專利名稱：使用aromatoleum aromaticum ebn1(固氮弧菌屬物種ebn1)的醇脫氫酶生產(chǎn)l-去氧腎上 ...的制作方法
使用AROMATOLEUM AROMATI CUM EBN1 (固氮弧菌屬物種 EBN1)的醇脫氫酶生產(chǎn)L-去氧腎上腺素的方法本發(fā)明涉及生產(chǎn)取代的光活性醇的多階段方法，包括酶催化的合成步驟，特別是由醇脫氫酶所催化。本發(fā)明的方法尤其適合生產(chǎn)去氧腎上腺素，即3-[(IR)-I-羥基-2-甲氨基-乙基]-酚。
背景技術(shù)：
去氧腎上腺素是擬交感類中的藥理學活性物質(zhì)并且擁有對α r腎上腺素能受體的激動劑活性。除了丟失3-羥基外，它在結(jié)構(gòu)上與腎上腺素相同并且主要可用作局部血管收縮劑。作為鼻滴液的活性物質(zhì)，去氧腎上腺素因此對粘膜具有解充血藥的作用。在眼藥水中，它也具有散瞳作用，因此造成瞳孔放大。已在文獻中描述了去氧腎上腺素的生產(chǎn)。除了生產(chǎn)象外消旋物一樣的想要產(chǎn)物然后用適當?shù)氖中暂o助試劑進行切割將它轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的多種方法以外，認為立體選擇性合成的方法是優(yōu)選的，因為它隨后能夠避免所得到的50%的不正確對映體的不經(jīng)濟破壞。從現(xiàn)有技術(shù)中已知的生產(chǎn)L-去氧腎上腺素鹽酸鹽的方法包括根據(jù)Tetrahedron Letters 30 (1989)，367-370 或 Chem. Pharm. Bull. 43 (5) (1995) 738-747 對前手性 N-節(jié)基-N-甲基-2-氨基-m-芐氧基苯乙酮鹽酸鹽的不對稱氫化作用。Achiwa 等人在 ^Tetrahedron Letters 30 (1989)，367-370 中描述了 3-節(jié)氧基-2-(N-芐基-N-甲基)_氨基苯乙酮鹽酸鹽作為底物與氫在催化劑Wh(COD) Cl] 2A2R， 4R) -4- ( 二環(huán)己基膦)-2- ( 二苯基膦-甲基)-N-甲基-氨基吡咯烷存在下的不對稱氫化作用。通過蒸發(fā)對反應混合物過濾并濃縮后立即切割芐基氮保護基團并且獲得去氧腎上腺素作為產(chǎn)物。D-對映體作為雜質(zhì)以至少7. 5% (85% ee)的比例與L-對映體一起生產(chǎn)。對于該反應，催化劑必須以相對于底物為1 2000的摩爾比來使用。這一方法的缺點實質(zhì)上是所獲得的需要用作藥物產(chǎn)品的L-去氧腎上腺素不能經(jīng)濟地純化為至少98% ee的純度。在Chem. Pharm. Bull. 43(5) (1995)738-747 中，說明了約 1000 1 的底物與催化劑的摩爾比對于不對稱氫化作用是優(yōu)選的。然而，盡管在不對稱反應步驟中使用了相當大量的催化劑，但是沒有昂貴的純化過程就不能以足夠的純度將產(chǎn)物生產(chǎn)為用于藥物目的的 L-對映體，而只可以獲得具有相對高比例的D-對映體作為雜質(zhì)的混合物產(chǎn)物。對于工業(yè)規(guī)模的L-去氧腎上腺素的生產(chǎn)，將近20小時的相對長的不對稱氫化作用步驟的反應時間也代表了對于設備而言昂貴且耗時的反應步驟，且不能忽視安全性風險。WO 00/43345中描述的方法滿足了經(jīng)濟上有意義地生產(chǎn)L-去氧腎上腺素鹽酸鹽所述的一些條件，但是其也仍舊需要使用保護基團，以致該方法變得不很經(jīng)濟。此外，即使根據(jù)這一方法，但是在立體選擇步驟中，只獲得93% ee的想要的產(chǎn)物，以致再一次必須在這之后進行昂貴的純化。發(fā)明簡要說明因此，本發(fā)明要解決的問題是提供生產(chǎn)光活性醇，如L-去氧腎上腺素的新方法， 該方法可以比現(xiàn)有技術(shù)更加經(jīng)濟地進行。特別地，所述改進方法將不需要使用保護基團并且將會擁有高的立體選擇性。
出人意料地，上述問題可以通過提供根據(jù)所附專利權(quán)利要求生產(chǎn)式IV的取代的
光活性醇的方法來解決。
權(quán)利要求
1. 一種生產(chǎn)式IV的取代的光活性醇或者其鹽的方法，在各種情形下，該光活性醇或其鹽在立體異構(gòu)體方面為純的形式，或者為立體異構(gòu)體的混合物，
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中階段a)的反應在每摩爾式I的鏈烷酮中存在1至 10摩爾當量的醇的條件下發(fā)生。
3.如前述權(quán)利要求之一所述的方法，其中階段c)中的化學反應在開鏈或環(huán)狀的醚溶液中發(fā)生。
4.如前述權(quán)利要求之一所述的方法，其中階段b)是通過選自醇脫氫酶(ADH) (E.C. 1. 1. 1. 1)的酶來催化。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中醇脫氫酶是選自來自固氮弧菌屬的微生物的酶，特別是來自細菌 Aromatoleum aromaticum EbNl 的酶。
6.如前述權(quán)利要求之一所述的方法，其中階段b)的酶是選自具有多肽序列的酶，該多肽序列選自(i)SEQID NO :2，或(ii)相對于SEQID NO :2，至多25%的氨基酸殘基通過添加、缺失、插入、置換、倒位或其組合而改變和/或仍舊具有SEQ ID NO 2的酶促活性的至少50%的序列。
7.如前述權(quán)利要求之一所述的方法，其中階段b)的反應是通過添加還原當量，特別是NADH或NADPH而進行的，并且任選地所消耗的還原當量在反應期間再生。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中再生是酶促地、電化學地、或電酶促地進行。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中再生是酶促地發(fā)生的并且再生酶選自ADH以及與 ADH不同的脫氫酶，特別是葡萄糖脫氫酶、甲酸鹽脫氫酶、亞磷酸鹽脫氫酶。
10.如前述權(quán)利要求之一所述的方法，其中階段b)的反應在天然或重組地表達ADH的微生物存在下，或者在源自該微生物、含有ADH的部分存在下，或者在源自該微生物、含有 ADH的提取物存在下發(fā)生。
11.如前述權(quán)利要求之一所述的方法，其中階段b)的反應在生產(chǎn)ADH的微生物存在下， 或者在源自該微生物的含ADH的部分或提取物存在下發(fā)生，該微生物選自腸桿菌科、假單胞菌科、根瘤菌科、乳桿菌科、鏈霉菌科、Miodococcaceae、紅環(huán)菌科和諾卡氏菌科細菌。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中微生物是重組微生物，其轉(zhuǎn)化有編碼根據(jù)權(quán)利要求4-6之一定義的醇脫氫酶的核酸構(gòu)建體。
13.如前述權(quán)利要求之一所述的方法，其中階段b)在兩相液態(tài)反應介質(zhì)中進行。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中使用水相-有機反應介質(zhì)，并且式II的離析物和式III的產(chǎn)物在有機相中比在水相中更加可溶。
15.一種生產(chǎn)通式II的化合物的方法，
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中階段a)中的反應在每摩爾式I的酮中存在1至 10摩爾當量的醇的條件下發(fā)生。
17.—種生產(chǎn)式III的化合物的方法
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中酶促反應按照權(quán)利要求4-14之一進行。
19.如前述權(quán)利要求之一所述的方法，其中Cyc代表3-羥苯基殘基并且Hal代表氯原3子。
20.如根據(jù)權(quán)利要求4-7之一定義的權(quán)利要求之一所述的醇脫氫酶或生產(chǎn)該酶的微生物在生產(chǎn)式III或IV的化合物中的應用。
21.如權(quán)利要求20中所述應用，用于生產(chǎn)(3- [ (IR)-1-羥基-2-甲氨基-乙基]-酚)。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)取代的光活性醇的多階段方法，包括酶催化的合成步驟，特別是由醇脫氫酶所催化的合成步驟。本發(fā)明的方法尤其適合生產(chǎn)去氧腎上腺素，即3-[(1R)-1-羥基-2-甲氨基-乙基]-酚。
文檔編號C12P7/22GK102159719SQ200980136311
公開日2011年8月17日 申請日期2009年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月17日
發(fā)明者A·普萊特施, B·豪爾, M·布羅伊爾, W·塞格爾 申請人:巴斯夫歐洲公司