專利名稱：蘋果酸－乳酸細菌SD－2a及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物，具體地說涉及一種蘋果酸-乳酸細菌。
本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明利用改良ATB或改良MRS培養(yǎng)基，其配方分別為改良ATB培養(yǎng)基ATB培養(yǎng)基+50mg/L放線菌酮+50mg/L萬古霉素；改良MRS培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基+10％番茄汁+50mg/L放線菌酮+50mg/L萬古霉素；本發(fā)明所述MRS培養(yǎng)基配方為酵母浸出物5g，牛肉膏10g，胰蛋白胨15g，乙酸5g，檸檬酸銨2g，硫酸錳0.05g，硫酸鎂0.2g，葡萄糖20g，Tween80 1ml，1MHCl或NaOH調(diào)pH至4.8。
本發(fā)明所述ATB培養(yǎng)基配方為蛋白胨10g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，鹽酸半胱氨酸0.5g，1MHCL或NaOH調(diào)pH至4.8。
從中國主要葡萄酒產(chǎn)區(qū)，山東煙臺、河北昌黎、四川攀枝花、陜西揚凌等地分離蘋果酸-乳酸細菌，具體分離方法為在上述分離培養(yǎng)基即ATB培養(yǎng)基+50mg/L放線菌酮+50mg/L萬古霉素或MRS培養(yǎng)基+10％番茄汁+50mg/L放線菌酮+50mg/L萬古霉素上，采用涂布分離法對蘋果酸-乳酸細菌進行分離，取樣量為0.1ml，培養(yǎng)溫度為28℃，在厭氧箱中充N2培養(yǎng)5-7天，充N2的量應(yīng)大于厭氧箱內(nèi)剩余體積的95％。
將上述蘋果酸-乳酸細菌進行pH、SO2、酒精的抗性實驗具體做法是，首先進行pH、SO2、酒精單因子實驗，然后進行復(fù)合實驗，篩選出對逆境抗性強的蘋果酸-乳酸細菌。本發(fā)明所述的各種抗性實驗方法是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員公知的方法。
蘋果酸降解實驗將篩選出的菌株按107cfu/ml的接種量接入添加有3g/L的L-蘋果酸ATB培養(yǎng)基中(pH4.8)，每隔24h進行紙層析監(jiān)測，觀察蘋果酸斑點的變化，以蘋果酸斑點消失時為蘋果酸分解完畢。
蘋果酸-乳酸酶活力測定蘋果酸-乳酸酶活力的定義為20℃條件下，在10ml的培養(yǎng)基中，蘋果酸-乳酸細菌24h降解蘋果酸的毫克數(shù)與每毫升中活細胞數(shù)的對數(shù)值(logcfu/ml)的比值。試驗證明，SD-2a的蘋果酸-乳酸酶活力是對照菌株31DH的1.32倍。
釀酒適應(yīng)性實驗通過對蘋果酸-乳酸發(fā)酵速率、蘋果酸降解率、揮發(fā)酸生成量、葡萄酒中有機酸、丹寧、總酚以及顏色發(fā)生的變化、酒體柔和指數(shù)發(fā)生的改變以及氨基酸代謝對葡萄酒質(zhì)量的影響等方面的綜合測定，結(jié)合品嘗分析，確定酒類酒球菌(Oenococcus oeni)SD-2a為釀酒特性優(yōu)良的菌株，該菌株已于2002年2月20日保藏于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號為CGMCCNO.0715。
二、本發(fā)明微生物的在干紅葡萄酒生產(chǎn)中的應(yīng)用1、葡萄除梗、破碎，其中除梗率＞70％，破碎率＜30％。
2、裝罐裝入發(fā)酵灌容積的80％，并精確計算。裝罐結(jié)束后，進行一次開放式倒罐(100％)，并利用倒罐的機會加入果膠酶及活性酵母，同時取樣分析原料的總糖、總酸。
3、二氧化硫使用二氧化硫含量大于6％的亞硫酸。在裝罐的同時加入，其流量應(yīng)與原料的流量相匹配，同時應(yīng)將二氧化硫直接加入到破碎后的原料中去(在原料輸送管的出口處)。二氧化硫的用量50mg/l(按將要釀出的葡萄酒的量計算)。
4、果膠酶用量30-50mg/l；使用方法見商品果膠酶的使用說明書；加入時間在裝罐結(jié)束后的開放式倒罐時進行。
5、活性酵母用量(200mg/l)；其使用方法見商品活性酵母的說明書；加入時間在裝罐結(jié)束后的開放式倒罐時進行。
6、浸漬發(fā)酵浸漬發(fā)酵溫度為20-28℃，每天開放式倒罐2次，每次倒罐量1/2倒罐時應(yīng)淋洗整個皮渣的表面。倒罐時測溫度、比重，繪制發(fā)酵曲線，并根據(jù)發(fā)酵曲線及時對發(fā)酵進程進行控制(見酒精發(fā)酵記錄表)。當(dāng)葡萄汁的比重降至1025左右時(一般需要4-6天)，進行出罐。
7、加糖在酒精發(fā)酵帽形成時一次性加入所需的糖量。轉(zhuǎn)化率計算原料含糖量17g/l＝1度酒精；加入的蔗糖浸漬發(fā)酵18g/l＝1度酒精；加入的蔗糖純汁發(fā)酵17.5g/l＝1度酒精。加糖時應(yīng)用葡萄汁完全溶解。加完糖時進行一次開放式倒罐(100％)。
8、分離出罐當(dāng)葡萄汁的比重降至1025時，分離自流酒于一干凈的發(fā)酵罐中，皮渣經(jīng)壓榨后壓榨酒入另一發(fā)酵罐中，繼續(xù)進行酒精發(fā)酵。
9、混合自流酒與壓榨酒根據(jù)原料的衛(wèi)生狀況在進行了6-24小時的輕微澄清后，可相互混合。如果壓渣酒的感官質(zhì)量較差，則應(yīng)單獨進行酒精發(fā)酵。
10、酒精發(fā)酵出罐后的葡萄汁，應(yīng)在18-20℃的溫度條件下，靜置發(fā)酵。但如果發(fā)酵速度太慢，有終止發(fā)酵的危險時，則可進行一次開放式倒罐(1/2)。當(dāng)比重降至1010時，應(yīng)取樣分析酒度和糖以便于最終酒度進行調(diào)整。當(dāng)葡萄酒中的糖＜2g/l(化學(xué)分析)時，酒精發(fā)酵結(jié)束。
11、蘋果酸-乳酸發(fā)酵酒精發(fā)酵結(jié)束后，用碳酸氫鉀將葡萄酒的PH值調(diào)至3.2(葡萄酒的PH值高于3.2則不用調(diào)整)。加入本發(fā)明的微生物，進行蘋果酸乳酸發(fā)酵。在整個蘋果酸乳酸發(fā)酵過程中將溫度控制在18-20℃同時將葡萄酒添滿、密閉。在此期間，應(yīng)用紙上層析法對蘋果酸乳酸發(fā)進行監(jiān)控，同時測定揮發(fā)酸的含量。如果發(fā)酵正常，則應(yīng)將所有的蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸。但如果發(fā)酵不正常，揮發(fā)酸的含量接近0.6g/l時，就應(yīng)終止發(fā)酵。
12、終止發(fā)酵在蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束后，或當(dāng)揮發(fā)酸接近0.6g/l時，則應(yīng)立即分離換罐。并在分離時加入50mg/l二氧化硫，添滿、密閉。天后應(yīng)進行一次分離換罐，也可在此時進行一次粗濾。添滿、密閉陳釀。
權(quán)利要求
1一種優(yōu)良蘋果酸-乳酸細菌，它是酒類酒球菌(Oenococcus oeni)SD-2aCGMCCNO 0715。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述菌種的培養(yǎng)方法，其特征在于固體培養(yǎng)28-30℃厭氧充氮氣培養(yǎng)；液體培養(yǎng)25-28℃，靜置。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述菌種的培養(yǎng)方法，其特征在于液體培養(yǎng)，待到對數(shù)期末離心收集菌體，加入保護劑，予凍，真空干燥，真空包裝，將其制成活性乳酸菌干粉。
全文摘要
本發(fā)明屬于葡萄酒制造技術(shù)領(lǐng)域。蘋果酸－乳酸發(fā)酵(MLF)是干紅葡萄酒生產(chǎn)必不可少的工序之一，但由于葡萄酒生產(chǎn)要求特殊的環(huán)境，大多數(shù)能夠進行蘋果酸－乳酸發(fā)酵的細菌很難在其中繁殖代謝，本發(fā)明篩選出對葡萄酒環(huán)境適應(yīng)性良好的酒類酒球菌(Oenococcus oeni)SD－2a。本發(fā)明可用于葡萄酒行業(yè)以及相關(guān)的食品行業(yè)。
文檔編號C12N1/20GK1428416SQ0212344
公開日2003年7月9日 申請日期2002年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月28日
發(fā)明者李華, 劉樹文, 王 華, 張春暉 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院