專(zhuān)利名稱(chēng)：一種高羊茅衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及高羊茅衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物衰老是指一個(gè)器官或整個(gè)植物生命功能逐漸衰退的過(guò)程，是在自然死亡前 生理上的一系列衰退過(guò)程，是長(zhǎng)期進(jìn)化和自然選擇的結(jié)果(李晴，朱玉賢，分子植物育種， 第1卷，第3期，2003年)。關(guān)于植物衰老的研究主要集中在葉片衰老的研究上。在葉片 衰老過(guò)程中，細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理生化代謝以及基因表達(dá)調(diào)控等都發(fā)生很多變化(Gepstein S， Genome Biology,5(3) 212,2004 ；Chandlee JM, Physiologia Plantarum,113 1-8,2001 ； Nam HG, Trends Plant Sci，8(6) =272-277, 2003) 關(guān)于葉片衰老在生理學(xué)，生物化學(xué)和分 子生物學(xué)方面已有不少報(bào)道(Yoshida S. Current Opinion in Plant Biology，6 :79_84， 2003 ；Larry et al, Physiol Plant,101 :746_753，1997 ；Nam HG, Curr Opin Biotech,8 200-207,1997 ；Smart CM,New Phytol, 126 =419-448,1994 ；Nam HG,Annu Rev Plant Biol, 58:115-36,2007 ；Betania et al Trends Plant Sci，5(7) :278_282. 2000)。NAC是高等植物中所特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，其命名來(lái)源于上世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)的3 個(gè)基因矮牽牛 NAM 基因、擬南芥 ATAF1/2 和 CUC2 基因(Aida M, et al, Plant Cell,9(6) 841-857，1997)。NAC轉(zhuǎn)錄因子最主要的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是各成員的N端含有高度保守的NAC結(jié) 構(gòu)域，整個(gè)N端區(qū)域可劃分為5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(A、B、C、D、E)，其中亞結(jié)構(gòu)域A、C、D高度保守， 亞結(jié)構(gòu)域C、D序列中含有核定位信號(hào)(nuclear localization signals，NLS)，可能與轉(zhuǎn) 錄因子核定位及啟動(dòng)子上特定順式元件的識(shí)別有關(guān)(Kikuchi K，et al, Mol Gen Genet, 262(6) 1047-1051,2000 ；Ooka H, et al, DNA Res, 10(6) :239_247，2003)。E 亞結(jié)構(gòu)域在 NAP、AtNAC3、ATAF 和 0sNAC3 亞家族中高度保守(Ooka H, et al，DNA Res, 10(6) :239_247， 2003)。C 端是轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)(transcrip tional activation regiohs，TARs)，具有高度 的多樣性，該端的共同特點(diǎn)是一些氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、谷氨酸重復(fù)出現(xiàn)的頻 率高。NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物頂端分生組織及花器官分化(Sablowski，et al, Cell,92(1) 93-103，1998)、側(cè)根形成(Mitsuda N, et al, Plant Cell, 17(11) :2993_3006，2005)、次生 壁增厚(Xie Q，et al,Genes Dev，14(23) :3024_3036，2000)等植物特定發(fā)育過(guò)程以及抵抗 生物(Hegedus D，et al,Plant Mol. Biol，53 :383_397，2003)與非生物脅迫過(guò)程(Nogueira FT, Plant Science, 169 =93-106,2005)中均起著重要作用，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物衰老進(jìn)程 也起著重要的調(diào)控作用(GU0 YF, GAN S, Plant Journal, 46 (4) =601-612, 2006) 高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)為羊茅屬植物，又叫葦狀羊茅。其原產(chǎn) 地為歐洲，在我國(guó)黑龍江、北京、山東、江蘇、湖南、江西等很多地方都已引種栽培(孫本信， 尹公，張綿，草坪植物種植技術(shù)，北京中國(guó)林業(yè)出版社，2001年)。其因適口性好且成坪效 果佳，成為倍受人們重視的著名牧草和草坪草(王新海，四川草原，第5期，2003年)。高羊 茅在畜牧業(yè)(彭澤，農(nóng)業(yè)知識(shí)(科學(xué)養(yǎng)殖)，第11期，2004年)、城市園林綠化、水土保持及體育等產(chǎn)業(yè)中都有舉足輕重的作用。延緩高羊茅葉片衰老對(duì)于增加其產(chǎn)量，加快畜牧業(yè)的 發(fā)展以及更好更長(zhǎng)久的維持草坪性狀都具有重要的意義。長(zhǎng)期以來(lái)，高羊茅新品種的培育 基本上都是依靠傳統(tǒng)育種方法。雖然許多性狀已經(jīng)得到長(zhǎng)足改進(jìn)，但其局限性也日益明顯。 遺傳工程在改良高羊茅性狀方面已顯示出了難以比擬的優(yōu)越性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高羊茅衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因。本發(fā)明所提供的高羊茅衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，來(lái)源于高羊茅(Fastuca arundinacea)，名稱(chēng)為FaNACl，是具有SEQ ID NO :2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將 SEQID NO 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有與SEQ ID NO 2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO 2衍生的蛋白質(zhì)。高羊茅衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，是下列核苷酸之一1) SEQ ID NO 1 所示的 DNA 序列。2)編碼SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的多核苷酸。序列表中，SEQ ID NO 1由1305個(gè)堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)樽?，端第138位 至1160位堿基；SEQ ID NO 2由340個(gè)氨基酸殘基組成。本發(fā)明還包括所述高羊茅衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的表達(dá)載體。本發(fā)明還包括所述高羊茅衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的細(xì)胞系。本發(fā)明還包括所述高羊茅衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因在高羊茅延緩衰老分子 機(jī)制中的應(yīng)用。本發(fā)明還包括所述高羊茅衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因在延緩植物衰老性狀改 良中的應(yīng)用。


圖1為284bp中間片斷擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜。圖2為928bp 3’端擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜。圖3為658bp 5’端擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜。圖4FaNACl表達(dá)模式分析。圖5正常生長(zhǎng)23天時(shí)，野生型，過(guò)表達(dá)FaNACl轉(zhuǎn)基因植株的表型。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1高羊茅衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的獲得1. IRNA 提取取衰老的高羊茅葉片材料約0. lg。液氮充分研磨后，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管， 加Iml TRIzol (invitrogen公司)，混勻后，室溫放置15分鐘，加0. 2ml氯仿異戊醇 (24 1)，劇烈搖動(dòng)15秒后室溫放置5分鐘，13000rpm, 4°C離心15分鐘。取上清液并加入 等體積異丙醇，小心混勻，室溫放置15分鐘，13000rpm，4°C離心15分鐘。70%乙醇洗滌沉 淀，室溫干燥15分鐘。溶解于適量的經(jīng)0. 1 % DEPC處理過(guò)的ddH20水中，貯存于_80°C備 用。
1. 2cDNA第一鏈合成和反轉(zhuǎn)錄PCR采用上海申能博彩生物技術(shù)公司(SHBC)的cDNA第一鏈合成試劑盒，按照操作指 南將總RNA反轉(zhuǎn)錄成eDNA。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別為2ug制備的總RNA，0. 5ul Rnase inhibitor，加 DEPC 處理過(guò)的去離子水至 8. 5ul，2ul 的 Oligo (dT) 18primer. 65°C，5min，室 溫放置 lOmin，13000rpm 簡(jiǎn)短離心 5s。再依次加入 4μ1 5 X First-Strand buffer, 0. 5 μ 1 RNase Inhibitor, 2 μ 1 IOOmM DTT,2y 1 dNTP, 1 μ 1 MMLV Reverse Transcriptiise。 混勻；37°C反轉(zhuǎn)錄1小時(shí)，90°C 5分鐘；冰上冷卻；13000rpm短暫離心5秒鐘，存放于_20°C 待用1. 3RT-PCR 擴(kuò)增 FaNACl 中間片斷 根據(jù)其他植物中分離得到的NAC家族的保守序列，設(shè)計(jì)了兩條同源兼并 弓丨物 FaNAClCF (5，TTCAGCCCGCGGGACCGCAAGTA 3，(SEQID NO 3))禾口 FaNAClCR: (5，TAGATCCGGCACAGCACCCAGTCATC 3，(SEQ ID NO 4))作為 PCR 反應(yīng)的引物。PCR 反應(yīng)體 系為50ul,反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s，55°C復(fù)性40s，72°C延伸30s，循 環(huán)38次。72°C充分延伸lOmin。將所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分離獲得一段約 284bp的片斷?；厥詹⑶彝ㄟ^(guò)TA克隆至TAKARA pMD_19_T載體后，由上海英駿公司測(cè)序，獲 得FaNACl的中間序列。1. 4FaNACl全序列的獲得1. 4. IFaNACl的3’末端序列的擴(kuò)增FaNACl的3，末端序列擴(kuò)增使用Clontech公司的BD-SMARTTMRACE試劑盒。根據(jù) 已經(jīng)獲得的保守序列設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性引物進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)。FaNACl3，RACE F :5，CAGGGGCGTCAAGACCGACTGGATAAT 3，(SEQID NO 5)FaNACl 3，RACE NF :5，CGTCAAGACCGACTGGATAATG 3，(SEQ ID NO 6)反應(yīng)條件分別為第一輪PCR 反應(yīng)94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 40s，62°C復(fù)性 40s，72°C延伸 70s，循 環(huán)38次。72°C充分延伸IOmin。第二輪PCR 反應(yīng)94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 40s，54°C復(fù)性 40s，72°C延伸 70s，循 環(huán)38次。72°C充分延伸IOmin。第二輪PCR反應(yīng)結(jié)束后，1 %電泳檢測(cè)，獲得約928bp的片段，割膠回收并克隆至克 隆載體進(jìn)行測(cè)序，獲得3’末端序列。1. 4. 25，RACE法擴(kuò)增FaNACl的末端序列按照Clontech公司的SMART RACE試劑盒方法，設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性引物進(jìn)行巢式 PCR反應(yīng)FaNACl 5，RACE F :5，CACAGCACCCAGTCATCCAGCCTCAT 3，(SEQID NO 7)FaNACl5，RACE NF :5，CGCTTGGTGGTCTTGCTGTC 3，(SEQID NO 8)再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離獲得約658bp的PCR片斷。最后經(jīng)割膠回收，克隆至克 隆載體，測(cè)序，最終獲得FaNACl的5’末端序列。 第一輪PCR反應(yīng)條件94 °C預(yù)變性5min，94 °C變性40s，64 °C復(fù)性40s，72 °C延伸 40s，循環(huán)35次。72°C充分延伸IOmin。 第二輪PCR反應(yīng)條件94 °C預(yù)變性5min，94 °C變性40s，54 °C復(fù)性40s，72 °C延伸40s，循環(huán)38次。72°C充分延伸IOmin。根據(jù)已經(jīng)獲得的FaNAC13’末端序列和5’末端序列以及中間序列拼接獲得了 FaNACl的全長(zhǎng)序列。實(shí)施例2FaNACl序列相似性分析利用NCBI BLAST 程序(http //www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)對(duì) FaNACl 進(jìn)行 序列相似性分析表明，F(xiàn)aNACl與小麥中的NAC69-1轉(zhuǎn)錄因子最相似，相似性達(dá)87%，一致性 達(dá) 79%。實(shí)施例3FaNACl表達(dá)模式分析3. 1高羊茅ACTIN保守片斷的獲得根據(jù)其他植物中分離得到的ACTIN保守序列，設(shè)計(jì)了如下一對(duì)引物擴(kuò)增高羊茅 ACTIN保守片斷FaActinF :5，GAAGCACAATCCAAAAGAGGTAT 3，(SEQID NO 9)FaActinR :5，GAGCCTCCGATCCAGACACT3，(SEQ ID NO 10)PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s，52°C復(fù)性30s，72°C延伸60s，循環(huán) 38次。72°C充分延伸IOmin0將所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分離回收，測(cè)序，NCBI比對(duì)驗(yàn)證。3. 2FaNACl表達(dá)模式分析1)取自然生長(zhǎng)狀態(tài)下嫩綠，開(kāi)始衰老以及衰老的高羊茅葉片，按照本專(zhuān)利1. 1中 的方法抽提RNA，并按1. 2中的方法進(jìn)行第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄。2)取黑暗處理0天、3天、6天、9天的高羊茅葉片，按照本專(zhuān)利1. 1中的方法抽提 RNA,并按1. 2中的方法進(jìn)行第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄。3) Real-time 實(shí)時(shí)定量 PCR 使用日本 Toyobo 公司的 SYBR Green II PCR kit。所用的引物如下FaNAClRT-F :5，CCGACAGCAAGACCACCAAGC 3，(SEQ ID NO 11)FaNAClRT-R :5’ GCTTCAGACTTGGGGGAGGACAC 3’ (SEQ ID NO 12)FaACTINRT-F :5，CAGGCGGTGCTCTCCCTCTATG 3，(SEQ ID NO 13)FaACTINRT-R :5，CCCGCTCGGTTGAAGTTGTGAAG 3，(SEQ ID NO 14)PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，62°C復(fù)性25s，72°C延伸20s，循環(huán) 40次。利用Real-time PCR檢測(cè)自然生長(zhǎng)狀態(tài)下不同生長(zhǎng)階段以及黑暗處理不同時(shí)間 的高羊茅葉片內(nèi)FaNACl的表達(dá)量，結(jié)果表明，在自然生長(zhǎng)狀態(tài)下隨著葉片衰老程度的增加 FaNACl的表達(dá)量不斷升高；黑暗處理?xiàng)l件下FaNACl的表達(dá)量也隨著黑暗處理時(shí)間的增長(zhǎng) 而升高，但上升趨勢(shì)不如自然衰老誘導(dǎo)明顯。實(shí)施例4FaNACl功能分析4. 1組成型過(guò)表達(dá)FaNACl植物表達(dá)載體構(gòu)建利用引物FaNAClELF和FaNAClELR擴(kuò)增出FaNACl的CDS，測(cè)序無(wú)誤之后，使用Kpn I和Xba I雙酶切，回收純化目的片斷，并連接至經(jīng)過(guò)同樣兩個(gè)酶酶切，純化的pCHF3載體 上，命名為 FaNACl-pCHF3。FaNAClELF :5’ TGCTTATTGGTTGGAGAGTGGAC 3’ (SEQ ID NO 15)
FaNAClELR :5，CACAGCCTTCTCAGTTCGCAC 3，(SEQ ID NO 16)4. 2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化4. 2. 1LBA4404農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備1)在含利福霉素40ug/ml，鏈霉素100ug/ml的YEB固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)， 28°C培養(yǎng) 48h-72h ；2)挑單菌落到含利福霉素40ug/ml，鏈霉素100ug/ml的YEB液體培養(yǎng)基中28°C培 養(yǎng)至 OD6qqO. 5 ；3)冰上冷卻菌液，5000rpm, 4°C 10分鐘收集菌體；4) ImM Hepes pH 7. O洗滌3次，再用10%甘油洗滌一次；5)懸浮菌體于3ml 10%甘油中，分裝到1. 5ml離心管中，每管40ul。4. 2. 2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化1) 200ng質(zhì)粒DNA，加40ul農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞混勻后按以下條件進(jìn)行電轉(zhuǎn)化U 1. 8KVR 200 ΩC 25uF2)電擊后添加800ul SOC液體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)Ih ；3)4000rpm, 10分鐘收集菌體，懸浮于200ul SOC中，涂在含100ug/ml壯觀霉素，利 福平40ug/ml，鏈霉素100ug/ml LB固體培養(yǎng)基上，28°C倒置培養(yǎng)48h_72h。4. 3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化4. 3. 1擬南芥基質(zhì)培養(yǎng)基質(zhì)組分蛭石黑土 珍珠巖9 3 0. 5營(yíng)養(yǎng)液組分
—母液每升營(yíng)養(yǎng)液
KNO31 mol/L5 ml
KH2PO4 pH5.6 1 mol/L2.5 ml---
MgSO41 mol/L2 ml
Ca(NO3)21 mol/L2 ml
Fe-EDTA0.02 mol/L2.5 ml
基質(zhì)浸透營(yíng)養(yǎng)液后，將種子播于缽子中，用保鮮膜覆蓋，置于4°C黑暗條件下，2天 后轉(zhuǎn)入(16h L/8h D)光照，23°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)。擬南芥生長(zhǎng)到抽苔開(kāi)花即可供轉(zhuǎn)化。4. 3. 2農(nóng)桿菌準(zhǔn)備1)接種攜帶目的表達(dá)載體的農(nóng)桿菌到含適量抗生素的YEB培養(yǎng)基中，28°C， 220rpm 搖菌培養(yǎng)至 OD6tltlL 2。2) 5000rpm, 4°C 10分鐘離心收集菌體。3)菌體重新懸浮于5%的蔗糖溶液中，并調(diào)至0D_0. 8。4)加入 Si Iwet L-77 至終濃度為 0. 03%。4. 3. 3擬南芥轉(zhuǎn)化取擬南芥材料，倒置浸泡地上部分于預(yù)備好的農(nóng)桿菌溶液中，晃動(dòng)約3秒，取出， 放置到蔭蔽條件下，保濕24h，轉(zhuǎn)入正常條件培養(yǎng)。4. 3. 4擬南芥轉(zhuǎn)化子篩選收集轉(zhuǎn)化后擬南芥的種子。種子用0. 1 % HgCl2表面滅菌5分鐘，無(wú)菌水沖洗4次， 懸浮在0.1%的瓊脂糖中，然后按每平板(直徑15cm) 2000粒種子(約40mg)，鋪在卡那霉 素50mg/L，l/2MS培養(yǎng)基上。將平板置于4°C黑暗冰箱中2天，轉(zhuǎn)移到(16h L/8h D)光照， 23°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)。約10天左右可篩選出具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因植株。將具抗性 的植株轉(zhuǎn)移到基質(zhì)培養(yǎng)，并收獲T1代種子。4. 4過(guò)表達(dá)FaNACl轉(zhuǎn)基因植株表型鑒定收獲的Tl代轉(zhuǎn)基因植株種子經(jīng)表面滅菌后鋪在含50mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基 上，4°C黑暗冰箱中放置2天后，轉(zhuǎn)移到(16h L/8h D)光照，23°C條件下培養(yǎng)。在自然生長(zhǎng)狀 態(tài)下，通過(guò)觀察轉(zhuǎn)基因植株，野生型植株Col-O的衰老進(jìn)程發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株在第23天甚至 更早就出現(xiàn)了明顯的衰老現(xiàn)象(提前抽苔，葉片黃化)，衰老進(jìn)程明顯快于野生型植株(第 23天尚未出現(xiàn)衰老現(xiàn)象)。
權(quán)利要求
一種高羊茅衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于是具有SEQ ID NO2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有與SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO2衍生的蛋白質(zhì)。
2.高羊茅衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，其特征在于是下列核苷酸之一1)SEQID NO 1所示的DNA序列；2)編碼SEQID NO :2所示氨基酸序列的多核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于該基因的編碼框?yàn)樽?’端第138位至第 1160位堿基的DNA序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述高羊茅衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求2或3所述高羊茅衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的細(xì)胞系。
6.如權(quán)利要求2或3所述高羊茅衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因在高羊茅延緩衰老分子 機(jī)制中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求2或3所述高羊茅衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因在延緩植物衰老性狀改 良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種高羊茅衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，來(lái)源于高羊茅，名稱(chēng)為FaNACl，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。高羊茅衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，是下列核苷酸序列之一(1)序列表中的SEQ ID NO1；(2)編碼序列表中SEQ ID NO2氨基酸序列的多核苷酸。本發(fā)明的基因?qū)⒃谘泳徃哐蛎┧ダ闲誀罡牧贾邪l(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101885763SQ201010217739
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月1日
發(fā)明者孫鎮(zhèn)菲, 張艷艷, 梁寧菁, 蒯本科, 郭玉娟, 魏強(qiáng) 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)