專利名稱：生產(chǎn)乳酸的細菌及生產(chǎn)乳酸的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)乳酸的細菌及生產(chǎn)乳酸的方法。
背景技術(shù)：
乳酸有L-乳酸和D-乳酸，L-乳酸為工業(yè)生產(chǎn)的聚乳酸的原料，另一方面，D-乳酸作為聚合物原料或農(nóng)藥、藥物的中間體近年來也備受關(guān)注。但事實上在上述任一用途中都要求作為原料的乳酸具有高光學純度。 自然界中存在有效生產(chǎn)乳酸的微生物，在一些情況下進行使用它們的乳酸制造法，但也產(chǎn)生副產(chǎn)物例如乙酸、乙醇、乙偶姻、丙酮酸等化合物，有時導致作為最終產(chǎn)物的乳酸的品質(zhì)下降。另外由于光學異構(gòu)體的混入導致光學純度下降，也成為嚴重的問題。為了避免如上所述的乳酸純度下降，已經(jīng)開發(fā)了下述方法，即利用近年來發(fā)展起來的基因重組技術(shù)破壞微生物的特定基因，特異性地阻礙目標副產(chǎn)物的生產(chǎn)。特別是正在嘗試利用大腸桿菌、酵母等進行光學純度高的乳酸生產(chǎn)技術(shù)的開發(fā)，所述大腸桿菌、酵母等與乳酸菌或絲狀菌等本身能高產(chǎn)率生產(chǎn)乳酸的微生物相比，基因組信息豐富，作為基因重組宿主的實際成果充分。例如，根據(jù)BiotechnolLett. 2006 Oct ；28 (19) :1527_1535 (Grabar 等的文獻)通過下述方法成功生產(chǎn)了光學純度高的L-乳酸對作為由大腸桿菌的丙酮酸到D-乳酸的代謝途徑的基因的D-乳酸脫氫酶基因(IdhA)、及作為由丙酮醛到D-乳酸的代謝途徑的基因的msgA基因進行破壞，在由含有ImM甜菜堿的礦物構(gòu)成的合成培養(yǎng)基中對來自乳酸片球菌的生產(chǎn)L-乳酸脫氫酶的大腸桿菌進行培養(yǎng)。該文獻顯示，不破壞msgA基因的大腸桿菌在甜菜堿存在下，即使破壞D-乳酸脫氫酶基因(IdhA)，由于可生產(chǎn)來自大腸桿菌生物合成的丙酮醛的D-乳酸，所以即使原料中未混入D-乳酸也只能得到96% e. e.左右的光學純度。另外，雖然該文獻中的大腸桿菌中存在用于分解D-乳酸的FAD依賴性D-乳酸脫氫酶基因(did)，但只要不破壞msgA基因，則在甜菜堿存在下光學純度也變?yōu)?5 96%左右。即，只以大腸桿菌內(nèi)在的did基因的表達尚不能充分分解大腸桿菌合成的少量的D-乳酸，更不能得到高光學純度。另外，使用不存在甜菜堿的培養(yǎng)基，雖然只要原料中不含有 D-乳酸就能生產(chǎn)99%以上的高光學純度的乳酸，但所期望的乳酸的生產(chǎn)速度降低到一半左右ο如上所述，如果不進行msgA基因的破壞和甜菜堿的添加，則難以同時實現(xiàn)L-乳酸的高生產(chǎn)率和高光學純度。另外，該文獻記載了抑制大腸桿菌生產(chǎn)的D-乳酸的生產(chǎn)，使用不含D-乳酸的培養(yǎng)基來生產(chǎn)高光學純度的L-乳酸，沒有記載培養(yǎng)基成分中含有D-乳酸時提高光學純度的方法。日本特開2004-187643號公報中公開了為了得到高光學純度而使乳酸消旋酶的活性降低的方法。該方法在乳酸產(chǎn)生菌自身制造DL-乳酸時是有效的，但培養(yǎng)基中含有DL-乳酸時沒有效果。另外，Biotech.Bioeng.，Vol. 73 (1)，pp80_82 (2001)中公開了使用 L-乳酸脫氫酶將DL-乳酸混合液制成D-乳酸溶液的方法，但報告中的實驗是ImL的小規(guī)模，乳酸的濃度較低為IOmM左右，通常認為在IOOOmM以上的使用乳酸產(chǎn)生菌的工業(yè)生產(chǎn)中是無效的。 另一方面，根據(jù)W02005/033324號說明書，使用破壞了 did基因的大腸桿菌由含有玉米漿的培養(yǎng)基成功生產(chǎn)了高光學純度的D-乳酸。玉米漿中含有DL-乳酸，破壞了 did基因的大腸桿菌在微好氧條件下抑制D-乳酸的分解，一邊分解L-乳酸一邊生產(chǎn)D-乳酸，由此成功生產(chǎn)了高光學純度的D-乳酸。該文獻顯示，通氣對糖的代謝速度、光學異構(gòu)體的分解速度、雜質(zhì)的生產(chǎn)速度造成影響，如果過量通氣，由于糖的代謝速度下降，所以乳酸的生產(chǎn)速度下降。因此，以生產(chǎn)乳酸為目的時，通氣量有上限，需要求出最適的通氣量。即，可用于供給作為好氧的代謝反應的L-乳酸的分解的氧氣量為至使D-乳酸的生產(chǎn)速度不下降的量。另外，在工業(yè)上希望乳酸的生產(chǎn)速度高，也希望造成光學純度下降的光學異構(gòu)體盡量快速分解。將L-乳酸或D-乳酸分解為丙酮酸的酶利用FMN (黃素單核苷酸)或FAD (黃素腺嘌呤二核苷酸)等輔酶、或者直接利用氧將乳酸轉(zhuǎn)換為丙酮酸。利用輔酶的酶的呼吸即利用氧氣對該輔酶的再生是有效的，結(jié)果各酶的酶活性受到可供給的氧量的限制。但是，如果增加氧供給量，可以使光學純度下降的乳酸快速分解，然而糖的代謝速度也下降，所以所期望的乳酸的生產(chǎn)速度大幅下降。因此，在不受氧量限制的前提下提高來自細胞外的原料的乳酸的分解速度、以更短的時間提高所期望的乳酸的光學純度是極其困難的。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供一種以更短的時間生產(chǎn)高光學純度的乳酸的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌及生產(chǎn)乳酸的方法。本發(fā)明如下所示。[1] 一種生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，所述大腸桿菌的1種以上的NAD依賴性乳酸脫氫酶及1種以上的非NAD依賴性乳酸氧化還原酶的各酶活性均被增強，從而分解D-乳酸及L-乳酸中的任一方而生產(chǎn)另一方。[2]如[1]所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述NAD依賴性乳酸脫氫酶的活性增強使丙酮酸生成D-乳酸和L-乳酸中的任一方，并且，上述非NAD依賴性乳酸氧化還原酶的活性增強使上述D-乳酸及L-乳酸中的任意另一方作為基質(zhì)進行分解。[3]如[1]或[2]所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述NAD依賴性乳酸脫氫酶的活性增強，是LdhA的活性增強，能夠生產(chǎn)上述D-乳酸。[4]如[3]所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述非NAD依賴性乳酸氧化還原酶的活性增強是LldD的活性增強、L-乳酸氧化酶的活性增強、LldR的失活或活性降低、或它們的一種以上的組合，能夠生產(chǎn)上述D-乳酸。[5]如[4]所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述L-乳酸氧化酶為Lox及LctO 中的至少一方。[6]如[4]或[5]所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述非DNA依賴性乳酸氧化還原酶的活性增強是通過在編碼LldD的基因的ORF中的33位上具有沉默突變的突變體 IldD基因產(chǎn)生的。[7]如[6]所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述突變體LldD是以序列號41的堿基序列表示的。[8]如[3] [7]中任一項所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，選自由Dld活性及 Pfl活性組成的組中的至少一種活性失活或活性降低。[9]如[1]或[2]所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述NAD依賴性乳酸脫氫酶的活性增強是NAD依賴性L-乳酸脫氫酶的活性增強，能夠生產(chǎn)上述L-乳酸。[10]如[9]所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述非NAD依賴性乳酸氧化還原酶的活性增強是Dld的活性增強，能夠生產(chǎn)上述L-乳酸。[11]如[9]或[10]所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中上述L-乳酸脫氫酶來自雙歧桿菌屬菌。[12]如[10]或[11]所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述Dld具有Lact deh memb結(jié)構(gòu)域。[13]如[10] [12]中任一項所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述Dld來自選自由大腸桿菌、發(fā)酵單胞菌及棒狀菌組成的組中的至少一種。[14]如[9] [13]中任一項所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，LdhA活性、LldD活性、 Pfl活性中的至少一種以上失活或活性降低。 [15]如[1] [14]中任一項所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，選自由Mdh及 AspA活性組成的組中的至少一種活性失活或活性降低。[16]如[1] [15]中任一項所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，選自由蔗糖非 PTS基因組及FruK組成的組中的至少一種被增強。[17]如[1] [16]中任一項所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，F(xiàn)ruR活性失活或降低。[18] 一種生產(chǎn)乳酸的方法，使用[1] [17]中任一項所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌
生產(chǎn)乳酸。[19] 一種生產(chǎn)D-乳酸的方法，使用[3] [8]中任一項所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌生產(chǎn)D-乳酸。[20] 一種生產(chǎn)L-乳酸的方法，使用[9] [14]中任一項所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌生產(chǎn)L-乳酸。
具體實施例方式本發(fā)明的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌是1種以上的NAD依賴性乳酸脫氫酶及1種以上的非NAD依賴性乳酸氧化還原酶的各酶活性均被增強的大腸桿菌，以分解D-乳酸及L-乳酸中的任一方而生產(chǎn)另一方。本發(fā)明的大腸桿菌的乳酸代謝系統(tǒng)中的1種以上的NAD依賴性乳酸脫氫酶及1種以上的非NAD依賴性乳酸氧化還原酶的各酶活性均被增強，能夠分解D-乳酸及L-乳酸中的任一方以生產(chǎn)D-乳酸及L-乳酸中的另一方，所以能夠使D-乳酸及L-乳酸中的任一方的生產(chǎn)和僅使光學純度下降的光學異構(gòu)體的快速分解同時進行。
因此能夠提供一種以更短的時間生產(chǎn)高光 學純度的乳酸的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌及生產(chǎn)乳酸的方法。本發(fā)明中所謂酶活性的“增強”，是指除了將編碼酶的基因從宿主細菌的菌體外導入菌體內(nèi)之外，還包括通過增強宿主細菌基因組上具有的酶基因的啟動子活性或取代為其他的啟動子而使酶基因強表達，或者通過使該酶基因的阻抑蛋白活性降低或失活而使該酶活性增強。本發(fā)明中所謂的酶活性的“降低”，是指通過編碼該酶的基因的基因重組，與處理前的狀態(tài)相比，該酶活性明顯下降的狀態(tài)。本發(fā)明中所謂的酶活性的“失活”，是指無論利用現(xiàn)有的任何測定系統(tǒng)，測定對象的該酶的活性在檢測限以下的狀態(tài)。需要說明的是，本發(fā)明中所謂的“宿主”，是指接受從菌體外導入的一個以上的基因，結(jié)果成為本發(fā)明的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌的該大腸桿菌。本說明書中所示的數(shù)值范圍，表示包括分別以所記載的數(shù)值為最小值及最大值的范圍。以下詳細說明本發(fā)明。為了生成D-乳酸及L-乳酸的任一方，可以在本發(fā)明的生產(chǎn)乳酸大腸桿菌中將1 種以上的NAD依賴性乳酸脫氫酶及1種以上的非NAD依賴性乳酸氧化還原酶的各酶活性均增強，從而分解D-乳酸及L-乳酸中的任意另一方而生成D-乳酸及L-乳酸的任一方乳酸。 具體而言，優(yōu)選上述NAD依賴性乳酸脫氫酶的活性增強使丙酮酸生成D-乳酸及L-乳酸中的任一方，并且，優(yōu)選上述非NAD依賴性乳酸氧化還原酶以上述D-乳酸及L-乳酸中的任意另一方作為基質(zhì)進行分解。結(jié)果由于確實由丙酮酸生成D-乳酸或L-乳酸，并促進了另一方的分解，所以能夠更具體高效地得到高光學純度的乳酸。上述所謂的NAD依賴性乳酸脫氫酶，是指以基于國際生物化學聯(lián)合(I. U. B.)酶委員會報告被歸屬于酶編號ι. ι. 1. 27或酶編號1. 1. 1. 28的NAD為輔酶的乳酸脫氫酶。乳酸代謝系統(tǒng)中，該酶以NAD作為輔酶進行L-乳酸或D-乳酸與丙酮酸之間的氧化還原反應。雖然具有根據(jù)基質(zhì)量及NAD的量等進行氧化還原反應的功能，但是從生產(chǎn)高光學純度的乳酸的觀點考慮，優(yōu)選為由丙酮酸生成D-乳酸或L-乳酸的NAD依賴性乳酸脫氫酶的活性增強。作為能將NAD依賴性乳酸脫氫酶活性導入宿主細菌的基因，可以利用由具有該酶的生物得到的具有編碼NAD依賴性乳酸脫氫酶的基因的堿基序列的DNA，或者利用基于其公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例子，可以舉出來自埃希氏菌屬菌 (Escherichia)、假單胞菌屬菌(Pseudomonas)、氣桿菌屬菌(Aerobacter)、梭狀芽孢桿菌屬菌(Clostridium)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)的基因，特別是來自埃希氏菌屬菌 (Escherichia)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌 MG1655株的基因的堿基序列的DNA、具有來自長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)的基因的堿基序列的DNA。另外本發(fā)明中所謂的非NAD依賴性乳酸氧化還原酶，是指不以NAD為輔酶的乳酸脫氫酶、或者直接利用氧來氧化乳酸的乳酸氧化酶。在乳酸代謝系統(tǒng)中，上述酶是以FAD或 FMN等為輔酶或者直接利用氧進行L-乳酸或D-乳酸與丙酮酸之間的氧化還原反應的酶。是具有根據(jù)基質(zhì)量及輔酶量等進行氧化還原反應的功能的酶，本發(fā)明中，優(yōu)選為對能以D-乳酸及L-乳酸的任一方為基質(zhì)分解至丙酮酸的功能進行增強的酶。 作為能將非NAD依賴性乳酸氧化還原酶活性導入宿主細菌的基因，可以利用由具有該酶的生物得到的具有編碼非NAD依賴性乳酸氧化還原酶的基因的堿基序列的DNA、或者利用基于其公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例子，可以舉出來自埃希氏菌屬菌(Escherichia)、假單胞菌屬菌(Pseudomonas) >^t1 IflifMlif (Aerobacter)、梭狀芽孢桿菌屬菌(Clostridium)、腸道球菌屬菌(Enterococcus)、鏈球菌屬菌(Streptococcus)、 片球菌屬菌(Pediococcus)、乳球菌屬菌(Lactococcus)、氣球菌(Aerococcus)屬菌、棒狀菌屬菌(Corynebacterium)、發(fā)酵單胞菌屬菌(Zymomonas)的基因，特別是來自埃希氏菌屬菌(Escherichia)、腸道球菌屬菌(Enterococcus)、棒狀菌屬菌(Corynebacterium)、發(fā)酵單胞菌屬菌(Zymomonas)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌MG1655株、腸道球菌屬 ATCC9625株、谷氨酸棒桿菌NBRC12168株、運動發(fā)酵單胞菌ATCC31821株的基因的堿基序列的 DNA。如上所述，由于通過組合非NAD依賴性乳酸氧化還原酶及NAD依賴性乳酸脫氫酶， 并且分別進行活性增強，可以生成一方的光學異構(gòu)體，并進行使光學純度下降的另一方的光學異構(gòu)體的分解，因此可以以高光學純度且迅速地生產(chǎn)乳酸。本發(fā)明的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，可以是對有助于增強上述各酶活性的任一基因進行增強的大腸桿菌，但從D-乳酸或L-乳酸各自的光學純度及生產(chǎn)效率的觀點考慮，優(yōu)選使用后述的各基因增強了的大腸桿菌。以下，分別對生產(chǎn)D-乳酸的D-乳酸產(chǎn)生菌和生產(chǎn)L-乳酸的L-乳酸產(chǎn)生菌進行說明。<D-乳酸產(chǎn)生菌>本發(fā)明中的D-乳酸產(chǎn)生菌中，作為NAD依賴性乳酸脫氫酶活性的增強，優(yōu)選LdhA 的活性被增強。本發(fā)明中所謂的用作NAD依賴性乳酸脫氫酶的、活性被增強的D-乳酸脫氫酶 (LdhA)，是指由丙酮酸和NADH生成D-乳酸和NAD的酶。需要說明的是，通常已知既有生產(chǎn) L-乳酸的LdhA也有生產(chǎn)D-乳酸的LdhA，本發(fā)明中為了避免混亂只將生產(chǎn)D-乳酸的LdhA 記為LdhA。作為IdhA基因，可以為具有由持有該酶活性的生物得到的基因的堿基序列的DNA 或基于該基因公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選的IdhA基因的例子，可以舉出來自上述關(guān)于NAD依賴性乳酸脫氫酶所述的菌的基因，具體而言，可以舉出由Bunch等(Microbiologyl，43 (Pt 1)， PP- 187-195(1997))得到的基因，或具有以大腸桿菌的基因組DNA為模板、利用下述序列號 19及序列號20進行PCR擴增的DNA片段所包含的序列的基因。作為增強本發(fā)明中的LdhA活性的方法之一，下述方法是有效的，即，將編碼LdhA 的基因和控制與糖酵解系統(tǒng)、核酸生物合成系統(tǒng)或氨基酸生物合成系統(tǒng)相關(guān)的蛋白質(zhì)表達的基因的啟動子連接，在該狀態(tài)下組裝到表達質(zhì)粒中，再將表達質(zhì)粒導入到所希望的細菌中。此種情況下的控制與糖酵解系統(tǒng)、核酸生物合成系統(tǒng)或氨基酸生物合成系統(tǒng)相關(guān)的蛋白質(zhì)表達的基因的啟動子是指通常在細菌內(nèi)、優(yōu)選在大腸桿菌內(nèi)發(fā)揮作用的強啟動子，且即使在葡萄糖存在下，其表達也不易受抑制的啟動子，具體而言，可以列舉甘油醛-3-磷酸脫氫酶的啟動子或絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶啟動子。如上所述得到的大腸桿菌在通氣條件下產(chǎn)生D-乳酸時，與IdhA的表達未被增強時相比，能提高D-乳酸的蓄積量，提高D-乳酸的光學純度。 另外發(fā)明中的D-乳酸產(chǎn)生菌中，非NAD依賴性乳酸氧化還原酶的活性增強，優(yōu)選為LldD的活性增強、L-乳酸氧化酶的活性增強、LldR的失活或活性降低、或它們的1種以上的組合。 由此，可以高效地將L-乳酸分解為丙酮酸，在生產(chǎn)D-乳酸時可以迅速地提高光學純度。作為本發(fā)明中所謂的作為非NAD依賴性乳酸氧化還原酶、活性被增強的非NAD依賴性L-乳酸脫氫酶(LldD)，是指基于國際生物化學聯(lián)合(I. U. B.)酶委員會報告被歸屬于酶編號1. 1.2. 3、由L-乳酸和FMN生成丙酮酸和FMNH的酶。作為上述IldD基因，可以為具有由持有該酶活性的生物得到的基因的堿基序列的DNA或基于該公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例子，可以舉出來自埃希氏菌屬菌(Escherichia)、假單胞菌屬菌 (Pseudomonas)、志賀屬菌(Shigella)、檸檬酸桿菌屬菌(Citrobacter)、沙門氏菌屬菌 (Salmonella)的基因，特別是來自埃希氏菌屬菌(Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌MG1655株的基因的堿基序列的DNA。另外，從使L-乳酸更迅速的分解的觀點考慮，LldD優(yōu)選為由編碼IldD基因的ORF 的序列的第33位發(fā)生沉默突變的突變體IldD基因表達的LldD，更優(yōu)選為第33位的堿基由 C變?yōu)門的突變體IldD (C33T突變體IldD)(序列號41)。使用公知的基因重組技術(shù)將C33T 突變體IldD基因?qū)氪竽c桿菌，由此可以容易地得到高活性大腸桿菌菌株。通過使用該高活性株，能夠更快速地分解L-乳酸，能夠提高D-乳酸的光學純度。另外，所謂用作非NAD依賴性乳酸脫氫酶的、活性被增強的L-乳酸氧化酶，是指基于國際生物化學聯(lián)合(I. U. B.)酶委員會報告被歸屬于酶編號1. 13. 12.—，在L-乳酸和氧存在下，生成丙酮酸和過氧化氫的酶。作為上述基因lox、IctO，可以為具有由持有該酶活性的生物得到的基因的堿基序列的DNA或基于該公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例子，可以舉出來自腸道球菌屬菌(Enterococcus)、鏈球菌屬菌 (Streptococcus)、片球菌屬菌(Pediococcus)、乳球菌屬菌(Lactococcus)、氣球菌屬菌 (Aerococcus)的基因，其中，特別優(yōu)選從腸道球菌屬.ATCC9625及乳酸乳球菌ATCC 19435 中分離得到。作為增強本發(fā)明中的LldD、L-乳酸氧化酶活性的方法之一，下述方法是有效的， 艮口，將編碼LldD或上述L-乳酸氧化酶的基因和控制與糖酵解系統(tǒng)、核酸生物合成系統(tǒng)或氨基酸生物合成系統(tǒng)相關(guān)的蛋白質(zhì)表達的基因的啟動子連接，在該狀態(tài)下組裝到表達質(zhì)粒中，再將質(zhì)粒導入所希望的大腸桿菌。此種情況下的控制與糖酵解系統(tǒng)、核酸生物合成系統(tǒng)或氨基酸生物合成系統(tǒng)相關(guān)的蛋白質(zhì)表達的基因的啟動子是指通常在細菌內(nèi)、優(yōu)選在大腸桿菌內(nèi)發(fā)揮作用的強啟動子，且即使在葡萄糖存在下，其表達也不易受抑制的啟動子，具體而言，可以列舉甘油醛-3磷酸脫氫酶的啟動子或絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶啟動子。如上所述得到的大腸桿菌在通氣條件下產(chǎn)生D-乳酸時，與LldD或L-乳酸氧化酶的表達未被增強時相比，能提高D-乳酸的蓄積量，提高D-乳酸的光學純度。
另外，LldD及L-乳酸氧化酶可以分別直接使用公知的序列，另外根據(jù)情況也可以分別為不破壞酶活性的突變體。作為上述突變體，可以舉出氨基酸的添加、缺失、轉(zhuǎn)化等。上述不破壞活性的突變體可以使用本領域中公知的方法獲得。 另外，為了增強非NAD依賴性乳酸脫氫酶的活性而被失活或活性降低的LldR是抑制上述L-乳酸脫氫酶(LldD)轉(zhuǎn)錄的控制因子。通過使LldR的活性降低或失活，可以阻止 LldD活性的抑制，或有效地增強LldD活性。進而，本發(fā)明的D-乳酸產(chǎn)生菌中，優(yōu)選選自由Dld活性及Pfl活性組成的組中的至少一種失活或活性降低。本發(fā)明中所謂的Dld(FAD依賴性D-乳酸脫氫酶)，是指在作為輔酶的氧化型黃素腺嘌呤二核苷酸的存在下，催化由D-乳酸生成丙酮酸的反應的酶的總稱。通過使上述Dld 的活性失活或降低，可以抑制作為產(chǎn)物的D-乳酸的分解。另外本發(fā)明中所謂的Pfl (丙酮酸甲酸裂解酶)，是基于國際生物化學聯(lián)合 (I. U. B.)酶委員會報告被歸屬于酶編號2. 3. 1. 54、也被稱作甲酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶(formate acetyl transferase)的酶。該酶是可逆地催化由丙酮酸生成甲酸的反應的酶的總稱。通過使上述Pfl的活性失活或降低，可以抑制作為D-乳酸生成原料的丙酮酸的分解。作為本發(fā)明中LdhA活性被增強并且Dld活性或Pfl活性或它們雙方失活或活性降低的微生物，可以舉出W02005/033324號所述的大腸桿菌MT-10994 (FERMBP-10058)株。另外，本發(fā)明的D-乳酸產(chǎn)生菌，除上述之外，從抑制副產(chǎn)物的生產(chǎn)量的觀點考慮， 優(yōu)選選自Mdh及AspA活性中的至少一種失活或活性降低。所謂Mdh (蘋果酸脫氫酶)，是指基于國際生物化學聯(lián)合(I. U. B.)酶委員會報告被歸屬于酶編號1. 1. 1. 37、在作為輔酶的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的存在下可逆地催化由蘋果酸生成草酰乙酸的反應的酶的總稱。因此，通過使Mdh的活性失活或降低，可以抑制副產(chǎn)物丁二酸的生成。另外AspA(天冬氨酸氨裂合酶)是基于國際生物化學聯(lián)合(I. U. B.)酶委員會報告被歸屬于酶編號4. 3. 1. 1.、也被稱作天冬氨酸酶的酶。該酶是可逆地催化由L-天冬氨酸生成富馬酸的反應的酶的總稱。因此，通過使AspA的活性失活或減低，可以抑制副產(chǎn)物富馬酸的生成。本發(fā)明的D-乳酸產(chǎn)生菌，可以以葡萄糖等糖為原料生產(chǎn)D-乳酸，但為了能以其他糖為原料生產(chǎn)D-乳酸，可以增強選自由蔗糖非PTS基因組及FruK組成的組中的至少一種，較優(yōu)選增強蔗糖非PTS基因組及FruK雙方，更優(yōu)選只有蔗糖非PTS基因組中的cscA和 FruK被同時增強。本發(fā)明中所謂的蔗糖非PTS基因組，是指微生物的蔗糖同化途徑中與非PTS系統(tǒng)有關(guān)的基因組。詳細而言，是由阻抑蛋白(cscR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)、蔗糖透過酶(cscB)構(gòu)成的基因組。本發(fā)明中選擇蔗糖非PTS基因組的基因時，可以選擇蔗糖非PTS基因組中的1種或2種以上的基因，例如可以舉出cscA單獨、cscA及cscK的組合、 csck R cscB 的組合、csck R cscR 的組合、cscA 禾口 cscB 禾口 cscR 的組合、cscA 禾口 cscK 禾口 cscR的組合等。其中，從更有效地生產(chǎn)乳酸的觀點考慮，優(yōu)選只選擇cscA基因。需要說明的是，在本發(fā)明的某種特定方式中，“蔗糖非PTS基因組中的1種或2種以上的基因”中，優(yōu)選除阻抑蛋白(cscR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透過酶(cscB)的組合、和蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透過酶(cscB)的組合之外的基因。本發(fā)明中所謂的蔗糖水解酶(轉(zhuǎn)化酶、CscA)，是指基于國際生物化學聯(lián)合 (I. U. B.)酶委員會報告被歸屬于酶編號3. 2. 1. 26、催化由蔗糖生成D-葡萄糖和D-果糖的反應的酶的總稱。該酶是K12株等大腸桿菌中本身不具有的酶，是包括質(zhì)子共轉(zhuǎn)運體、轉(zhuǎn)化酶、果糖激酶及蔗糖特異性阻抑蛋白的非PTS代謝途徑的酶的1種(參見Canadian Journal of Microbiology, (1991) vol. 45，PP418-422)。本發(fā)明中通過只賦予該cscA，菌體外的蔗糖可以在外周胞質(zhì)分解為葡萄糖及果糖并釋放到細胞外，并通過葡萄糖PTS及果糖PTS磷酸化并被引入到細胞質(zhì)內(nèi)。結(jié)果果糖可以被供給至細菌中的果糖代謝系統(tǒng)，并可以利用糖酵解系統(tǒng)被同化。作為本發(fā)明的被導入宿主細菌的蔗糖水解酶(轉(zhuǎn)化酶、CscA)的基因，可以利用由具有該酶的生物得到的具有編碼蔗糖水解酶(轉(zhuǎn)化酶、CscA)的基因的堿基序列的DNA、或基于該基因公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例子，可以舉出來自歐文菌屬菌(Erwinia)、變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農(nóng)桿菌屬菌 (Agrobacterium)、根瘤菌屬菌(Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus),雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌0157株的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選為具有來自大腸桿菌0157株的基因的堿基序列的DNA。另外優(yōu)選在CscA中添加用于將CscA移行至菌體的外周胞質(zhì)的信號序列。作為本發(fā)明的被導入宿主細菌的阻抑蛋白(CscR)的基因，可以利用由具有該酶的生物得到的具有編碼阻抑蛋白(CscR)的基因的堿基序列的DNA、或基于該基因公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例子，可以舉出來自歐文菌屬菌(Erwinia)、變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農(nóng)桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌 (Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus),雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌0157株的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選為具有來自大腸桿菌0157株的基因的堿基序列的DNA。作為本發(fā)明的被導入宿主細菌的果糖激酶(CscK)的基因，可以利用由具有該酶的生物得到的具有編碼果糖激酶(CscK)的基因的堿基序列的DNA、或基于該基因公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例子，可以舉出來自歐文菌屬菌(Erwinia)、變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農(nóng)桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌 (Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus),雙歧 桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌0157株的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選為具有來自大腸桿菌0157株的基因的堿基序列的DNA。作為本發(fā)明的被導入宿主細菌的蔗糖透過酶(CscB)的基因，可以利用由具有該酶的生物得到的、具有編碼蔗糖透過酶(CscB)的基因的堿基序列的DNA、或基于該基因公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例子，可以舉出來自歐文菌屬菌(Erwinia)、 變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農(nóng)桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌 (Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus),雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌0157株的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選為具有來自大腸桿菌0157株的基因的堿基序列的DNA。
本發(fā)明中的果糖-1-磷酸激酶(FruK)，是基于國際生物化學聯(lián)合(I. U. B.)酶委員會報告被歸屬于酶編號2. 7. 1. 56、也被稱作果糖磷酸激酶1的酶。在細菌類例如在大腸桿菌內(nèi)的果糖吸收通常在葡萄糖的存在下被抑制，相對于此，到目前為止還完全未發(fā)現(xiàn)FruK 表達的增強即使在葡萄糖的存在下也能促進果糖的吸收，并有助于提高在生產(chǎn)D-乳酸的細菌中D-乳酸的生產(chǎn)率。另外，利用上述CscA由蔗糖得到的果糖被吸收進細胞內(nèi)并被代謝為果糖-1-磷酸后，在一系列的果糖代謝系統(tǒng)中只有FruK的表達增強能夠提高乳酸的生產(chǎn)率，這也是預想之外的。作為本發(fā)明的被導入宿主大腸桿菌的果糖-1-磷酸激酶(FruK)的基因，可以利用由具有該酶的生物得到的具有編碼果糖-1-磷酸激酶的基因(fruK)的堿基序列的DNA，或基于該基因公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例子，可以舉出來自埃希氏菌屬菌(Escherichia)、假單胞菌屬菌(Pseudomonas) lifM lif (Aerobacter)、梭狀芽孢桿菌屬菌(Clostridium)的基因，特別可以舉出來自埃希氏菌屬菌(Escherichia)的基因， 例如可以舉出具有來自大腸桿菌MG1655株的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選具有來自大腸桿菌MG1655株的基因的堿基序列的DNA。本發(fā)明中，較優(yōu)選蔗糖水解酶(CscA)及果糖磷酸激酶的任一種均通過導入編碼來自大腸桿菌0157細菌或大腸桿菌MG1655的各蛋白質(zhì)的基因而得到。通過使用來自上述細菌的基因，能夠確保功能表達。另外本發(fā)明中的D-乳酸產(chǎn)生菌，進一步從能夠促進果糖的吸收的觀點考慮，優(yōu)選 FruR活性失活或減低。 本發(fā)明中作為活性被降低的FruR的基因，只要為宿主細菌本身具有的基因即可， 可以為宿主細菌本來具有的具有編碼FruR的基因的堿基序列的DNA、或基于該基因公知的堿基序列被引入的合成DNA序列。通過在下述生產(chǎn)方法中使用上述的D-乳酸產(chǎn)生菌，可以迅速地生產(chǎn)光學純度高的D-乳酸。<L_乳酸產(chǎn)生菌〉本發(fā)明中的L-乳酸產(chǎn)生菌中，作為NAD依賴性乳酸脫氫酶的活性增強，優(yōu)選NAD 依賴性L-乳酸脫氫酶的活性被增強。本發(fā)明中所謂用作NAD依賴性乳酸脫氫酶的、活性被增強的L-乳酸脫氫酶，是指由丙酮酸和NADH生成L-乳酸和NAD的酶。作為NAD依賴性L-乳酸脫氫酶的基因，可以為具有由持有該酶活性的生物得到的基因的堿基序列的DNA或基于該基因公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選的NAD依賴性L-乳酸脫氫酶基因，只要為在大腸桿菌中可表達的編碼能生產(chǎn)L-乳酸的NAD依賴性L-乳酸脫氫酶的基因即可，沒有特殊限定，例如可以舉出來自雙歧桿菌屬、腸桿菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬的NAD依賴性L-乳酸脫氫酶，特別是從乳酸的生產(chǎn)率的觀點考慮，優(yōu)選為來自長雙歧桿菌的NAD依賴性L-乳酸脫氫酶(Ldh2)。另外，作為增強NAD依賴性L-乳酸脫氫酶活性的方法之一，可以舉出生產(chǎn)D-乳酸的大腸桿菌中對IdhA進行了說明的啟動子的使用等，上述解釋可以直接適用上述事項。上述L-乳酸脫氫酶活性被增強的細菌在通氣條件下生產(chǎn)L-乳酸時，與L-乳酸脫氫酶的表達不被增強時相比，能提高L-乳酸的蓄積量、提高L-乳酸的光學純度。
本發(fā)明中的L-乳酸產(chǎn)生菌中，作為非NAD依賴性乳酸氧化還原酶，從提高光學純度的觀點考慮，優(yōu)選Dld的活性被增強。本發(fā)明中所謂的Dld(FAD依賴性D-乳酸脫氫酶)，是基于國際生物化學聯(lián)合 (I. U. B.)酶委員會報告被歸屬于酶編號1. 1. 2. 4、在作為輔酶的氧化型黃素腺嘌呤二核苷酸的存在下催化由D-乳酸生成丙酮酸的反應的酶的總稱。為了增強Dld的活性而能夠被導入宿主細菌的Dld基因，可以為來自任何微生物的基因，可以舉出來自埃希氏菌屬菌(Escherichia)、棒桿菌屬菌(Corynebacterium)、發(fā)酵單胞菌屬菌(Zymomonas)的基因。

其中，從提高光學純度的觀點考慮，did基因較優(yōu)選選自均具有Lact deh memb結(jié)構(gòu)域的大腸桿菌、發(fā)酵單胞菌及棒桿菌組成的組中的至少一種的did基因，特別優(yōu)選分別來自大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、運動發(fā)酵單胞菌的did基因。需要說明的是發(fā)酵單胞菌屬及棒狀菌屬的did基因還進一步均具有FAD氧化酶結(jié)構(gòu)域。所謂的上述Lact deh memb結(jié)構(gòu)域，是配位在細胞膜上的乳酸脫氫酶所共有的類似性高的氨基酸序列。有無Lact deh memb結(jié)構(gòu)域或FAD氧化酶結(jié)構(gòu)域的序列的信息，可以通過使用 Pfam database (Nucleic Acids Research (2008) Database Issue 36 :D281-D288) ^ftA 酶的氨基酸序列、進行檢索而得到。例如在http://pfam. Sanger, ac. uk/search中輸入氨基酸序列，通過在初期狀態(tài)下進行檢索可以得知在期望的氨基酸序列中是否存在Lact deh memb結(jié)構(gòu)域或FAD氧化酶結(jié)構(gòu)域的序列。作為非NAD依賴性乳酸脫氫酶的活性增強，存在抑制該酶基因轉(zhuǎn)錄的控制因子時，也可以使其活性降低或失活。另外，作為增強Dld活性的方法之一，可以舉出在生產(chǎn)D-乳酸的大腸桿菌中對 IdhA進行說明的啟動子的使用等，可以直接適用上述事項。另外，本發(fā)明中的L-乳酸產(chǎn)生菌中，優(yōu)選選自由LdhA活性、LldD活性及Pfl活性組成的組中的至少一種失活或活性降低。此處有關(guān)于作為活性失活或降低的對象的LdhA、LldD及Pfl的事項，可以直接使用上述的事項。通過LdhA活性的失活或降低，可以抑制作為生成L-乳酸原料的丙酮酸的分解。通過LldD活性的失活或減低，可以抑制作為產(chǎn)物的L-乳酸的消耗。另外本發(fā)明中的L-乳酸產(chǎn)生菌中，與上述的D-乳酸產(chǎn)生菌相同，除上述之外，從抑制副產(chǎn)物的生產(chǎn)量的觀點考慮，優(yōu)選選自由Mdh及AspA活性組成的組中的至少一種失活或活性降低。進而本發(fā)明中的L-乳酸產(chǎn)生菌中，與上述的D-乳酸產(chǎn)生菌相同，為了能夠以其他的糖為原料生產(chǎn)L-乳酸，可以增強選自由CscA及FruK組成的組中的至少一種，更優(yōu)選增強CscA及FruK雙方。另外，從促進果糖的吸收的觀點考慮，本發(fā)明的L-乳酸產(chǎn)生菌中，優(yōu)選FruR活性失活或降低。關(guān)于作為失活或活性降低、或增強對象的Mdh及AspA，以及蔗糖非PTS基因組、 FruK及FruR的事項，可以直接適用上述內(nèi)容?！瓷a(chǎn)乳酸的方法〉以下說明本發(fā)明的生產(chǎn)乳酸的方法。
本發(fā)明的生產(chǎn)乳酸的方法，是使用上述的乳酸產(chǎn)生菌生產(chǎn)乳酸的方法。特別是使用上述的D-乳酸產(chǎn)生菌進行培養(yǎng)，可以高效地生產(chǎn)高光學純度的D-乳酸。同樣地通過使用上述的L-乳酸產(chǎn)生菌進行培養(yǎng)，可以高效地生產(chǎn)高光學純度的L-乳
酸。 本發(fā)明的上述的生產(chǎn)乳酸的方法，具體而言包括在培養(yǎng)液中培養(yǎng)上述的各乳酸產(chǎn)生菌；由通過上述培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物回收乳酸產(chǎn)生菌生成的特定乳酸。本發(fā)明的生產(chǎn)乳酸的方法中，可以使用作為乳酸制造原料通常被使用的來自植物的原料。作為來自植物的原料，只要為從植物得到的碳源即可。具體而言，是指根、莖、干、 枝、葉、花或種子等器官、含有它們的植物體、上述植物器官的分解產(chǎn)物，進而在植物體、植物器官、或由它們的分解產(chǎn)物得到的碳源中，能在微生物的培養(yǎng)中用作碳源的也包括在來自植物的原料中。包含在上述的來自植物的原料中的碳源中，作為一般物質(zhì)可以舉出淀粉、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等糖類，或大量含有上述成分的草木質(zhì)分解產(chǎn)物或纖維素水解物等，或它們的組合，進而來自植物油的甘油或脂肪酸也包含在本發(fā)明中的碳源中。特別是本發(fā)明中的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌具有CscA活性時，具有蔗糖同化能力，因此，即使為含有蔗糖的植物原料也能良好地同化生產(chǎn)乳酸。本發(fā)明中作為來自植物的原料的示例，可以優(yōu)選舉出糧食等農(nóng)作物，例如玉米、 米、小麥、大豆、甘蔗、甜菜、棉花等、或它們的組合，作為該原料的使用形式，可以為未加工品、榨汁、粉碎物等，沒有特別限定。另外，也可以為只為上述碳源的形式。來自植物的原料和生產(chǎn)乳酸的細菌的混合，根據(jù)生產(chǎn)乳酸的細菌的活性而不同， 但通常情況下，作為培養(yǎng)基中的來自植物的原料的濃度，相對于混合物的總質(zhì)量，以葡萄糖換算可以使初始的糖濃度為20質(zhì)量％以下，從細菌的耐糖性的觀點考慮，初始的糖濃度可以優(yōu)選為15質(zhì)量％以下。其他的各成分只要以通常被添加的量添加到微生物的培養(yǎng)基中即可，沒有特殊限制。另外，作為培養(yǎng)基中的生產(chǎn)乳酸的細菌的含量，根據(jù)細菌的種類及活性而不同，但通常相對于培養(yǎng)液，初始的菌濃度可以為0. 1質(zhì)量％ 30質(zhì)量％，從控制培養(yǎng)條件的觀點考慮，可以優(yōu)選為1質(zhì)量％ 10質(zhì)量％。本發(fā)明的所謂培養(yǎng)是使用培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明中的微生物。此時，作為使用的培養(yǎng)基，只要包含碳源、氮源、無機離子、及用于生產(chǎn)乳酸的微生物所要求的有機微量元素、核酸、維生素類等的培養(yǎng)基即可，沒有特殊限制。其中，從生產(chǎn)速度的觀點考慮，優(yōu)選在添加有2種以上氨基酸的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。本發(fā)明中所謂的添加有2種以上氨基酸的培養(yǎng)基，是指含有天然存在的各種氨基酸中的至少2種以上的培養(yǎng)基，還包括含有酵母提取物、水解酪蛋白氨基酸、胨、乳清、廢糖蜜、 玉米漿等天然物質(zhì)或天然物質(zhì)提取物的水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基。為了得到較優(yōu)選的結(jié)果，優(yōu)選含有0. 5質(zhì)量％ 20質(zhì)量％、更優(yōu)選含有2質(zhì)量％ 15質(zhì)量％的選自酵母提取物、胨、乳清、廢糖蜜及玉米漿中的至少1種或它們的混合物的培養(yǎng)基。特別是玉米漿的添加能得到明顯的效果，此時不添加硫酸銨等鹽反而有時得到更好的結(jié)果。培養(yǎng)基為通常的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件根據(jù)制備的菌體、培養(yǎng)裝置而改變，例如優(yōu)選在20°C 40°C，較優(yōu)選在25°C 35°C下的培養(yǎng)溫度進行培養(yǎng)，優(yōu)選利用NaOH、NH3等將pH調(diào)至6. O 8. O、更優(yōu)選至 7. O 7. 6進行培養(yǎng)。培養(yǎng)時間沒有特別限定，是菌體充分增殖、且乳酸生成所需要的時間。培養(yǎng)時通常使用能控制溫度、pH、通氣條件、攪拌速度的培養(yǎng)槽，但本發(fā)明的培養(yǎng)并不限于使用培養(yǎng)槽。使用培養(yǎng)槽培養(yǎng)時，根據(jù)需要也可以預先進行作為預培養(yǎng)的種培養(yǎng)， 然后將其必要量接種到預先配制的培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)基中。本發(fā)明中所謂的培養(yǎng)物，是指由上述方法生產(chǎn)的菌體、培養(yǎng)液、及它們的處理物。 從如上所述得到的培養(yǎng)液等培養(yǎng)物中回收乳酸的方法，例如，如果是從培養(yǎng)液中回收，則可以利用通常已知的方法，例如，可以采用酸化后直接蒸餾的方法、形成丙交酯后進行蒸餾的方法、加入醇和催化劑進行酯化后進行蒸餾的方法、在有機溶劑中提取的方法、 利用離子交換柱分離的方法、利用電透析濃縮分離的方法等或?qū)⑸鲜龇椒ńM合的方法。另夕卜，利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的菌體由于能產(chǎn)生適合生產(chǎn)乳酸的酶組，所以利用該酶組進一步生產(chǎn)、回收乳酸，也被認為是從培養(yǎng)物中回收乳酸的方法的一部分。使用本發(fā)明的生產(chǎn)乳酸的方法由于能生產(chǎn)光學純度高的乳酸，所以如果回收培養(yǎng)物中含有的乳酸，則可以得到高純度的D-乳酸或L-乳酸。培養(yǎng)本發(fā)明中得到的微生物生產(chǎn)乳酸時，可以完全不進行通氣，但為了得到較優(yōu)選結(jié)果，進行通氣較好。此處所謂的通氣條件下，未必是必須將空氣通過培養(yǎng)液中，也包括根據(jù)培養(yǎng)槽的形狀一邊適度地攪拌培養(yǎng)液一邊將培養(yǎng)液上的空氣層進行換氣之類的上面通氣，所謂的通氣條件下是指使含有氧的氣體流入培養(yǎng)槽的內(nèi)部。通氣到液中時，由于根據(jù)內(nèi)壓、攪拌槳位置、攪拌槳形狀、攪拌速度的組合使得溶存的氧濃度發(fā)生變化，所以可以以乳酸的生產(chǎn)率及除乳酸之外的有機酸的量等為指標如下求出最適條件。例如，使用500g的培養(yǎng)液利用ABLE公司制培養(yǎng)裝置BMJ-Ol等較小型的培養(yǎng)槽進行培養(yǎng)時，通過能夠達到使空氣在常壓下0. Olvvm Ivvm的通氣率和50rpm 500rpm的攪拌速度、較優(yōu)選能夠達到在常壓下0. Ivvm 0. 5vvm的通氣率和IOOrpm 400rpm的攪拌速度的通氣條件可以得到合適結(jié)果。所述條件如下使通氣攪拌條件為以溫度30°C的水為對象時常壓下氧轉(zhuǎn)移速度系數(shù)kLa為Ι/h以上400/h以下的條件下可達到的氧供給成為可能。另外，作為最適通氣條件的其他指標，是由使pGAP-cscA-lox-lldD/ MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp Δ fruR/GAPldhA基因組插入株在厭氧培養(yǎng)下生產(chǎn)的甲酸、乙酸、丁二酸或乙醇或它們的組合的總量在5. Og/L以下、更優(yōu)選在1. Og/L以下并且能夠生產(chǎn)乳酸的通氣量、攪拌速度達成的通氣條件。另外，作為最適通氣條件的其他指標，是在含有0.3%的作為光學異構(gòu)體的L-乳酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng) pGAP-cscA-lox-lldD/MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp Δ fruR/GAPldhA 基因組插入株時，在10 100小時之內(nèi)使L-乳酸的濃度降低為0. 02質(zhì)量％以下的通氣量、 攪拌速度。上述的通氣條件不需要從培養(yǎng)初期到結(jié)束一直維持，即使在培養(yǎng)工序的一部分維持上述通氣條件也能得到優(yōu)選結(jié)果。通過進行如上所述的通氣可以達成提高乳酸生產(chǎn)率、 減少光學異構(gòu)體。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)乳酸的方法，可以以高光學純度得到L-乳酸或D-乳酸，即使在生產(chǎn)原料中含有使光學純度下降的其他光學異構(gòu)體，通過分解不為目標的光學異構(gòu)體，可以生產(chǎn)作為目標的光學異構(gòu)體。 使用本發(fā)明的生產(chǎn)乳酸的方法，可以使用常規(guī)方法HPLC或F-試劑盒D-/L-乳酸 (J*K· International產(chǎn)品編號1112821)確認光學純度。特別是使用上述F-試劑盒測定所得上清液中的L-乳酸量及D-乳酸量，通過代入下式求出的方法進行測定，可以以98 % e. e.以上的光學純度得到作為目標的L-或D-乳酸，可以優(yōu)選以99.5% e.e.以上的光學純度得到作為目標的L-或D-乳酸。光學純度(％e.e.)= 100 X (D乳酸濃度-L乳酸濃度)/ (D乳酸濃度+L乳酸濃度)上式中的乳酸濃度為質(zhì)量基準。另外根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)乳酸的方法，與使用NAD依賴性乳酸脫氫酶及非NAD依賴性乳酸氧化還原酶的雙方均不被增強的大腸桿菌制造D-乳酸或L-乳酸時相比，可以迅速地生產(chǎn)如上所述的高光學純度的光學異構(gòu)體。[實施例]以下用實施例詳細地說明本發(fā)明。但是本發(fā)明并不限定于這些。需要說明的是， 只要沒有特殊說明，則“ ％ ”及“份”為質(zhì)量基準。-D-乳酸產(chǎn)生菌一[實施例1]<大腸桿菌MG1655株did基因缺失株的制備>大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列是公知的(GenBank accession number U00096)，編碼大腸桿菌的FAD依賴性D-乳酸脫氫酶(以下有時簡記為Did)的基因的堿基序列也被 艮道(Genbank accession number M10038)?；诖竽c桿菌MG1655株基因組DNA的did基因附近區(qū)域的基因信息，合成了下述 4 種寡核苷酸引物CAACACCAAGCTTTCGCG(序列號 1)、TTCCACTCCTTGTGGTGGC(序列號 2)、 AACTGCAGAAATTACGGATGGCAGAG(序列號 3)及 TGTTCTAGAAAGTTCTTTGAC (序列號 4)。IHig Current Protocols in Molecular Biology (JohnWiley&Sons) 白勺力夕去制備大腸桿菌MG1655株的基因組DNA，以所得的基因組DNA為模板，使用序列號1和序列號2的引物，在通常條件下進行PCR，由此擴增約1. 4kbp的DNA片段(以下也稱作dld_L 片段)，使用序列號3和序列號4的引物，在通常條件下進行PCR，由此擴增約1. 2kbp的 DNA片段(以下也稱作dld-R片段)。分別利用限制酶HindIII和PstI, PstI和XbaI消化所得的dld-L片段、dld-R片段。將該片段與使用Hindlll、XbaI消化溫度感受性質(zhì)粒 pTH18csl (Hashimoto-Gotoh, Τ.，et. al.，Gene, Vol. 241 (1)，pp 185-191 (2000))所得的片段進行混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細胞(東洋紡績株式會社DNA-903) 中，從而得到在30°C下在含有10μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于30°C在含有10 μ g/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中回收質(zhì)粒。將所得的質(zhì)粒命名為ΡΤΗΔ did。需要說明的是大腸桿菌MG1655株可以從作為細胞·微生物·基因庫的美國模式菌種收集中心獲得。[實施例2]在30°C下將實施例1中得到的質(zhì)粒pTHAdld轉(zhuǎn)化到MG1655株中，得到在含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的轉(zhuǎn)化體涂布到瓊脂平板上，于 30°C下培養(yǎng)一夜。然后為了得到上述培養(yǎng)菌體，將培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體涂布到含有10μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上，得到于42°C下繁殖的菌落。進而再一次重復得到于42°C下繁殖的單菌落的操作，通過相同重組選擇質(zhì)粒整體被組裝到染色體中的克隆體。確認了該克隆體的細胞質(zhì)中不具有質(zhì)粒。
然后將上述克隆體涂布在LB瓊脂平板上，于30°C下培養(yǎng)一夜后，接種到LB液體培養(yǎng)基(3ml/試管)中，于42°C下振搖培養(yǎng)3 4小時。為得到單菌落，對其進行適當稀釋(10_2 10_6左右)，涂布在LB瓊脂平板上，于42°C培養(yǎng)一夜，得到菌落。在出現(xiàn)的菌落中任意挑選100個菌落，使其分別在LB瓊脂平板上和含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖，選出只在LB瓊脂平板上繁殖的氯霉素感受性克隆體。然后使用上述目標克隆體的染色體DNA利用PCR擴增含有did的約2. Okb的片段，選擇did基因區(qū)域缺失的株，以滿足上述條件的克隆體作為did缺失株，并將所得的株命名為MG1655 Δ did株。[實施例3]<大腸桿菌MG1655pfl、did基因缺失株的制備>大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列是公知的(GenBank accession number U00096)，編碼大腸桿菌的丙酮酸甲酸裂解酶(以下也稱作Pfl)的基因的堿基序列也被報道(Genbank accession number AE000192)。為了克隆編碼Pf 1基因的堿基序列的附近區(qū)域，合成了下述4種寡核苷酸引物GCACGAAAGCTTTGATTACG (序列號5)、 TTATTGCATGCTTAGATTTGACTGAAATCG(序列號 6) TTATTGCATGCTTATTTACTGCGTACTTCG (序列號 7)AAGGCCTACGAAAAGCTGCAG(序列號 8)。以大腸桿菌MG1655株的基因組DNA為模板，使用序列號5和序列號6的引物，在通常條件進行PCR，由此擴增約1. Skbp的DNA片段(以下也稱作pflB-L片段)，另外，使用序列號7和序列號8的引物，在通常條件進行PCR，由此擴增約1. 3kbp的DNA片段(以下也稱作PflB-R片段)。利用瓊脂糖電泳分離、回收上述DNA片段，用HindIII及SphI消化pflB-L片段、用SphI及PstI消化pflB-R片段。利用T4DNA連接酶使上述2種消化片段和溫度感受性質(zhì)粒 pTH18csl (GenBank accession numberAB019610)的 HindIII 及 PstI 消化物反應后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞(東洋紡績株式會社DNA-903)中，得到包含編碼PflB的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2個片段的質(zhì)粒，命名為 ρΤΗΔρ !。將所得的質(zhì)粒ρΤΗ Δ pf 1轉(zhuǎn)化到實施例2中所得的MG1655 Δ did株中，得到于30°C 在含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的轉(zhuǎn)化體涂布在瓊脂平板上，于30°C下培養(yǎng)一夜。然后為了得到上述培養(yǎng)菌體，將培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體涂布在含有IOyg/ ml氯霉素的LB瓊脂平板上，得到于42°C下繁殖的菌落。按照與實施例2相同的方法從所得的克隆體中得到pfl基因被破壞的 MG1655 Δ did 株，命名為 MG1655 Δ pfl Δ did 株。[實施例4]< 大腸桿菌 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh 株的制備 >大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列是公知的(GenBank accession number U00096)，大腸桿菌的mdh基因的堿基序列也被報道(Genbank accessionnumber AE000403)。為了克隆編碼Mdh的基因(939bp)的堿基序列的附近區(qū)域， 合成了下述4種寡核苷酸引物AAAGGTACCAGAATACCTTCTGCTTTGCCC(序列號9)、 AAAGGATCCCCTAAACTCCTTATTATATTG(序列號 10)、AAAGGATCCAAACCGGAGCACAGACTCCGG (序列號 11)及 AAATCTAGAATCAGATCATCGTCGCCTTAC(序列號 12)。以大腸桿菌MG1655株的基因組DNA為模板，利用序列號9和序列號10、序列號11 和序列號12的組合，在通常條件進行PCR，由此分別擴增約SOObp (以下也稱作mdh-L片段) 的DNA片段、和約1，OOObp (以下也稱作mdh-R片段)的DNA片段。利用瓊脂糖電泳分離、 回收上述DNA片段，用KpnI及BamHI消化mdh_L片段，用BamHI及XbaI消化mdh-R片段。 利用T4DNA連接酶使上述2種消化片段與溫度感受性質(zhì)粒pTH18csl (GenBank accession number AB019610)的KpnI及XbaI消化物反應后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞(東洋紡績株式會社DNA-903)中，得到包含編碼mdh的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2個片段的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為pTHAmdh。將質(zhì)粒ρΤΗ Δ mdh轉(zhuǎn)化到 實施例3中得到的大腸桿菌MG1655 Δ pf 1 Δ did株中，按照與實施例2相同的方法獲得mdh基因被破壞的MG1655Apfl Adld株。將該株命名為 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh 株。[實施例5]< 大腸桿菌 MG1655 Δ pfl AdldAmdhAasp 株的制備 >大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列是公知的(GenBank accession number U00096),大腸桿菌的aspA基因的堿基序列也被報道(Genbank accession number AE000486)。為了克隆編碼AspA的基因(1，482bp)的堿基序列的附近區(qū)域， 合成了下述4種寡核苷酸引物TTTTGAGCTCGATCAGGATTGCGTTGGTGG(序列號13)、 CGAACAGTAATCGTACAGGG(序列號 14)、TACGATTACTGTTCGGCATCGACCGAATACCCGAG (序列號 15) 及 TTTTTCTAGACCTGGCACGCCTCTCTTCTC(序列號 16)。以大腸桿菌MG1655株的基因組DNA為模板，利用序列號13和序列號14、序列號 15和序列號16的組合，使用上述引物在通常條件進行PCR，由此擴增約910bp (以下也稱作 aspA-L片段)的DNA片段、和約1，IOObp (以下也稱作aspA-R片段)的DNA片段。利用瓊脂糖電泳分離、回收該DNA片段，利用DNA Blunting Kit (Takara Bio)將aspA-L片段和 aspA-R片段的兩者的末端平端化后，使用T4多核苷酸激酶，按照常規(guī)方法磷酸化5’末端。 另外，溫度感受性質(zhì)粒pTH18csl經(jīng)SmaI消化后，利用堿性磷酸酶進行脫磷酸化處理。利用 T4DNA連接酶使上述磷酸化的2種片段與脫磷酸化的質(zhì)粒反應后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞(東洋紡績株式會社DNA-903)中，得到包含編碼AspA的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2個片段的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為pTHAasp。將質(zhì)粒pTHAasp轉(zhuǎn)化到實施例4中得到的大腸桿菌MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh 株中，最終得到aspA基因被破壞的MG1655ApflAdldAmdh株，命名為 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp株。得到該株的詳細的方法基于本發(fā)明的實施例2中所述的方法。[實施例6]<大腸桿菌MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp株的基因組上IdhA啟動子對GAPDH啟動子的取代〉
大腸桿菌的IdhA基因的堿基序列被全部報道(GenBank accession number U36928)。為了獲得甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子，使用大腸桿菌MG1655株的基因組DNA 為模板，利用 AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC (序列號 17)及 ACAGAATTCGCTATTTG TTAGTGAATAAAAGG (序列號18)用PCR法進行擴增，利用限制酶EcoRI消化所得的DNA片段， 由此得到約IOObp的編碼GAPDH啟動子的片段。進而為了獲得D-乳酸脫氫酶基因(IdhA)， 使用大腸桿菌MG1655株的基因組DNA為模板，利用GGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGAAACT (序列號19)、及CCCAAGCTTTTAAACCAGTTCGTTCGGGC(序列號20)用PCR法進行擴增，利用 限制酶 EcoRI及HindIII消化所得的DNA片段，由此得到約1. Okbp的D-乳酸脫氫酶基因(IdhA)片段。將上述2個DNA片段與利用限制酶EcoRI及HindIII消化質(zhì)粒pUC18所得的片段進行混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞(東洋紡績株式會社DNA-903) 中，得到在含有50μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于 30°C下在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)一夜，從所得的菌體回收質(zhì)粒 pGAP-ldhA。進而使用基于大腸桿菌MG1655株的IdhA基因5’附近區(qū)域的基因信息制備的、 AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC(序列號 21)和 GCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC (序列號 22)，以大腸桿菌基因組DNA為模板進行PCR，由此擴增約IOOObp的DNA片段。另外，使用基于大腸桿菌MG1655株的甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子的序列信息制備的GGTCTAGAGCAATGATTCACACGATTCG(序列號23)和基于大腸桿菌MG1655株的 IdhA基因的序列信息制備的AACTGCAGGTTCGTTCTCATACACGTCC(序列號24)，以預先制備的質(zhì)粒pGAPldhA為模板進行PCR，得到由GAPDH啟動子和IdhA基因的起始密碼子的附近區(qū)域組成的約850bp的DNA片段。分別利用限制酶KpnI和XbaI、XbaI和PstI消化如上所述得到的片段。將所得的片段與利用KpnI和PstI消化溫度感受性質(zhì)粒pTH18csl所得的片段進行混合，使用連接酶連接，然后，于30°C下轉(zhuǎn)化到DH5ci感受態(tài)細胞(東洋紡績株式會社DNA-903)中，得到在含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于30°C下在含有10 μ g/ ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中回收質(zhì)粒，命名為pTH-GAPldhA。將所得的質(zhì)粒pTH-GAPldhA轉(zhuǎn)化到實施例5中得到的大腸桿菌 1^1655八？打八(11(^111(11^￡1印株中，于301下在含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)一夜，得到轉(zhuǎn)化體。將所得的轉(zhuǎn)化體接種到含有10 μ g/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基上，于 30°C下培養(yǎng)一夜。然后為了得到上述培養(yǎng)菌體，將培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體涂布在含有10μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上，得到于42°C下繁殖的菌落。將所得的菌落于30°C下在不含氯霉素的 LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，進而涂布在不含氯霉素的LB瓊脂平板上得到42°C下繁殖的菌落。在出現(xiàn)的菌落中任意挑選100個菌落，使其分別在不含氯霉素的LB瓊脂平板上和含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖，挑選氯霉素感受性克隆體。然后使用上述目標克隆體的染色體DNA利用PCR擴增含有GAPDH啟動子和IdhA基因的約800bp的片段，選擇IdhA啟動子區(qū)域被GAPDH啟動子取代的株，將滿足以上條件的克隆體命名為 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp/GAPldhA 基因組插入株。<1 IdR破壞株的制備〉
利用以下方法制備破壞IldR基因的質(zhì)粒。大腸桿菌的IldR基因的堿基序列全部被報道(GenBank accession number U000963777077 3777853)。為了克隆編碼IldR的基因的堿基序列的附近區(qū)域，使用GGGAATTCGACATCATTCGCT CGTCTATTCTTTCGATA (序列號 2 、GGGTACCTTAAGGAATCATCCACGTTAAGACAT (序列號洸)，以大腸桿菌基因組DNA為模板進行PCR，由此擴增IldR上游的DNA片段，并利用限制酶EcoRI、 KpnI 切斷。然后，以 ATGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG (序列號 27)、GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG(序列號 28)為引物，以大腸桿菌基因組 DNA 為模板進行PCR，由此擴增IldR下游的DNA片段，并利用限制酶Kpnl、Sail切斷。利用 T4DNA連接酶使上述2種消化片段與溫度感受性質(zhì)粒pTH18csl (GenBank accession number AB019610)的EcoRI及Mil消化物反應后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞(東洋紡績株式會社DNA-903)中，得到包含編碼LldD的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2個片段的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為ρΤΗΔ lldR。將所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到MG1655 ApflAdld Amdh Δ asp/GAPldhA基因組插入株中， 于30°C下在含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)一夜，得到轉(zhuǎn)化體。將所得的轉(zhuǎn)化體接種到含有10 μ g/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基上，于30°C下培養(yǎng)一夜。然后為了得到上述培養(yǎng)菌體，將培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體涂布到含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上，于42°C下得到繁殖的菌落。將所得的菌落于30°C在不含有氯霉素的LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)一夜，然后涂布在不含氯霉素的LB瓊脂平板上，得到于42°C下繁殖的菌落。在出現(xiàn)的菌落中任意挑選100個菌落，使其分別在不含氯霉素的LB瓊脂平板上和含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖，挑選氯霉素感受性克隆體。然后使用上述目標克隆體的染色體DNA利用PCR擴增IldR周邊，選擇IldR區(qū)域缺陷的株，將滿足以上條件的克隆體命名為MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp Δ lldR/GAPldhA基因組插入株。[實施例7]< 大腸桿菌 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp Δ fruR/GAPldhA 基因組插入株的制備 >大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列是公知的(GenBank accession number U00096)，大腸桿菌MG1655的fruR基因的堿基序列已經(jīng)被報道。S卩，fruR基因被記載在 GenBank accession number U00096中記載的大腸桿菌MG1655株基因組序列的880 89032。為了克隆編碼fruR的基因(IO(^bp)的堿基序列的附近區(qū)域，合成了 4種如下所示的寡核苷酸引物:TACTGCAGATCTCAATAACCGCTATCTGG (序列號29)、 GCTCTAGATAGCCATTGTACTGGTATGG (序列號 30)、TATCTAGATGCTCAGCCGTAGCTAAGC (序列號 31) 及 CGAATTCATCCATCTGACATTCGCTGG(序列號 32)。以大腸桿菌MG1655株的基因組DNA為模板，利用序列號四和序列號30、序列號 31和序列號32的組合，使用上述引物，在通常條件進行PCR，由此擴增約950bp(以下也稱作fruR-L片段)、及約880bp (以下也稱作fruR-R片段)的DNA片段。利用瓊脂糖電泳分離、回收該DNA片段，用I^stI及^CbaI消化fruR-L片段，用)(baI及EcoRI消化fruR-R片段。 利用T4DNA連接酶使上述2種消化片段與溫度感受性質(zhì)粒pTH18csl (GenBan kaccession number AB019610)的I3StI及EcoRI消化物反應后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞(東洋紡績株式會社DNA-903)，得到包括編碼FruR的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2個片段的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為pTHAfruR。將質(zhì)粒pTHAfruR轉(zhuǎn)化到實施例6中得到的大腸桿菌 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp/GAPldhA基因組插入株中，按照與實施例2相同的方法獲得 fruR基因被破壞的MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp/GAPldhA基因組插入株。將該株命名為 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp Δ fruR/GAPldhA 基因組插入株。[實施例8]〈來自大腸桿菌0157的蔗糖水解酶(轉(zhuǎn)化酶)基因的表達載體及該表達載體轉(zhuǎn)化體的構(gòu)建>大腸桿菌0157的轉(zhuǎn)化酶的氨基酸序列和基因的堿基序列已經(jīng)被報道。即，編碼轉(zhuǎn)化酶的基因(cscA)被記載在GenBank accession number AE005174中記載的大腸桿菌 0157株基因組序列的3274383 3275816中。作為使上述基因表達所必需的啟動子的堿基序列，可以使用在GenBank accession numberX02662的堿基序列信息中記載于397-440的來自大腸桿菌的甘油醛3-磷酸脫氫酶(以下也稱作GAPDH)的啟動子序列。使用用于獲得GAPDH啟動子的大腸桿菌MG1655株的基因組DNA為模板，利用CGA GCTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG(序列號 3 、及 TCTAGAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG (序列號34)用PCR法進行擴增，利用限制酶NdeI消化所得的DNA片段得到約IlObp相當于GAPDH啟動子的DNA片段。將所得的DNA片段與利用限制酶NdeI及PvuII消化質(zhì)粒 PBR322 (GenBank accession numberJ01749)所得到的片段進行混合，使用連接酶連接后， 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci株感受態(tài)細胞(東洋紡績株式會社DNA-903)中，得到在含有50yg/ mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于37°C下在含有50 μ g/mL 氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中回收質(zhì)粒pBRgapP。為了獲得轉(zhuǎn)化酶基因，使用大腸桿菌0157的基因組DNA (SIGMA-ALDRICH IRMM449)為模板，利用 GATCTAGACGGAGAAAGTCTTATGACGCAATCTCGATTGCATG(序列號 35)、及 ATGGTACCTTAACCCAGTTGCCAGAGTGC(序列號36)用PCR法進行擴增，利用限制酶XbaI消化所得的DNA片段，由此得到約1. 4kbp的轉(zhuǎn)化酶基因片段。將所得的DNA片段與利用限制酶 ^CbaI及I^shAI消化預先制成的質(zhì)粒pBRgapP所得的片段進行混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci株感受態(tài)細胞(東洋紡績株式會社DNA-903)中，得到在含有50 μ g/mL 氨芐青霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于37°C下在含有50μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中回收質(zhì)粒pGAP-cscA。將該質(zhì)粒pGAP-cscA轉(zhuǎn)化到實施例7中制成的 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp Δ fruR/GAPldhA 基因組插入株感受態(tài)細胞中，于 37 °C 下在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LBBroth，Mi 1 Ier瓊脂平板上培養(yǎng)一夜，由此得到 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp Δ fruR/GAPldhA 基因組插入株 /pGAP-cscA 株。另外轉(zhuǎn)化到實施例6中制成的MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp/GAPldhA基因組插入株感受態(tài)細胞中，于37°C在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LBBroth，MiIler瓊脂平板下培養(yǎng)一夜，由此得到 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp/GAPldhA 基因組插入株 /pGAP-cscA 株。[實施例9]<lox基因的分離〉
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以日本特開平10-248574中公開的L-乳酸氧化酶的堿基序列為基礎，設計、合成 2 種如下所示的寡核苷酸引物ATTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGGAAAAAACATATCAAGCAGGTAC AAATG(序列號 37)、CAGGTACCTTAAATAAAACGATTCTCACGCAATTTTA(序列號 3 。序列號 37 的引物在5’末端側(cè)具有^CbaI識別位點和IdhA的SD序列。序列號38的引物在5’末端具有KpnI識別位點。從Enterococcus sp. ATCC9625 (日本特開平10-248574中被記為Lactococcuslactis (subsp. CremorisIF03427))中分離染色體DNA，將其作為模板進行 PCR，分離被擴增的DNA片段。純化被擴增的DNA片段，用^CbaI消化。將被消化的片段與利用限制酶)(bal及I^shAI消化實施例8中所得的pBRgapP得到的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α株感受態(tài)細胞(東洋紡績株式會社DNA-903)中，得到在含有50μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于37°C下在含有 50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中回收質(zhì)粒pGAP-lox。 通過DNA序列確定分離的Iox基因的堿基序列。[實施例10]<lldD 的分離 >大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列是公知的，編碼大腸桿菌的FMN依賴性 L-乳酸脫氫酶的基因(IldD)的堿基序列也被報道。(Genbank accession number U00096、 3777850 3779040)。為了克隆lldD，設計、合成了如下所示的2種寡核苷酸引物ATTCTAG ACGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG (序列號 3 、GATGGTACCCTATGCCGCATTCC CTTTCGCCATG(序列號 40)。利用通常方法分離大腸桿菌K12株的基因組DNA，以所得的DNA為模板進行PCR。 純化被擴增的DNA片段，用^CbaI消化?；旌侠孟拗泼竈CbaI及I^shAI消化實施例8中所得的pBRgapP得到的片段，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α株感受態(tài)細胞(東洋紡績株式會社DNA-90;3)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于37°C在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中回收質(zhì)粒pGAP-lldD。通過DNA序列確定分離的IldD的堿基序列?！赐蛔僆ldD的制備〉為了制備突變lldD，使用上述使用的序列號39、序列號40表示的寡核苷酸引物以 pGAP-lldD ^Ilfe^M GeneMorph ( Sil^fe ) II Random Mutagenesis Kit (Stratagene) 的流程利用PCR制備IldD的突變基因。純化所擴增的DNA片段，利用^CbaI進行消化?；旌侠孟拗泼?(bal及I^shAI消化實施例8中所得的pBRgapP得到的片段，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α株感受態(tài)細胞(東洋紡績株式會社DNA-903)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落植入到添加有 300 μ L培養(yǎng)基的容積為1孔2ml的96孔深孔平板上(1 %葡萄糖，1. 2 %胨，2 %酵母提取物、(PH7.5))上，于33度下攪拌M小時進行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細菌細胞，除去上清液后，加入200 μ 1溶菌酶液(0. 285mg/ml溶酶菌、1. 5U/mlDNaseI、2mM MgCl2),通過移液混合35次。在35°C下溫育15分鐘后，再一次進行35次的移液混合，通過目視確認已溶菌后，取出 10 μ 1 添力口至Ij 190 μ 1 的反應液(20mg/ml phenazine methosulfate、3mg/ml 3_[4， 5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromideO. 5MKPB(pH7. 0))中。然后添加40 μ 1的IOOmM L-乳酸鈉(ρΗ7· 0)，觀察570nm的吸光度的增加速度。
從與對照相比顯示出1.5倍以上的增加速度的菌落中提取質(zhì)粒，通過DNA序列確定分離的突變IldD的堿基序列。序列示于序列號41。將所得的質(zhì)粒作為pGAP-突變lldD。<Lox, LldD同時增強質(zhì)粒的構(gòu)建>利用限制酶Ml I切斷將以pGAP-突變11 dD為模板、以ATCGTCGACCGGAGAAAGTC TTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG (序列號 4 、GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCAT G(序列號觀)為引物、利用PCR得到的IldD片段，將純化的片段與利用限制酶MlI切斷 PGAP-Iox所得的片段進行混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α株感受態(tài)細胞 (東洋紡績株式會社DNA-903)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。由所得的轉(zhuǎn)化體得到質(zhì)粒pGAP-lox-突變lldD。突變IldD的插入方向通過序列確認。[實施例11]<lct0 的分離 >編碼Lactococcus lactis IL1403的L-乳酸氧化酶的基因的堿基序列被公開 (Genbank accession number AE006357、4813 3662)。以該堿基序列信息為基礎，為了從 L. lactissubsp. lactisATCC19435中分離L-乳酸氧化酶基因，設計、合成了 2種如下所示的寡核苷酸引物AATTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGCATCTATCATCTACAGATGTAAACTTTA (序列號 43)、ACAGGTACCTTAGTCAATCAATGAGGTATGTTTGATTT(序列號 44)。序列號 43 的引物在 5，末端側(cè)具有)(bal識別位點和Idh的SD序列。序列號44的引物在5’末端具有KpnI識別位點ο分離L. lactissubsp. lactisATCC19435的基因組DNA，將其作為模板，使用序列號 43、44所示的寡核苷酸引物，在通常條件下進行PCR。純化被擴增的DNA片段，用^CbaI進行消化?；旌侠孟拗泼?CbaI及I3ShAI消化實施例8中所得的pBRgapP得到的片段，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α株感受態(tài)細胞(東洋紡績株式會社DNA-903)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于37°C在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中得到含有IctO的質(zhì)粒,命名為pGAP-lctO。通過DNA序列確定分離的IctO的堿基序列。[實施例12]<用于生產(chǎn)乳酸的質(zhì)粒的構(gòu)建>利用限制酶Kpnl、Sail切斷實施例8中所得的pGAP-cscA，得到純化的片段。利用限制酶 KpnI，SalI 分別切斷以 ATGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGGAAAAAACATATCAAGCAGGTAC AAATG(序列號 45)、CAGTCGACTTAAATAAAACGATTCTCACGCAATTTTA(序列號 46)為引物與實施例 9 同樣地進行 PCR 得到的 Iox 片段、以 ATGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGC CAGCGATTATCG (序列號 27)、GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG (序列號 2 為引物與實施例10同樣地進行PCR得到的IldD片段、及以AATGGTACCCGGAGAAAGTCTTATGCATCT ATCATCTACAGATGTAAACTTTA(序列號 47)、ACAGTCGACTTAGTCAATCAATGAGGTATGTTTGATTT (序列號48)為引物與實施例11同樣地進行PCR得到的IctO片段，在各自片段中混合上述得到的pGAP-cscA片段，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α株感受態(tài)細胞(東洋紡績株式會社DNA-903)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上繁殖的
23轉(zhuǎn)化體。由所得的轉(zhuǎn)化體得到 pGAP-cscA-lox，pGAP-cscA-lldD, pGAP-cscA-lctO。進而利用限制酶Ml I切斷以大腸桿菌的基因組DNA為模板以ATCGTCGACCGGAGAAAGTCTTA TGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG (序列號 4 、GATGTCGACCTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATG (序列號28)為引物通過PCR得到的IldD片段，將純化的片段與利用限制酶切斷MlI pGAP-cscA-lox得到的片段進行混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α株感受態(tài)細胞(東洋紡績株式會社DNA-903)中，得到在含有50yg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。由所得的轉(zhuǎn)化體得到質(zhì)粒pGAP-cscA-lox-lldD。插入方向通過序列確認。進而利用限制酶MlI切斷以大腸桿菌的基因組DNA為模板、以ATCGTCGACC GGAGAAAGTCTTATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCG (序列號 4 、GATGTCGACCTATGCCGCATTC CCTTTCGCCATG(序列號28)為引物通過PCR得到的IldD片段，將純化的片段與利用限制酶MlI切斷pGAP-cscA-lctO得到的片段進行混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci株感受態(tài)細胞(東洋紡績株式會社DNA-903)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。由所得的轉(zhuǎn)化體得到質(zhì)粒pGAP-cscA-lctO-lldD。 將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到實施例7中得到的MG1655 Δ pfl Δ did Amdh Δ asp Δ fruR/GAPldhA基因組插入株中，得到 pGAP-cscA-lox/MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp Δ fruR/GAPldhA 基因組插入株、pGAP-cscA-lldD/MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp Δ fruR/GAPldhA 基因組插入株、pGAP-cscA-lct0/MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp Δ fruR/GAPldhA 基因組插入株、 pGAP-cscA-lox-lldD/MG1655Apfl AdldAmdhAaspAfruR/GAPldhA 基因組插入株、 pGAP-cscA-lct0-lldD/MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp Δ fruR/GAPldhA 基因組插入株。[實施例13]<LldD增強的效果〉將質(zhì)粒pBRgapP、及pGAP_lldD轉(zhuǎn)化到實施例6中制備的 MG1655Apfl AdldAmdhAasp/GAPldhA 基因組插入株中，制備 pBRgapP/ MG1655 Apfl AdldAmdhAasp/GAPldhA 基因組插入株及 pGAP-lldD/ MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp/GAPldhA 基因組插入株。作為預培養(yǎng)，是在500ml容積的帶擋板的錐形瓶中加入100ml含有50 μ g/ml濃度的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(Difcocat. 244620)，分別植入上述D-乳酸產(chǎn)生菌，于35°C 下、以120rpm攪拌培養(yǎng)一夜后，分別將0. 5%植入到裝有500mL培養(yǎng)基(12%葡萄糖、3%玉米漿日本食品化工制Lot(190718C)以下相同)的IL容積培養(yǎng)槽(ABLE公司制培養(yǎng)裝置 BMJ-01)中。在大氣壓下、通氣量為0. 5vvm、攪拌速度為200rpm、培養(yǎng)溫度為;35°C、pH7. 2 下進行48小時的培養(yǎng)。利用HPLC按照常規(guī)方法測定所得的培養(yǎng)液中的乳酸。另外所得的乳酸的光學純度如下求出使用F-試劑盒D-/L-乳酸(J · K · International產(chǎn)品編號 1112821)測定所得的上清液中的L-乳酸量、及D-乳酸量，代入下式求出。光學純度(％e.e.) = 100X (D乳酸濃度-L乳酸濃度)/ (D乳酸濃度+L乳酸濃度)結(jié)果示于表1。如表1所示，判明了通過增強IldD能夠提高所得的乳酸的光學純度。[表 1]
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，所述大腸桿菌的1種以上的NAD依賴性乳酸脫氫酶及1 種以上的非NAD依賴性乳酸氧化還原酶的各酶活性均被增強，從而分解D-乳酸及L-乳酸中的任一方而生產(chǎn)另一方。
2.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述NAD依賴性乳酸脫氫酶的活性增強使丙酮酸生成D-乳酸和L-乳酸中的任一方，并且，所述非NAD依賴性乳酸氧化還原酶的活性增強使所述D-乳酸及L-乳酸中的任意另一方作為基質(zhì)進行分解。
3.如權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述NAD依賴性乳酸脫氫酶的活性增強是LdhA的活性增強，能夠生產(chǎn)所述D-乳酸。
4.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述非NAD依賴性乳酸氧化還原酶的活性增強是LldD的活性增強、L-乳酸氧化酶的活性增強、LldR的失活或活性降低、或它們中的一種以上的組合，能夠生產(chǎn)所述D-乳酸。
5.如權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述L-乳酸氧化酶是Lox及LctO 中的至少一方。
6.如權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述非NAD依賴性乳酸氧化還原酶的活性增強是通過在編碼LldD的基因的ORF中的33位上具有沉默突變的突變體IldD基因產(chǎn)生的。
7.如權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述突變體LldD是以序列號41的堿基序列表示的。
8.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，選自由Dld活性及Pfl活性組成的組中的至少一種活性失活或活性降低。
9.如權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述NAD依賴性乳酸脫氫酶的活性增強是NAD依賴性L-乳酸脫氫酶活性的增強，能夠生產(chǎn)所述L-乳酸。
10.如權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述非NAD依賴性乳酸氧化還原酶活性增強是Dld的活性增強，能夠生產(chǎn)所述L-乳酸。
11.如權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中所述L-乳酸脫氫酶來自雙歧桿菌屬菌。
12.如權(quán)利要求10所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述Dld具有Lactdeh memb結(jié)構(gòu)域。
13.如權(quán)利要求10所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述Dld來自選自由大腸桿菌、 發(fā)酵單胞菌及棒狀菌組成的組中的至少一種。
14.如權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，LdhA活性、LldD活性及Pfl活性中的至少一種失活或活性降低。
15.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，選自由Mdh及AspA活性組成的組中的至少一種活性失活或活性降低。
16.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，選自由蔗糖非PTS基因組及FruK 組成的組中的至少一種被增強。
17.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，F(xiàn)ruR活性失活或降低。
18.—種生產(chǎn)乳酸的方法，使用權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌生產(chǎn)乳酸。
19.一種生產(chǎn)D-乳酸的方法，使用權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌生產(chǎn)D-乳酸。
20. 一種生產(chǎn)L-乳酸的方法，使用權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌生產(chǎn)L-乳酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌和使用所述大腸桿菌生產(chǎn)乳酸的方法，所述大腸桿菌的1種以上的NAD依賴性乳酸脫氫酶及1種以上的非NAD依賴性乳酸氧化還原酶的各酶活性均被增強，從而分解D-乳酸及L-乳酸中的任一方而生產(chǎn)另一方。
文檔編號C12N15/09GK102159702SQ20098013617
公開日2011年8月17日 申請日期2009年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月16日
發(fā)明者和田光史, 安樂城正, 宮澤大輔, 望月大資, 森重敬, 高橋克幸, 高橋均 申請人:三井化學株式會社