專(zhuān)利名稱(chēng)：一種產(chǎn)生生物乳化劑和降解烷烴的耐鹽紅球菌及其在石油污染鹽堿土壤生物修復(fù)中的應(yīng)用的制作方法
一種產(chǎn)生生物乳化劑和降解烷烴的耐鹽紅球菌及其在石油 污染鹽堿土壤生物修復(fù)中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物生物技術(shù)和環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，它涉及一株耐鹽紅 球菌Rhodococcus Sp. JH，一種由該菌發(fā)酵產(chǎn)生的生物乳化劑，及其在石油污染鹽堿土壤生 物修復(fù)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著對(duì)石油產(chǎn)品的需求量增加，原油的開(kāi)采、加工和運(yùn)輸活動(dòng)日益頻繁，這些過(guò)程 使大量的石油及其加工產(chǎn)品進(jìn)入土壤，打破了自然界原有的生態(tài)平衡，給動(dòng)植物和人類(lèi)帶 來(lái)了嚴(yán)重的危害，目前，這已成為世界性的環(huán)境問(wèn)題?，F(xiàn)在世界石油總產(chǎn)量每年近3X IOki 噸左右，我國(guó)當(dāng)前石油年產(chǎn)量也早已超過(guò)1 X IO8噸，而每年新污染土壤達(dá)1 X IO5噸之多。 黃河三角洲地區(qū)擁有豐富的油氣資源，是我國(guó)第二大石油基地。這里油井分布廣泛的同時(shí) 污染也十分嚴(yán)重，一般井場(chǎng)污染范圍在1000-2000m2之間。隨著石油的大規(guī)?？碧健㈤_(kāi)發(fā)、 冶煉、運(yùn)輸和使用，污染、遺漏、井噴、輸油管道泄漏等事故頻發(fā)，造成土壤污染和植被破壞， 嚴(yán)重威脅著黃河三角洲地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的安全。近年來(lái)，黃河斷流影響了黃河三角洲濕地生 態(tài)系統(tǒng)淡水水源的補(bǔ)給，破壞了濕地土壤中水鹽的平衡，使土壤含鹽量上升，土壤鹽堿化現(xiàn) 象日益嚴(yán)重。鹽漬化土地面積占全區(qū)總面積的一半以上，土壤以濱海鹽土為主，土壤含鹽量 高，鹽分主要以氯化物為主，占可溶性鹽總量的80%以上，土壤表層鹽分在0. 4-3%范圍。 深入了解黃河三角洲地區(qū)鹽漬化條件下石油污染的特點(diǎn)，對(duì)該地區(qū)進(jìn)行污染修復(fù)，恢復(fù)其 生態(tài)功能迫在眉睫。微生物降解是修復(fù)石油污染土壤的一種有效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的方法，是石油烴類(lèi)有機(jī) 污染物去除的主要機(jī)制。利用微生物降解環(huán)境中的污染物具有成本低、效率高、以及不易造 成二次污染等優(yōu)點(diǎn)，所以一直受到廣泛關(guān)注。然而，在高鹽條件下，微生物既要忍受長(zhǎng)期的 高滲透壓脅迫，又要承受短期的滲透沖擊。當(dāng)鹽度> 3%時(shí)，非嗜鹽微生物的代謝會(huì)受到抑 制，使其生物修復(fù)效率明顯降低，甚至喪失修復(fù)能力。鹽度從0.5%升高至2%時(shí)，也會(huì)嚴(yán)重 擾亂非嗜鹽微生物的代謝活動(dòng)。因此，傳統(tǒng)的非嗜鹽微生物并不適合對(duì)污染的高鹽環(huán)境進(jìn) 行生物修復(fù)。嗜鹽微生物可分為嗜鹽型和耐鹽型。前者是在一定濃度鹽中可正常生長(zhǎng)，且高 濃度鹽是生長(zhǎng)必需條件的微生物；后者是一類(lèi)能耐受一定濃度鹽溶液，但在無(wú)鹽條件下 也可正常生長(zhǎng)的微生物。嗜鹽菌種類(lèi)繁多，它們的分類(lèi)主要依據(jù)三個(gè)方面表型特征、 化學(xué)分類(lèi)數(shù)據(jù)和分子生物學(xué)數(shù)據(jù)。根據(jù)表型特征的不同，有嗜鹽球菌和嗜鹽桿菌。根據(jù) 16SrRNA/rDNA序列分析并結(jié)合其它生物學(xué)形狀有鹽桿菌屬(Halebacterium)，鹽深紅菌屬 (Halorubrum)，富鹽菌屬(Haloferax)，鹽盒菌屬(Haloarcula)，鹽球菌屬(Halococcus)， 嗜鹽堿桿菌屬(Natronobacterium)，嗜鹽堿球菌屬(Natronococcus)等菌屬。嗜鹽微生物 一般生活在含10% -20%鹽成分的天然鹽湖中、曬鹽場(chǎng)和腌制海產(chǎn)品等處。由于嗜鹽微生 物能夠在高鹽環(huán)境中棲息繁殖，因此，利用嗜鹽微生物修復(fù)污染的天然鹽環(huán)境或處理排放的高鹽度有機(jī)污染物廢水，不需要通過(guò)稀釋、反滲透、離子交換、或者電滲透等方法降低待 處理樣品的鹽度，具有操作簡(jiǎn)單和成本低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)。關(guān)于有關(guān)高鹽環(huán)境中能夠降解烷 烴或原油，同時(shí)產(chǎn)生生物表面活性劑的菌株的報(bào)道也還很少。但是，上述菌屬的應(yīng)用范圍僅 限于對(duì)石油污染的污水的生物修復(fù)，目前，還沒(méi)有成功實(shí)現(xiàn)原油污染的土壤生物修復(fù)的先 例。受烷烴和原油污染的土壤生物修復(fù)是一門(mén)新興的技術(shù)，在采用微生物修復(fù)石油污 染的土壤中面臨這樣一個(gè)難題，即石油難溶于水，生物可利用性低，單純的石油降解菌難以 與之接觸從而造成修復(fù)率低等問(wèn)題。有研究表明，表面活性劑可以乳化污染土壤中不溶性 有機(jī)物，使它們的解吸附增強(qiáng)，水溶性增加。生物乳化劑是一類(lèi)由生物產(chǎn)生的具有表面活性 的化合物，其分子結(jié)構(gòu)由一個(gè)疏水部分和一個(gè)親水部分構(gòu)成，同時(shí)具有親脂和親水的性質(zhì)， 因此具有減小表面張力、穩(wěn)定乳化、增加泡沫等作用，另外，生物乳化劑具有與環(huán)境的兼容 性，即它沒(méi)有毒性，并可被生物降解，因此它們不會(huì)對(duì)環(huán)境造成不利的影響，利用其能夠乳 化原油增強(qiáng)油的水溶性的特性，在石油開(kāi)采、環(huán)境治理以及食品飲料、化妝品生產(chǎn)等領(lǐng)域有 廣闊的應(yīng)用前景。為了提高土壤中烷烴降解速度，加入生物表面活性劑，能夠增強(qiáng)憎水性化合物的 親水性和生物可利用性，或給土壤提供幫助生物降解的物質(zhì)，提高土壤微生物的數(shù)量，繼而 提高烷烴的降解速度。生物表面活性劑是微生物在一定條件下培養(yǎng)時(shí)，其代謝過(guò)程中分泌 出的具有一定表面活性的代謝產(chǎn)物，如糖脂、多糖脂、脂肽或中性類(lèi)脂衍生物等。廣義的生 物表面活性劑分為生物表面活性和生物乳化劑，前者是一些低分子量的小分子，能明顯改 變表/界面張力，后者是一些生物大分子，并不能明顯降低表/界面張力，但對(duì)油/水界面 表現(xiàn)出很強(qiáng)的親和力，因而可使乳狀液得以穩(wěn)定，表現(xiàn)出相當(dāng)高的表面活性和乳化能力。與 化學(xué)合成表面活性劑相比，生物表面活性劑具有以下優(yōu)點(diǎn)①水溶性好，在油/水界面有高 的表面活性；②具有很強(qiáng)的乳化原油的能力；③可生物降解，不對(duì)環(huán)境造成污染和破壞；④ 分子結(jié)構(gòu)類(lèi)型多樣，具有特殊的官能團(tuán)，其中有些基團(tuán)是化學(xué)方法難以合成的；⑤無(wú)毒、安 全；⑥生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，在常溫常壓下即可發(fā)生反應(yīng)。正因?yàn)檫@些特性，生物表面活性劑尤其 適合石油工業(yè)和環(huán)境工程，如石油的生物降粘、提高原油的采收率、重油污染土壤的生物修 復(fù)等。微生物以自己的方式攝取石油烴類(lèi)然后參與自身代謝，最終生成小分子有機(jī)酸。 目前所知的微生物細(xì)胞對(duì)于烷烴的攝取機(jī)制有以下幾個(gè)方面一是主動(dòng)運(yùn)輸，這些細(xì)胞對(duì) 烷烴具有很高的親和力，通過(guò)相差和掃描電鏡可以觀察到不動(dòng)桿菌可附著于烷烴小液滴的 表面，絮凝物的形成也使得細(xì)胞可與烷烴保持緊密接觸，從而造成一種微生態(tài)環(huán)境。當(dāng)然并 非依靠烷烴生長(zhǎng)的微生物種群都會(huì)附著于烴類(lèi)，有的細(xì)胞與烴的接觸可能是依靠一種非特 異性疏水作用引起的。二是細(xì)胞與“擬增溶”的小液滴互相作用微生物所產(chǎn)生的胞外的生 物表面活性劑和生物乳化劑有增加油水界面之間接觸面積的作用。生物乳化劑的研究開(kāi)始于本世紀(jì)六十年代，目前所知多種微生物可產(chǎn)乳化劑，但 對(duì)乳化劑的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)知之甚少；生物乳化劑具有對(duì)烴良好的乳化性能和促進(jìn)烴降解 的特性，但是直到現(xiàn)在生物乳化劑的合成機(jī)制尚不清楚，尤其是耐鹽菌產(chǎn)生的乳化劑還未 見(jiàn)報(bào)道。生物降解石油作為一種高效率、低成本、無(wú)污染的生物治理技術(shù)，適應(yīng)我國(guó)的國(guó)情， 也是增加可利用耕地面積的有效途徑。因此有必要進(jìn)一步研究，這對(duì)于生物修復(fù)技術(shù)的機(jī)理具有重要的理論價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明主要從能夠產(chǎn)生表面活性物質(zhì)的耐鹽解烴菌入手，對(duì)菌株的烴降解特性及 產(chǎn)生的表面活性劑進(jìn)行了深入的研究，并用于石油污染鹽堿土壤的生物修復(fù)技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一在于針對(duì)土壤的石油污染日益嚴(yán)重的問(wèn)題，提供一種耐鹽紅球 菌(Rhodococcus sp.) JH和并將其用于石油污染土壤的生物治理技術(shù)。本發(fā)明的目的之二在于提供一種新型的脂蛋白類(lèi)的生物乳化劑，以便提高烷烴和 原油在乳化性能和溶解度，強(qiáng)化菌株在石油污染土壤中對(duì)烷烴和原油的生物降解。在微生物降解原油的實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)遇到一種現(xiàn)象，就是乳化效果特別好的實(shí)驗(yàn)組 其油水界面張力并不顯著降低?；诖祟?lèi)現(xiàn)象，我們有兩個(gè)概念必須加以澄清，就是生物 表面活性劑和生物乳化劑的區(qū)別。在廣義上生物乳化劑屬于生物表面活性劑，但在狹義上 它們是按照各自的功能區(qū)分的。生物表面活性劑(如糖脂、磷脂、脂肽、脂肪酸、短肽等)是 一些低分子量的小分子，它們能顯著降低空氣-水或油_水界面的張力，從而有助于油水乳 化，但形成的乳狀液往往不能穩(wěn)定存在。生物乳化劑是一些生物大分子，如多糖蛋白、脂多 糖、或這些聚合物的混合物等，它們雖不能顯著降低表面張力，但對(duì)油水界面表現(xiàn)出很強(qiáng)的 親和力，能夠吸附在分散的油滴表面，防止油滴凝聚，從而使這種乳狀液得以穩(wěn)定，這種效 應(yīng)使得烷烴呈膠狀分散，增加了烷烴與細(xì)胞的接觸。因此生物乳化劑的主要作用是乳化原 油，降低原油粘度，更重要的是可以強(qiáng)化微生物在石油污染土壤修復(fù)中的作用。本發(fā)明提供的紅球菌(Rhodococcus sp. ) JH菌株，于2009年11月04日保藏于 “中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)為CGMCC No. 3388。紅球菌(Rhodococcus sp.) JH菌株的篩選取石油污染鹽堿土土樣lg，無(wú)菌接種至100ml無(wú)機(jī)鹽液蠟培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基組成 Na2HPO4L 5g ；KH2P043 . 48g ；MgSO4O. 7g ； (NH4)2S044g ；酵母粉 0. Olg ；液體石蠟 2% (v/w)，蒸 餾水1000ml ；pH自然；121°C滅菌30min)，37°C搖床往復(fù)振蕩培養(yǎng)5d。將富集培養(yǎng)液充分混 勻，取100μ 1涂布在1. 5% LB固體平板上，37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2_3d，觀察生長(zhǎng)出的菌 落。挑取單菌落并用顯微鏡檢驗(yàn)其純度。將生長(zhǎng)的各個(gè)菌落，接種至LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至 0D630為0. 8左右，作為種子液以10% (ν/ν)比例接入100ml無(wú)機(jī)鹽液蠟培養(yǎng)基中，37°C搖 床往復(fù)振蕩培養(yǎng)5d。然后以此發(fā)酵液作為種子液，接種至新鮮的無(wú)機(jī)鹽液蠟培養(yǎng)基，反復(fù)馴 化菌種3-4次。選取對(duì)液蠟乳化良好的菌種進(jìn)行原油降解試驗(yàn)。將菌落接種至液蠟培養(yǎng)基培養(yǎng)3d 左右，作為種子以10% (ν/ν)比例接入到100ml原油培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基組成=Na2HPO4L 5g ； ΚΗ2Ρ043· 48g ；MgSO4O. 7g ； (NH4)2S044g ；酵母粉 0. Olg ；原油 0. 5% (w/w)，蒸餾水 1000ml ；pH 自然；121°C滅菌30min)，37°C震蕩培養(yǎng)5d后測(cè)定原油降解率。油類(lèi)測(cè)定方法采用紅外法， 即發(fā)酵液用100ml四氯化碳萃取，用紅外測(cè)油儀測(cè)定剩余原油的量，降解率(％ ) = 1-剩余 原油的量/加入原油的量X 100% ；采用高壓氣相色譜方法檢測(cè)原油的降解情況。選取對(duì)液蠟乳化良好的菌種發(fā)酵液用來(lái)測(cè)量乳化指數(shù)(EI-24)，以篩選能夠利用 烴產(chǎn)乳化劑的菌株，最終得到一株能夠乳化和降解原油，并利用烴類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生生物乳化劑 的保藏號(hào)為CGMCC No. 3388的紅球菌菌株Rhodococcus sp. JH。
紅球菌(Rhodococcussp. ) JH CGMCC No. 3388 的菌落特征在 LB 平板上 37°C培 養(yǎng)16h以上即形成圓形菌落，菌落大小直徑3-5mm，菌落邊緣整齊，表面濕潤(rùn)，光滑，桔黃色。紅球菌(Rhodococcus sp. ) JH CGMCC No. 3388的細(xì)胞形態(tài)特征革蘭氏染色呈陽(yáng) 性，菌體形態(tài)為球狀，多呈現(xiàn)雙球菌狀態(tài)；不產(chǎn)芽孢，細(xì)胞直徑約0. 6-1. 2 μ m。紅球菌(Rhodococcus sp. ) JH CGMCC No. 3388的生理生化特征生長(zhǎng)溫度范圍 15-50NaCl耐受性0-12% ；觸酶，檸檬酸鹽利用，MR實(shí)驗(yàn)，V-P實(shí)驗(yàn)，吲哚實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性； 纖維素水解，明膠液化，淀粉水解，脲酶實(shí)驗(yàn)皆為陰性。能夠利用山梨醇、果糖、葡萄糖，不能 利用乳糖、蔗糖、木糖醇、麥芽糖發(fā)酵產(chǎn)酸。降解烷烴和石油烴，產(chǎn)生生物乳化劑。紅球菌(Rhodococcussp. ) JH CGMCC No. 3388 的 16S rRNA 基因序列特 征CGMCCNo. 3388接種于LB培養(yǎng)基，37 "C搖床培養(yǎng)(130rpm) 12h，離心收集菌體， 重新懸浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因組DNA，并采用正相引物 27F(5，-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和反向引物 1541R(5，-AAGGAGGTGATCCAGCC-3，)，用 這對(duì)引物對(duì)其16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增引物送北京三博公司進(jìn)行測(cè)序。PCR條件 為94°C，IOmin ;94°C，45s，55°C，45s，72°C 908，30個(gè)循環(huán)；721 10min，4°C保存。16S rDNA 基因序列長(zhǎng)度為1479bp，在GenBank中的登錄號(hào)為*****,與Rhodococcus ruber strain DSM43338的16S rRNA(登錄號(hào)為NR_026185)序列相似性為97%，其16S rDNA的序列如序 列表1所示。#=JM《Bergey， s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol. VIII 的內(nèi)·，卞艮 其形態(tài)特征和生理生化特征，以及根據(jù)其16S rDNA基因序列在GenBank中的搜索結(jié)果，經(jīng) 多項(xiàng)分類(lèi)鑒定JH為一新菌，屬于紅球菌屬(Rhodococcus sp. JH)。紅球菌(Rhodococcus sp. ) JH CGMCC No. 3388可以在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，如普通牛肉 汁、LB、營(yíng)養(yǎng)瓊脂中生長(zhǎng)，也可以在添加葡萄糖或蔗糖的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，也可以以烷 烴或原油為碳源生長(zhǎng)。菌株在NaCl 0-12%的鹽濃度范圍內(nèi)生長(zhǎng)。該菌具有很高的降解石油烴的能力，可降解C12至C32的正構(gòu)烷烴、芳香烴和原 油。用JH生長(zhǎng)細(xì)胞進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，降解0.5% (w/v)的原油，在37°C下，往復(fù)搖床 130rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)72h，降解率可達(dá)82. 5%以上，對(duì)不同碳數(shù)的烷烴降解率都在65. 6%以上， 如圖1，2所示。本發(fā)明提供的CGMCC No. 3388菌能夠在0-12% NaCl濃度范圍內(nèi)解烴，在0-5% 的范圍內(nèi)降解率基本相同都在70%以上，最高74. 5% ；NaCl濃度為12%時(shí)，原油降解率為 45. 4%，如圖3所示。本發(fā)明提供的CGMCC No. 3388菌能在以烴為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng) 生產(chǎn)生物乳化劑。培養(yǎng)基組成為(g/L)Na2HPO4L 5 ；KH2P043. 48 ；MgSO4O. 7 ； (NH4)2S044 ；酵母 粉0. 01 ;0#柴油 2%，pH 自然。培養(yǎng)條件30°C_37°C，pH 7. 2，121°C滅菌30min，在 30°C _37°C 條件下，130rpm振蕩培養(yǎng)72h。經(jīng)發(fā)酵所獲得的含生物乳化劑的發(fā)酵液效果最好，發(fā)酵液中 生物乳化劑含量為2. 8g/L，菌濃可達(dá)6. 4X IO8個(gè)/ml。該發(fā)酵液對(duì)0#柴油的乳化能力為 100%，24h后乳化液穩(wěn)定，如圖4所示。本發(fā)明提供的CGMCC No. 3388菌在0-12%的不同NaCl濃度，生產(chǎn)的含生物乳化劑 的發(fā)酵液對(duì)柴油的乳化效果明顯。在NaCl濃度為0-5%的范圍內(nèi)，發(fā)酵液對(duì)柴油的乳化指 數(shù)均大于90 %，隨著鹽濃度升高，乳化指數(shù)降低，在NaCl濃度為10 %時(shí)，乳化指數(shù)為76 %，
6如圖5所示。CGMCC No. 3388菌所產(chǎn)生的生物乳化劑做Molish反應(yīng)判定糖類(lèi)，用Bradford比色 法測(cè)定蛋白，油紅0染色，實(shí)驗(yàn)表明該乳化劑含有蛋白質(zhì)和脂類(lèi)，不含糖。CGMCC No. 3388菌所產(chǎn)生的生物乳化劑有明顯的乳化能力，根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的乳 化能力測(cè)定方法，以0#柴油為乳化對(duì)象，乳化劑與0#柴油以7 3體積比混合，劇烈震蕩 lmin，靜置24h，乳化指數(shù)(Emusif ication index, EI-24)用乳化層的高度與測(cè)試烴的總高 度之比，乘以100%來(lái)計(jì)算。如果EI-24大于等于50%，則說(shuō)明乳狀液是穩(wěn)定的。結(jié)果表明 該乳化劑對(duì)二甲苯，甲苯，煤油和原油等都有很好的乳化作用，如表2所示。CGMCC No. 3388菌所產(chǎn)生的生物乳化劑能夠明顯的促使石油污染鹽堿土壤中石油 烴的降解。應(yīng)用本發(fā)明提供的CGMCC No. 3388菌在以烴為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵培 養(yǎng)生產(chǎn)的含生物乳化劑的發(fā)酵液可直接應(yīng)用于石油污染的鹽堿土壤，提高微生物對(duì)石油烴 的降解率，以及石油污染鹽堿土壤的生物修復(fù)中。具體應(yīng)用方法為將發(fā)酵液以(100 250)ml. kg—1干土的投加量噴灑到石油污染 的鹽堿土壤中，保持土壤濕潤(rùn)，即可完成石油污染的生物降解過(guò)程。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明提供的CGMCC No. 3388菌能夠在高鹽含量條件下降解多種烷烴和原油，并 可以以烴為碳源產(chǎn)生一種新型生物乳化劑，可以應(yīng)用在微生物生物修復(fù)石油污染鹽堿土壤 技術(shù)中。該菌株在0-12% NaCl范圍內(nèi)，以烴為碳源和能源生長(zhǎng)，能夠利用12碳至32碳的 正構(gòu)烷烴，對(duì)原油的降解率可達(dá)82. 5%以上；以烴為碳源在0-12% NaCl范圍內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng) 時(shí)，可產(chǎn)生一種新型的脂蛋白類(lèi)的生物乳化劑；該乳化劑對(duì)0#柴油，苯，二甲苯，煤油，原油 等具有很好的乳化效果，能夠提高烷烴和原油在水中的溶解度，明顯促進(jìn)活性菌株對(duì)烷烴 和原油的降解。該菌株及其產(chǎn)生的生物乳化劑適用于提高烴攝取效率，在微生物修復(fù)石油 污染土壤技術(shù)中應(yīng)用。

圖1是Rhodococcus sp. JH CGMCC No. 3388菌株對(duì)不同碳數(shù)烷烴的降解情況；圖2是Rhodococcus sp. JH CGMCC No. 3388菌對(duì)原油降解的高壓氣相色譜圖；圖 3 不同 NaCl 濃度下 Rhodococcus sp. JH CGMCC No. 3388 對(duì)原油的降解率；圖4是Rhodococcus sp. JH CGMCC No. 3388菌生產(chǎn)的生物乳化劑的發(fā)酵液對(duì)柴油 的乳化作用；圖5不同NaCl濃度下Rhodococcus sp. JH CGMCC No. 3388發(fā)酵液對(duì)柴油乳化情 況；圖6-1不同濃度生物乳化劑對(duì)柴油的乳化指數(shù)；圖6-2在不同溫度下乳狀液放置24h后的穩(wěn)定性；圖6-3生物乳化劑在不同NaCl濃度下對(duì)柴油的乳化指數(shù)；圖7生物乳化劑發(fā)酵液不同投加量的條件下對(duì)土壤中石油烴去除率曲線(xiàn)；圖8不同溫度條件下對(duì)土壤中石油烴去除率曲線(xiàn)；
圖 9Rhodococcus sp. JH CGMCC No. 3388 菌對(duì) 1# 試驗(yàn)田生物修復(fù)效果。
具體實(shí)施方式實(shí)施例1 本發(fā)明提供的Rhodococcus sp. JH菌株的分離篩選取石油污染鹽堿土土樣lg，無(wú)菌接種至IOOml無(wú)機(jī)鹽液蠟培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基組成 Na2HPO4L 5g ；KH2P043 . 48g ；MgSO4O. 7g ； (NH4)2S044g ；酵母粉 0. Olg ；液體石蠟 2% (v/w)，蒸 餾水IOOOml ；pH自然；121°C滅菌30min)，37°C搖床往復(fù)振蕩培養(yǎng)5d。將富集培養(yǎng)液充分 混勻，取100μ 1涂布在1. 5% LB固體平板上，37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2_3d，觀察生長(zhǎng)出的 菌落。挑取單菌落并用顯微鏡檢驗(yàn)其純度。將生長(zhǎng)的各個(gè)菌落，接種至LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 至OD63tl為0. 8左右，作為種子液以10% (ν/ν)比例接入IOOml無(wú)機(jī)鹽液蠟培養(yǎng)基中，37°C 搖床往復(fù)振蕩培養(yǎng)5d。然后以此發(fā)酵液作為種子液，接種至新鮮的無(wú)機(jī)鹽液蠟培養(yǎng)基，反復(fù) 馴化菌種3-4次。選取對(duì)液蠟乳化良好的菌種進(jìn)行原油降解試驗(yàn)。將菌落接種至液蠟培養(yǎng)基培養(yǎng) 3d左右，作為種子以10% (ν/ν)比例接入液接入到IOOml原油培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基組成 Na2HPO4L 5g ；KH2P043 . 48g ；MgSO4O. 7g ； (NH4)2S044g ；酵母粉 0. Olg ；原油 0. 5 % (w/w)，蒸餾 水IOOOml ；pH自然；121°C滅菌30min)，37°C震蕩培養(yǎng)5d后測(cè)定原油降解率。油類(lèi)測(cè)定方 法采用紅外法，即發(fā)酵液用IOOml四氯化碳萃取，用紅外測(cè)油儀測(cè)定剩余原油的量，降解率 (% ) = ι-剩余原油的量/加入原油的量X 100% ；采用高壓氣相色譜方法檢測(cè)原油的降 解情況。選取對(duì)液蠟乳化良好的菌種發(fā)酵液用來(lái)測(cè)量乳化指數(shù)(EI-24)，以篩選能夠利用 烴產(chǎn)乳化劑的菌株，最終得到一株能夠乳化和降解原油，并利用烴類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生生物乳化劑 的保藏號(hào)為CGMCC No. 3388的紅球菌菌株(Rhodococcus sp.) JH。實(shí)施例2 Rhodococcus sp. JH菌株的16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定Rhodococcus sp. JH CGMCC No. 3388 接種于 LB 培養(yǎng)基，37 "C 搖床培養(yǎng) (130rpm) 16小時(shí)，離心收集菌體，重新懸浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提 取基因組DNA，并采用正相引物27F(5，-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和反向引物 1541R(5，-AAGGAGGTGATCCAGCC-3，)，用這對(duì)引物對(duì)其16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增 引物送上海生工進(jìn)行測(cè)序。PCR條件為:94°C, IOmin ；94°C，45s，55°C，45s，72°C 90s，30個(gè) 循環(huán)；72°C 10min，4°C保存。16S rRNA基因序列長(zhǎng)度為1479bp，在GenBank中的登錄號(hào)為 HM134277，與 Rhodococcus ruber strain :DSM43338 的 16S rRNA (登錄號(hào)為 NR 026185)序 列相似性為97%。其16S rRNA的序列如序列表所示。實(shí)施例3 本發(fā)明提供的Rhodococcus sp. JH菌株對(duì)烷烴和勝利油田濱南采油廠(chǎng)原油的降解 將菌株在LB平板上進(jìn)行活化，取單菌落接入5ml LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，以接種量 接種至100ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)5h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以10%接種量接種至裝有 100ml含有不同烷烴或原油為碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成同實(shí)施例1)的錐形瓶中， 37°C培養(yǎng)3d，用氣相色譜法分析，該菌株對(duì)不同碳數(shù)烷烴的降解率，用紅外測(cè)油儀測(cè)定原油的降解率并用高壓氣相色譜法進(jìn)行殘留原油的氣相色譜分析，結(jié)果如圖1和圖2所示。該 菌株對(duì)C12至C32烷烴，降解率均在65. 6%以上，對(duì)原油的降解率可達(dá)82. 5%。實(shí)施例4 本發(fā)明提供的Rhodococcus sp. JH菌株在不同鹽濃度下對(duì)原油的降解情況在以原油為碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成同實(shí)施例1)中，添加不同濃度的 NaCl，接入Rhodococcus sp. JH菌株，3d后測(cè)定用紅外測(cè)油儀不同濃度下原油降解率(同 實(shí)施例3)。結(jié)果如圖3所示。JH菌株在NaCl濃度0-12%的范圍內(nèi)對(duì)原油都有不同程度 的降解，在0-5%的范圍內(nèi)降解率基本相同都在70%以上，最高74. 5% ；隨著鹽濃度的升 高降解率逐漸降低，NaCl濃度為12%時(shí)，原油降解率為45.4%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，烴降解菌 Rhodococcussp. JH CGMCC No. 3388 菌株對(duì) NaCl 有很好的耐受性。實(shí)施例5 本發(fā)明提供的Rhodococcus sp. JH菌株產(chǎn)生生物乳化劑的條件通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)條件(通氧量，發(fā)酵周期等)，等試驗(yàn)獲得該 Rhodococcus sp. JH菌株產(chǎn)生生物乳化劑的最佳培養(yǎng)基為g/L =Na2HPO4L 5g ；KH2P043 . 48g ； MgSO4O. 7g ； (NH4)2S044g ；酵母粉 0. Olg ;0# 柴油 2% (v/w)，蒸餾水 IOOOml ；pH 自然；121°C滅 菌30min，最佳培養(yǎng)條件為初始pH 7.2, 37°C，130rpm培養(yǎng)72h。該培養(yǎng)條件下，加入的液 蠟?zāi)軌蛲耆榛?，通過(guò)測(cè)量對(duì)柴油的乳化指數(shù)(EI-24)可達(dá)100%，如圖4所示，并可穩(wěn)定 7d以上。該乳化劑對(duì)二甲苯，甲苯，煤油和原油等也都有很好的乳化作用，如表2所示。表 2
______^____^^______________________
測(cè)試烴 二甲苯 甲苯 煤油原油—一—
EI24 (%) 10098.610090.2實(shí)施例6 本發(fā)明提供的Rhodococcus sp. JH菌株在不同鹽濃度下產(chǎn)生物乳化劑情況Rhodococcus sp. JH菌株在產(chǎn)生生物乳化劑的培養(yǎng)基中(同實(shí)施例5)培養(yǎng)發(fā)酵， 在培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaCl (0-12% )，37°C，130rpm培養(yǎng)72h。發(fā)酵結(jié)束后，用發(fā)酵液 測(cè)定對(duì)柴油的乳化能力，結(jié)果如圖5所示。在NaCl濃度為0-5 %的范圍內(nèi)，發(fā)酵液對(duì)柴油的 乳化指數(shù)均大于90%，隨著鹽濃度升高，乳化指數(shù)降低，在NaCl濃度為10%時(shí)，乳化指數(shù)為 76%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Rhodococcus sp. JH菌株在不同0-12%范圍的鹽濃度下可產(chǎn)生生物 乳化劑，其發(fā)酵液對(duì)柴油有很好的乳化效果。實(shí)施例7 本發(fā)明提供的Rhodococcus sp. JH菌株所產(chǎn)生的生物乳化劑的分離提取Rhodococcus sp. JH菌株在產(chǎn)生生物乳化劑的培養(yǎng)基和條件下(同實(shí)施例5)培養(yǎng) 發(fā)酵，發(fā)酵液用濾紙過(guò)濾，濾液在SOOOrpm 4°C離心除去菌體后，加入3倍體積冰冷丙酮或 者工業(yè)酒精，用玻璃棒攪拌均勻，置于4°C過(guò)夜，離心得沉淀，將沉淀透析后冷凍干燥，得乳 化活性物質(zhì)，該物質(zhì)溶于雙蒸水后對(duì)柴油的乳化能力為100%。在光學(xué)顯微鏡下觀察乳化液 滴的大小，隨即測(cè)量20個(gè)液滴，計(jì)算乳化液滴的平均大小，如表3所示，提取的乳化活性物 質(zhì)對(duì)柴油作用后，產(chǎn)生的乳化液滴約為發(fā)酵液作用的1/4。
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權(quán)利要求
一種產(chǎn)生生物乳化劑和降解烷烴的耐鹽紅球菌，其特征在于該耐鹽紅球菌為紅球菌(Rhodococcus sp.)JH菌株，于2009年11月04日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)為CGMCC No.3388。
2.如權(quán)利要求1所述的一種耐鹽紅球菌，其特征在于所述的紅球菌Rhodococcus sp. JH CGMCC No. 3388菌株，其16S rRNA的核苷酸序列如序列表1所示。
3.如權(quán)利要求1所述的紅球菌(Rhodococcussp.) JH CGMCC No. 3388菌株，其菌落特 征，在LB平板上37°C培養(yǎng)16h以上即形成圓形菌落，菌落大小直徑3-5mm，菌落邊緣整齊， 表面濕潤(rùn)，光滑，桔黃色，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)為球狀，多呈現(xiàn)雙球菌狀態(tài)；革蘭氏染色 呈陽(yáng)性；不產(chǎn)芽孢，細(xì)胞直徑約0. 6-1. 2 μ m，生長(zhǎng)溫度范圍15-50°C，NaCl耐受性0_12%， PH生長(zhǎng)范圍5-9，觸酶，檸檬酸鹽利用，MR實(shí)驗(yàn)，V-P實(shí)驗(yàn)，吲哚實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性；纖維素水解， 明膠液化，淀粉水解，脲酶實(shí)驗(yàn)皆為陰性，能夠利用山梨醇、果糖、葡萄糖，不能利用乳糖、蔗 糖、木糖醇、麥芽糖發(fā)酵產(chǎn)酸。
4.如權(quán)利要求1所述的耐鹽紅球菌，其特征在于該菌種可以在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基普通牛肉 汁、LB、營(yíng)養(yǎng)瓊脂中生長(zhǎng)；也可以在添加葡萄糖或蔗糖的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；也可以以烷 烴或原油為碳源培養(yǎng)生長(zhǎng)。
5.如權(quán)利要求1或4所述的耐鹽紅球菌，其特征在于該菌種可以在NaCl在質(zhì)量百分 比濃度為0-12%的鹽濃度范圍內(nèi)生長(zhǎng)。
6.如權(quán)利要求1所述的耐鹽紅球菌在石油污染鹽堿土壤生物修復(fù)中的應(yīng)用，其特征在 于應(yīng)用本菌種在以烴為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)的含生物乳化劑的發(fā)酵 液，可直接應(yīng)用于石油污染的鹽堿土壤中，強(qiáng)化石油污染土壤中烷烴和原油的生物降解，實(shí) 現(xiàn)石油污染的鹽堿土壤的生物修復(fù)。
7.如權(quán)利要求6所述的耐鹽紅球菌在石油污染鹽堿土壤生物修復(fù)中的應(yīng)用，其特征在 于所說(shuō)的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基組成為(g/L)Na2HPO4L 5、KH2P043. 48,MgSO4O. 7、(NH4)2S044、酵母粉 0. 01、0# 柴油 2%。
8.如權(quán)利要求6所述的耐鹽紅球菌在石油污染鹽堿土壤生物修復(fù)中的應(yīng)用，其特 征在于所說(shuō)的發(fā)酵培養(yǎng)含生物乳化劑的發(fā)酵液的條件為溫度30°C -37pH 7. 2，在 300C -37°C條件下，130rpm振蕩培養(yǎng)72h。
9.如權(quán)利要求6所述的耐鹽紅球菌在石油污染鹽堿土壤生物修復(fù)中的應(yīng)用，其特征在 于所說(shuō)的發(fā)酵液中生物乳化劑含量為2. 8g/L，菌株濃度達(dá)6. 4X IO8個(gè)/ml。
10.具體應(yīng)用方法為將發(fā)酵液以(100 250)ml.kg—1干土的投加量，噴灑到石油污染 的鹽堿土壤中，保持土壤濕潤(rùn)，即可完成石油污染的生物降解過(guò)程。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物生物技術(shù)和環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，它涉及一株耐鹽紅球菌Rhodococcus sp.JH，一種由該菌發(fā)酵產(chǎn)生的生物乳化劑，及其在石油污染鹽堿土壤生物修復(fù)中的應(yīng)用。該耐鹽紅球菌為紅球菌(Rhodococcus sp.)JH菌株，于2009年11月04日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)為CGMCC No.3388。應(yīng)用本發(fā)明提供的CGMCC No.3388菌在以烴為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)的含生物乳化劑的發(fā)酵液可直接應(yīng)用于石油污染的鹽堿土壤，提高微生物對(duì)石油烴的降解率，以及石油污染鹽堿土壤的生物修復(fù)中。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101974446SQ20101021798
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月29日
發(fā)明者姚志剛, 王君, 范延輝 申請(qǐng)人:濱州學(xué)院