]將一個(gè)轉(zhuǎn)化子命名為畢赤酵母XynHlO (Pichia pastoris XynHlO)，轉(zhuǎn)接于BMGY培養(yǎng)基中，30°C、250rpm振蕩培養(yǎng)Id ;再轉(zhuǎn)入BMM培養(yǎng)基中，30°C、250rpm振蕩培養(yǎng)；每天添加0.5%的甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)4d ;離心去除菌體，得到含木聚糖酶XynHlO的發(fā)酵上清液；將其進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測分析，結(jié)果顯示發(fā)酵上清液中重組木聚糖酶突變體XynHlO的分子量大小約為20kDa。
[0030]通過上述同樣的酶切連接方法將野生型木聚糖酶基因XynII克隆到畢赤酵母GS115宿主中，構(gòu)建得到重組表達(dá)野生型木聚糖酶的畢赤酵母工程菌，命名為畢赤酵母XynII (Pichia pastoris XynlD0 搖瓶水平發(fā)酵畢赤酵母 XynII, 30°C、250rpm 振蕩培養(yǎng)；每天添加0.5%的甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)4d;離心去除菌體，得到含重組野生型木聚糖酶XynII的發(fā)酵上清液。
[0031](I)木聚糖酶活單位的定義
[0032]在37°C、pH值為5.5的條件下，每分鐘從濃度為5mg/ml的木聚糖溶液中釋放
Iμ mol還原糖所需要的酶量即為一個(gè)酶活力單位U。
[0033](2)酶活測定方法
[0034]取2ml濃度為1%的木聚糖底物(pH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液配制)，加入到比色管中，37°C平衡lOmin，再加入2ml經(jīng)pH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液適當(dāng)稀釋并經(jīng)37°C平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混勻于37°C精確保溫反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后，加入5ml DNS試劑，混勻以終止反應(yīng)。然后沸水浴煮沸5min，用自來水冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25ml，混勻后，以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為空白對(duì)照，在540nm處測定吸光值A(chǔ)e。
[0035]酶活計(jì)算公式:
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種木聚糖酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO:1的木聚糖酶的第5位氨基酸由Pro變?yōu)锳sn，第34位氨基酸由Gln變?yōu)锳sn。
2.如權(quán)利要求1所述的木聚糖酶突變體，其特征在于，所述的突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO:2o
3.編碼權(quán)利要求1所述的突變體的基因，其核酸序列為SEQID Ν0:3。
4.一種重組質(zhì)粒，所述的重組質(zhì)粒攜帶有權(quán)利要求3所述的基因。
5.一種重組畢赤酵母，所述的重組畢赤酵母攜帶有權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒。
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK103627686SQ201310567525
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月14日
【發(fā)明者】徐曉東, 王華明, 李冬冬, 趙俊橋, 王海, 邵靜 申請(qǐng)人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司