專利名稱：形成鑒別標(biāo)記物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種形成生物體內(nèi)分子標(biāo)記物，特別是鑒別標(biāo)記物的方法。該方法還涉及將一種選擇性標(biāo)記物引入生物體的種質(zhì)中，以及該標(biāo)記物在例如植物育種過程中的用途。
背景技術(shù)：
數(shù)十年來，DNA標(biāo)記物技術(shù)正顯著地提高著植物育種的效率，其是通過基于容易的試驗(yàn)標(biāo)記物的選擇而非通常困難的表型性狀的選擇而實(shí)現(xiàn)的。然而，這樣的鑒別標(biāo)記物的形成以及使用這些標(biāo)記物的效率往往是費(fèi)力并且費(fèi)時(shí)的過程。首先，鑒別標(biāo)記物的形成遵循由以下程序起始的過程1)繪制目標(biāo)性狀之下的基因的遺傳位置圖譜，2)識(shí)別側(cè)翼標(biāo)記物，3)通過緊密連接的標(biāo)記物的識(shí)別精細(xì)繪制基因圖譜，4)確定最相關(guān)標(biāo)記物的DNA標(biāo)記物序列，5)確定用于繪制目標(biāo)基因圖譜的親代系之間標(biāo)記物基因座上的序列變異，6)形成簡單的PCR分析，7)測(cè)定植物材料的遺傳背景(種質(zhì))中的預(yù)測(cè)值，其中測(cè)定鑒別標(biāo)記物。這里所用的種質(zhì)是用于描述遺傳資源或者更確切地講生物體的DNA，以及這些材料的收集物的術(shù)語。育種者使用術(shù)語種質(zhì)以表明它們的遺傳物質(zhì)收集物，從種質(zhì)中它們能夠產(chǎn)生變種。幸運(yùn)的是，近來的進(jìn)展已經(jīng)顯著加快了步驟l-4(Morgante和Salamini 2003 Curr. Opinion in Biotechnol 14 :214-219 ;Varshney 等，2005 TiPS 10:621-630)，特別是當(dāng)處理單基因性狀時(shí)。步驟5-6依賴于序列變種(SNP)周圍獨(dú)特DNA標(biāo)記序列片段 (stretch)的存在，所述序列變種用于開發(fā)鑒別分析。植物基因組被重復(fù)序列完全地分散， 所述重復(fù)序列嚴(yán)重妨礙了形成鑒別標(biāo)記物分析的可能性。尤其是對(duì)于具有較大基因組尺寸的農(nóng)作物，低拷貝DNA片段的識(shí)別就好比是大海撈針了。最后，步驟7非常依賴于1)農(nóng)作物的繁育方式，和幻農(nóng)作物基因組中的遺傳變異性水平。當(dāng)發(fā)生功能性變異時(shí)，該變異會(huì)位于其他預(yù)成DNA多態(tài)性的單倍體上。由于性狀會(huì)通過隨機(jī)雜交的后代傳遞，因此會(huì)發(fā)生很多重組事件，所述重組事件將使得原始單倍體成為小連鎖障礙。這將引起性狀基因從大部分其原始單倍體的特定等位基因上分離。這樣的結(jié)果是只有具有與性狀基因極端緊密連結(jié)的DNA多態(tài)性或甚至性狀基因多態(tài)性自身可用于轉(zhuǎn)化成有用的DNA標(biāo)記物。作為遠(yuǎn)系雜交種隨機(jī)雜交種群的一個(gè)例子，重組和重組事件的高交換率產(chǎn)生了含有性狀的區(qū)域，該區(qū)域是(理論上講)非常小的。因此，與基因完美相關(guān)的DNA標(biāo)記物是很難找到的。作為相反的一個(gè)例子，自交種種群中的連鎖障礙趨于相對(duì)較大，因?yàn)樽越辉黾恿思兒托?，從而限制了雜合體的數(shù)量，而雜合可以被重組所攪亂。然而，對(duì)于栽培種的遺傳基礎(chǔ)非常窄的農(nóng)作物來講，鑒別任何作為DNA標(biāo)記物形成的起始點(diǎn)的DNA多態(tài)性都是困難的，盡管存在有相對(duì)較大的連鎖障礙。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人旨在開發(fā)一種產(chǎn)生選擇性標(biāo)記物的方法，所述方法避免了上述問題。在本申請(qǐng)中，所述方法在目標(biāo)區(qū)域引入了獨(dú)特的、人造的和選擇性的標(biāo)記物，而不是鑒別和開發(fā)自然產(chǎn)生的序列變種。本方法的原理是，基于潛在標(biāo)記物基因座上的序列知識(shí)，可以設(shè)計(jì)獨(dú)特的標(biāo)記物，并且將它們引入含有目標(biāo)性狀的種系中。優(yōu)選的這些標(biāo)記物的適用性是，連續(xù)幾代之后新引入的標(biāo)記物與目標(biāo)性狀始終如一地共分離。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種以這種方式在目標(biāo)區(qū)域中引入標(biāo)記物的方法，該標(biāo)記物作為具有廣泛預(yù)測(cè)價(jià)值的標(biāo)記物是有用的。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一種基于鑒別和/或選擇DNA片段并且將該片段轉(zhuǎn)換成為選擇性分子標(biāo)記物，進(jìn)而克服以上困難的策略，所述DNA片段與目標(biāo)性狀密切相關(guān)(即具有預(yù)定義的與目標(biāo)特征共分離的一致性)，所述轉(zhuǎn)換使用定向突變、定向核苷酸交換(TNE)方法完成。 特別地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種用于確定需要作出何種改變并且設(shè)計(jì)所需標(biāo)記物的方法，以使任何遺傳變異性減少到最小，并且標(biāo)記物的品質(zhì)，即其相關(guān)性狀的預(yù)測(cè)值在種質(zhì)內(nèi)是最佳的，但是相比標(biāo)記物最初由其形成的種質(zhì)，其在不同的種質(zhì)中也是有用的。因此，本發(fā)明涉及一種用于在種質(zhì)中引入一種或多種(獨(dú)特的并且選擇性的)分子標(biāo)記物的方法，所述標(biāo)記物與目標(biāo)性狀緊密關(guān)聯(lián)，并且所述標(biāo)記物位于基因組中的一個(gè)位置，該位置雖然與所希望的性狀緊密相關(guān)，但是不含有足夠的標(biāo)記物信息。在該DNA片段中，使用TNE產(chǎn)生人造的并且獨(dú)特的多態(tài)性，其隨后可以用作選擇性的分子標(biāo)記物。本發(fā)明還涉及TNE用于在生物體中產(chǎn)生獨(dú)特并且選擇性標(biāo)記物的用途。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在生物體中形成鑒別標(biāo)記物的方法，包括步驟-選擇目標(biāo)性狀；-確定與該性狀相關(guān)的基因座；-確定基因座的遺傳圖位；-鑒別位于基因座遺傳距離內(nèi)的標(biāo)記物；-提供生物體種群，其中種群的各個(gè)成員含有該標(biāo)記物；-確定種群的各個(gè)成員的標(biāo)記物的核苷酸序列；-比對(duì)標(biāo)記物的核苷酸序列；-選擇標(biāo)記物序列中至少一個(gè)位置，其在種群的所有標(biāo)記物中含有相同的核苷酸；-設(shè)計(jì)可以與至少一個(gè)位置的兩側(cè)鄰近的標(biāo)記物序列雜交的寡核苷酸，并且其中該寡核苷酸在至少一個(gè)位置上還包含與標(biāo)記物中至少一個(gè)位置上的核苷酸不同的核苷酸 (標(biāo)記物核苷酸)；-使用寡核苷酸的定向核苷酸交換將標(biāo)記物核苷酸引入生物體的DNA中，從而將獨(dú)特的并且選擇性的SNP引入與性狀相關(guān)的標(biāo)記物中。因此，與目標(biāo)性狀有關(guān)的基因緊密連接的DNA片段(標(biāo)記物)的鑒別，其中所述片段在種質(zhì)中含有一實(shí)質(zhì)上恒定的核苷酸組成(是低多態(tài)性的)的部分，DNA片段中核苷酸水平(A、(、1~或6)的變異的確定(或種質(zhì)內(nèi)標(biāo)記物中恒定核苷酸組成的區(qū)域的確定)，片段中在該位置含有低水平，優(yōu)選地最低水平的變異的位置的選擇，選擇一個(gè)與存在于該位置上核苷酸(包括那里的任何變異)不同的核苷酸，即在該位置上具有最低存在，設(shè)計(jì)一個(gè)可以與所述位置兩側(cè)毗鄰的序列雜交的寡核苷酸，以及通過定向核苷酸交換在生物體DNA 中的所述位置上引入選擇的核苷酸(標(biāo)記物核苷酸)產(chǎn)生了獨(dú)特的(在種質(zhì)中)選擇標(biāo)記物。定向核苷酸交換(TNE)是一個(gè)定向誘變過程，其中突變是通過寡核苷酸序列中設(shè)計(jì)的錯(cuò)配堿基引入的。TNE在植物、動(dòng)物和酵母細(xì)胞中已經(jīng)有過描述。第一個(gè)TNE報(bào)告使用了一種包含自補(bǔ)寡核苷酸的所謂的嵌合體，所述自補(bǔ)寡核苷酸設(shè)計(jì)用于嵌入到染色體靶位上。嵌合體包含一錯(cuò)配的核苷酸，其形成了在染色體靶位引入突變的模板。為了選擇 TNE事件，大多數(shù)研究試圖在內(nèi)源性基因中引入單個(gè)核苷酸變化，所述內(nèi)源性基因可以導(dǎo)致除草劑抵性。使用嵌合體的最初的例子來自人細(xì)胞(參見綜述Rice等，Nat. Biotech. 19 321-326)。嵌合體的應(yīng)用也已經(jīng)在植物種類煙草、大米和玉米中獲得成功(Beetham等， 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :8774-8778 ；Kochevenko 等，2003 Plant Phys. 132 174-184 ;0kuzaki 等，2004 Plant Cell Rep. 22 :509-512) 同時(shí)，單鏈(SS)寡核苷酸的 TNE的活性已經(jīng)得到測(cè)試。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在小麥、酵母和人細(xì)胞中給出更多的重現(xiàn)性結(jié)果 (Liu等，2002 Nuc. Acids Res.迎2742-2750 ；綜述，Parekh-Olmedo 等，2005 Gene Therapy 12 :639-646 ；Dong等，2006 Plant Cell Rep. 25 :457-65)。定向誘變(TNE)還在許多專利申請(qǐng)中有描述，例如 W02005108622、W02005049795、W02004033708、W003075856、W003027765、 W00210364、W00192512、W00187914、W00173002、W00114531、W09515972。迄今為止，已經(jīng)有將TNE用于通過敲入或敲除基因而改變基因表達(dá)的目的的描述。本領(lǐng)域還沒有提供將TNE 用于將獨(dú)特的選擇性標(biāo)記物引入種質(zhì)的可行方法。在本方法的第一步驟中，選擇目標(biāo)性狀。性狀可以是單基因或多基因性狀，或者由基因復(fù)合物控制的性狀，抗病性相關(guān)的性狀或產(chǎn)量相關(guān)的性狀等等。在第二個(gè)步驟中，選擇與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的基因座或遺傳區(qū)域。當(dāng)然，當(dāng)性狀是多基因的時(shí)，可以選擇基因座之一。然后，確定遺傳圖上基因或遺傳區(qū)域的位置。遺傳圖位置的確定包括發(fā)生法(generic method)，其稱為連鎖分析或遺傳作圖(參見，例如Griffiths AJF等， 2005 Introduction to Genetic Analysis, 8th ed. W. H. Freeman and Cie, New York PP. 115-137)。遺傳作圖的一個(gè)必要前提是兩親代系的遺傳作圖群，所述親代系在目標(biāo)性狀上有區(qū)別，并且根據(jù)親代系可以獲得一個(gè)種群，其中目標(biāo)性狀在子代中分離。另外可選地， 在單基因性狀情況中，通過使用群體分離分析法BSA，在性狀區(qū)間可以非常有效地進(jìn)行放大 (Michelmore等，1991 PNAS 88:9828-9832)。通過使用BSA，不需要構(gòu)建遺傳圖。潛在標(biāo)記物序列在目標(biāo)種質(zhì)(含有可以用于育種的遺傳變異性的生物體種群)內(nèi)得到鑒別，其位于(預(yù)定的)基因的遺傳距離內(nèi)，即位于性狀的臨近區(qū)域內(nèi)。一般地，其位于基因的IcM內(nèi)，但是這在農(nóng)作物之間可以是不同的。這樣的標(biāo)記物還可以稱為側(cè)翼標(biāo)記物。目標(biāo)性狀的臨近區(qū)域內(nèi)的分子標(biāo)記物的遺傳作圖和鑒別優(yōu)先地通過多重標(biāo)記物技術(shù) (multiplex marker technologies)完成。多重標(biāo)記物技術(shù)可以在單個(gè)分析內(nèi)鑒別多個(gè)標(biāo)記物。關(guān)于分子標(biāo)記物技術(shù)存在多個(gè)綜述(a. ο. Rafalski Α. 2002 Curr Opin. Plant Biol. 5 94-100, Peters J.等，2003 TiPS 8 484-491, Varshney R.等，2005 TiPS 10 621-630)。
一個(gè)需要闡明的附加特征是基礎(chǔ)標(biāo)記物序列(underlying marker sequences)的拷貝數(shù)。大部分植物基因組富含重復(fù)序列(Kumar和Bennetzen JL 1999 Ann Rev Genet 33 :479-532)，并且用于常規(guī)目的的原始的鑒定的標(biāo)記物到易于分析的標(biāo)記物的成功轉(zhuǎn)變依賴于低拷貝DNA序列?？朔貜?fù)DNA帶來的問題的一些方法已經(jīng)得到發(fā)展?？截悢?shù)的確定可以通過例如Southern印跡的雜交技術(shù)完成。其他的方法聚焦于例如利用cDNA序列、慢退火高Cot DNA的分離(Yuan等，2003 Plant J 34:249-255)以及甲基化過濾(Rabinowicz PD 2003 Meth. Mol Biol 236 21-36)的基因富集策略。以本發(fā)明所述的方式引入獨(dú)特標(biāo)記物也以新穎并且創(chuàng)造性的方式解決了基因組中標(biāo)記物序列的多個(gè)拷貝之間的區(qū)分問題，并且提供了在基因組中產(chǎn)生單個(gè)拷貝標(biāo)記物的方法。合適的分子標(biāo)記物技術(shù)是例如AFLP、RAPDs、SSRs、SFPs和SNPs。通過單獨(dú)或者聯(lián)合使用這些技術(shù)，可以鑒別一大組在目標(biāo)基因側(cè)翼的標(biāo)記物。側(cè)翼標(biāo)記物組用于選擇過程，從而確定位于性狀附近區(qū)域或者至少在距基因所希望的距離(一般以cM表示)內(nèi)的標(biāo)記物。另外可選地，可以使用已知的例如來自文獻(xiàn)的標(biāo)記物。生物體種群通常以繁殖物種種質(zhì)的形式提供，或者以其他合適的包含多個(gè)可能含有或者可能不含有標(biāo)記物的成員的種群的形式給出。該種群可以就標(biāo)記物的存在進(jìn)行預(yù)篩。標(biāo)記物從含有標(biāo)記物的種群的成員分離(例如切下電泳凝膠)并且測(cè)序，即確定它們的核苷酸序列。所選標(biāo)記物組的DNA序列的確定通過例如Sanger雙脫氧測(cè)序法完成， 但其他方法也是可以的。因此，在選擇標(biāo)記物后，還要在相同生物體的其他成員內(nèi)鑒別標(biāo)記物，并且從相同生物體的其他成員中分離標(biāo)記物，從而獲得多種標(biāo)記物。從這些標(biāo)記物的部分的每一各或者至少從這些標(biāo)記物的部分確定序列。將序列比對(duì)，并且確定這些標(biāo)記物的DNA組成的任何變異。這意味著，在標(biāo)記物序列的任何位置上，各個(gè)A、C、T或G的存在都是可知的。標(biāo)記物被測(cè)序的種群成員的數(shù)量至少為2，優(yōu)選地至少為5，更優(yōu)選地至少為10。在某些具體實(shí)施方式
中，該數(shù)量可以是25或50，這取決于種群的大小和種質(zhì)中多態(tài)性發(fā)生的程度。序列的比對(duì)可以手動(dòng)或者通過廣泛可得的軟件工具完成。序列的比對(duì)提供了不同種群成員的標(biāo)記物序列之間差異的信息，即其可以鑒別自身標(biāo)記物序列中的多態(tài)性或多態(tài)性缺乏。通過這樣的操作，可以得到標(biāo)記物序列中與其他標(biāo)記物中的區(qū)域相比含有較少 (或者根本沒有)變異的區(qū)域的信息。在這樣的區(qū)域中，可以選擇一個(gè)或多個(gè)核苷酸，其與該區(qū)域中的其他核苷酸相比是(相對(duì))穩(wěn)定的(較少可變的)。甚至可能的是，在標(biāo)記物序列中存在這樣一個(gè)區(qū)域，其在研究的標(biāo)記物當(dāng)中組成恒定。為了解釋這一點(diǎn)，給出以下圖表
權(quán)利要求
1.在生物體中形成鑒別標(biāo)記物的方法，包括步驟 -選擇目標(biāo)性狀；-確定與該性狀相關(guān)的基因座；-確定基因座的遺傳圖位；-鑒別位于基因座遺傳距離內(nèi)的標(biāo)記物；-提供生物體種群，其中種群的每個(gè)成員均含有該標(biāo)記物；-確定種群每個(gè)成員的標(biāo)記物的核苷酸序列；-比對(duì)標(biāo)記物的核苷酸序列；-選擇標(biāo)記物序列中的至少一個(gè)位置，其在種群的所有標(biāo)記物中含有相同的核苷酸； -設(shè)計(jì)可以與至少一個(gè)位置的兩側(cè)鄰近的標(biāo)記物序列雜交的寡核苷酸，并且其中該寡核苷酸在該至少一個(gè)位置上還包含一個(gè)與標(biāo)記物中至少一個(gè)位置上的核苷酸不同的核苷酸(標(biāo)記物核苷酸)；-使用寡核苷酸的定向核苷酸交換將標(biāo)記物核苷酸引入生物體的DNA中，從而將獨(dú)特的且選擇性的SNP引入與性狀相關(guān)的標(biāo)記物中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中使用分子標(biāo)記物技術(shù)鑒別標(biāo)記物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中標(biāo)記物位于距性狀最多IcM的距離，優(yōu)選地最多 0. IcM的距離。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的方法，其中形成了兩種或多種標(biāo)記物，所述標(biāo)記物獨(dú)立地位于距性狀最多2cM的距離，優(yōu)選地最多0. 2cM的距離。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的方法，其中生物體是植物、動(dòng)物或微生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的方法，其中生物體是低多態(tài)性生物體，例如棉花(Gossipyum hirsutum)、大豆(Glycine max)、栽培番 (Solanum esculentum)、西瓜(Citrullus lanatus)禾口Jt/R (Cucumis sativa)。
7.根據(jù)權(quán)利要1-5的方法，其中分子標(biāo)記物技術(shù)選自多重標(biāo)記物技術(shù)，優(yōu)選地選自 AFLP、RAPD、SSR、SFP 禾口 / 或 SNPs0
8.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中至少兩種分子標(biāo)記物利用選自AFLP、RAPD、SSR、SFP和 /或SNPs的多重標(biāo)記物技術(shù)獨(dú)立地獲得。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8的方法，其中生物體的DNA來自適于育種的供體種系。
10.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其用于將獨(dú)特的且選擇性的標(biāo)記物引入多拷貝的 DNA片段。
11.在現(xiàn)存育種材料中產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)人工標(biāo)記物的方法的用途。
12.將一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物引入遺傳修飾的材料的方法的用途。
13.用于在育種原料中產(chǎn)生獨(dú)特分子標(biāo)記物的TNE的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在現(xiàn)有育種材料中產(chǎn)生獨(dú)特分子標(biāo)記物的方法，包括選擇性狀相關(guān)的標(biāo)記物，鑒別種質(zhì)內(nèi)一組標(biāo)記物中存在的核苷酸水平的變異，和通過定向核苷酸交換在標(biāo)記物恒定區(qū)域中的位置引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸從而引入選擇性標(biāo)記物。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102159711SQ200980135585
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2009年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月11日
發(fā)明者A·P·索倫森, J·N·A·M·魯普范德伍爾特 申請(qǐng)人:凱津公司