專利名稱：糖尿病患者患糖尿病腎病或血脂失調(diào)風(fēng)險(xiǎn)性的評(píng)估的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地講，本發(fā)明涉及與心血管疾病有關(guān)的一些遺傳標(biāo)志用于評(píng)估糖尿病患者患糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)性的應(yīng)用、其方法和試劑盒。
糖尿病腎病由多基因遺傳、環(huán)境及生活方式等因素導(dǎo)致。目前，中國至少有一千八百萬人患有糖尿病，預(yù)計(jì)這數(shù)字在2025年將增加到三千四百萬。隨著中國人生活方式急速的改變，那些帶有遺傳異質(zhì)性的個(gè)體將會(huì)更容易患上糖尿病及其并發(fā)癥。在中國人群中，糖尿病人以腎衰竭為主要死因。
僅以香港為例，據(jù)估計(jì)至少有60萬人患上糖尿病，占人口的十分之一。在已診斷有糖尿病的病人中，30-50％的病人會(huì)患上糖尿病腎病。如果治療不理想，其中的30％最終會(huì)發(fā)展為末期腎衰竭。對(duì)于一個(gè)無并發(fā)癥的糖尿病人，除去篩查及定期血液檢測(cè)的費(fèi)用外，平均的一年治療費(fèi)用由零(以生活方式改變，如減輕體重，增加運(yùn)動(dòng)，戒煙)至1000美元不等(后者包括藥物治療，以控制血糖和相關(guān)的心血管危險(xiǎn)因素)。相反，對(duì)于一個(gè)患有糖尿病腎病而發(fā)展至末期腎衰最后需要透析的病人，每年的治療費(fèi)用可高達(dá)20,000-40,000美元。
在現(xiàn)有技術(shù)中，用以預(yù)測(cè)患糖尿病腎病的風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)包括肥胖、高血壓、高血脂、患病年限、血糖控制不理想及家族史。而患上糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)包括肥胖、血糖控制不理想及家族史。這些指標(biāo)往往不能及時(shí)準(zhǔn)確地診斷糖尿病人患上糖尿病腎病及血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)。
對(duì)于糖尿病患者而言，如果能有效識(shí)別出將會(huì)患上糖尿病腎病的高危病人，并對(duì)這些高危病人如加以適當(dāng)監(jiān)察及治療，改變外在危險(xiǎn)因素，便可減少患上末期腎病如腎衰竭的機(jī)會(huì)。對(duì)于病人，這些信息將鼓勵(lì)病人改善可改變外在的危險(xiǎn)因素，如體重控制及藥物依從性，從而減少發(fā)展并發(fā)癥的機(jī)會(huì)。對(duì)于醫(yī)生，這些信息可令醫(yī)生提供針對(duì)性的目標(biāo)治療，以改善代謝，血壓控制及其他可改變的危險(xiǎn)因素以達(dá)到治療目標(biāo)，從而減少發(fā)展糖尿病腎病的機(jī)會(huì)。
因此，本發(fā)明的目的在于找出一組能用于評(píng)估糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)的遺傳標(biāo)志。
本發(fā)明的另一目的在于利用上述的遺傳標(biāo)志，用于評(píng)估糖尿病患者患糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)性。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種利用一組遺傳標(biāo)志評(píng)估糖尿病患者患糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)的方法。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種用于評(píng)估糖尿病患者患糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)以往被報(bào)道的與心血管疾病有關(guān)的遺傳標(biāo)志，特別是與脂類代謝相關(guān)的遺傳標(biāo)志可作為預(yù)測(cè)糖尿病腎病患病率的指標(biāo)，可用于預(yù)測(cè)糖尿病患者患糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)。具體地講，本發(fā)明包括如下幾個(gè)方面一方面，本發(fā)明提供了與心血管疾病有關(guān)的遺傳標(biāo)志用于評(píng)估糖尿病患者患糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)的應(yīng)用，其特征在于所述遺傳標(biāo)志用于評(píng)估糖尿病患者患糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)。
在上述應(yīng)用中，所述的與心血管疾病有關(guān)的遺傳標(biāo)志選自脂蛋白脂肪酶基因Ser447Term、對(duì)氧磷酶1基因Met55Leu、對(duì)氧磷酶2基因Ser311Cys、G蛋白β3亞單位基因C825T、載脂蛋白B基因Thr71Ile、β3-腎上腺素能受體基因Trp64Arg、肝脂肪酶基因C-480T、內(nèi)皮氧化氮合酶A-922G、基質(zhì)溶素3基因5A/6A、血管緊張素II1型受體基因A1166C和血管緊張素原基因Met235Thr。
在上述應(yīng)用中，所述的遺傳標(biāo)志用于評(píng)估糖尿病患者患糖尿病腎病的風(fēng)險(xiǎn)，其中所用的遺傳標(biāo)志優(yōu)選選自脂蛋白脂肪酶基因Ser447Term、對(duì)氧磷酶1基因Met55Leu、對(duì)氧磷酶2基因Ser311Cys、G蛋白β3亞單位基因C825T、載脂蛋白B基因Thr71Ile、β3-腎上腺素能受體基因Trp64Arg和肝脂肪酶基因C-480T。在該應(yīng)用中，還優(yōu)選包括利用所述的糖尿病患者的臨床及生化分析資料如肥胖指數(shù)，血壓和血脂的控制，從而可更加確切地預(yù)測(cè)糖尿病患者患糖尿病腎病的風(fēng)險(xiǎn)性。
在上述應(yīng)用中，所述的遺傳標(biāo)志用于評(píng)估糖尿病患者患糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)，其中所述的遺傳標(biāo)志優(yōu)選選自載脂蛋白B基因Thr71Ile、內(nèi)皮氧化氮合酶A-922G、基質(zhì)溶素3基因5A/6A、血管緊張素II1型受體基因A1166C、血管緊張素原基因Met235Thr和G蛋白β3單位基因C825T。
另一方面，本發(fā)明提供了一種利用與心血管疾病有關(guān)的遺傳標(biāo)志評(píng)估糖尿病患者患糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述的與心血管疾病有關(guān)的遺傳標(biāo)志選自脂蛋白脂肪酶基因Ser447Term、對(duì)氧磷酶1基因Met55Leu、對(duì)氧磷酶2基因Ser311Cys、G蛋白β3亞單位基因C825T、載脂蛋白B基因Thr71Ile、β3-腎上腺素能受體基因Trp64Arg、肝脂肪酶基因C-480T、內(nèi)皮氧化氮合酶A-922G、基質(zhì)溶素3基因5A/6A、血管緊張素II1型受體基因A1166C和血管緊張素原基因Met235Thr，該方法包括1) 針對(duì)所述的各遺傳標(biāo)志確定所述糖尿病患者的基因型；2) 根據(jù)步驟1)獲得的基因型確定糖尿病患者患糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的危險(xiǎn)系數(shù)；和3) 判斷所述糖尿病患者患糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)。
在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選進(jìn)一步包括結(jié)合所述的糖尿病患者的臨床及生化分析資料如肥胖指數(shù)、血壓和血脂的控制。
在本發(fā)明的方法中，針對(duì)所述的各遺傳標(biāo)志確定所述糖尿病患者的基因型的步驟可以采用在本領(lǐng)域已知的任何方法，例如，通過從生物樣本中提取核酸材料，采用下述的RFLP分析、寡聚體限制法(oligomerrestriction)、PCR-RFLP等方法中的一種或多種方法進(jìn)行，所述的生物樣本例如可以是血液、精液、毛發(fā)等樣品，但血液是優(yōu)選的。
通過限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析來反映特異性位點(diǎn)存在與否，在該分析方法中，特異性基因組限制性片段的大小變異通過Southern印跡和固定化基因組DNA與標(biāo)記探針雜交來檢測(cè)。RFLP分析已證明在直接檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)以及連鎖研究中是有用的。參見如，Kan和Dozy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，5631(1978)，以及Rubin和Kan，Lancet，1985-I，75，(1985)。也可參見Geever等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，5081(1981)和Wilson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，3628(1982)。這些文獻(xiàn)以引用方式引入本文，作為本專利申請(qǐng)公開內(nèi)容的一部分。
在稱為“寡聚體限制法(oligomer restriction)”的方法中，將溶液中合成的末端標(biāo)記的寡核苷酸探針退火到靶基因組DNA序列上，并加入限制性酶切割任何形成的雜合體。該法在Saiki等，Biotechnology，3，1008-1012(1985)中有更充分描述，其特異性取決于限制位點(diǎn)內(nèi)堿基對(duì)錯(cuò)配以取消或抑制切割的能力。此外，該技術(shù)的靈敏度可通過采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)程序得到提高，其中首先將樣品與特異性引物、聚合酶和核苷酸處理以擴(kuò)增用于隨后檢測(cè)的信號(hào)。此在Saiki等，Science，230，1350-1353(1985)和美國專利4,683,202中有更詳細(xì)描述。這些文獻(xiàn)以引用方式引入本文，作為本專利申請(qǐng)公開內(nèi)容的一部分。
用于檢測(cè)等位基因變異的第三種方法獨(dú)立于限制位點(diǎn)多態(tài)性，采用序列特異性的合成寡核苷酸探針。參見Conner等，Proc.Natal.Acad.Sci.USA，80，78(1983)。后種技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到產(chǎn)前診斷α1-抗胰蛋白酶缺乏(Kidd等，Nature，304，230(1983))和β-地中海貧血(Pirastu等，N.Eng.J.Med.，309，284(1983))。此外，該技術(shù)還已應(yīng)用到以Southern印跡研究HLA-DRβ的多態(tài)性(Angelini等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，4489-4493(1986))。此過程的基礎(chǔ)是在合適雜交條件下，至少19個(gè)堿基的短寡核苷酸探針(19-mer)將只退火到與之最佳匹配的那些序列上，單一堿基對(duì)的錯(cuò)配因?yàn)椴蛔阋苑€(wěn)定而防止雜交。等位基因變異間的區(qū)別是基于基因組DNA和寡核苷酸(19-mer)探針間所形成的雙螺旋的熱穩(wěn)定性。此處所述及的這些文獻(xiàn)以引用方式引入本文，作為本專利申請(qǐng)公開內(nèi)容的一部分。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解的是，可以根據(jù)本發(fā)明方法中所述的遺傳標(biāo)志可設(shè)計(jì)并制備出一系列的引物，只要保證擴(kuò)增所得的產(chǎn)物含有所述遺傳標(biāo)志中的遺傳多態(tài)位點(diǎn)或突變位點(diǎn)即可。所述的引物的長度為5-25個(gè)核苷酸，優(yōu)選10-15個(gè)核苷酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解的是，可以根據(jù)本發(fā)明方法中所述的遺傳標(biāo)志可設(shè)計(jì)并制備出一系列探針，這些探針可以被固定的固相載體如尼龍膜、硝酸纖維素膜等上。將探針固定到固相載體上的方法是不受任何限制的，可以采用本領(lǐng)域中所常用的任何一種方法將所述探針固定到固相載體如尼龍膜、硝酸纖維素膜上。所述探針包含在本發(fā)明方法中所用相應(yīng)遺傳標(biāo)志中的遺傳多態(tài)位點(diǎn)或突變位點(diǎn)并與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)。所述探針的長度優(yōu)選為15-25個(gè)核苷酸。
再一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，該試劑盒包括包含引物、DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸、反應(yīng)緩沖液的用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)液，所述引物是基于如下遺傳標(biāo)志而設(shè)計(jì)并制備的脂蛋白脂肪酶基因Ser447Term、對(duì)氧磷酶1基因Met55Leu、對(duì)氧磷酶2基因Ser311Cys、G蛋白β3亞單位基因C825T、載脂蛋白B基因Thr71Ile、β3-腎上腺素能受體基因Trp64Arg、肝脂肪酶基因C-480T、內(nèi)皮氧化氮合酶A-922G、基質(zhì)溶素3基因5A/6A、血管緊張素II1型受體基因A1166C或血管緊張素原基因Met235Thr，從而使擴(kuò)增所得的產(chǎn)物含有所述遺傳標(biāo)志中的遺傳多態(tài)位點(diǎn)或突變位點(diǎn)；基于所述遺傳標(biāo)志而設(shè)計(jì)并制備的特異于所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的探針；和指導(dǎo)如何進(jìn)行所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的說明書。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解的是，在本發(fā)明的試劑盒中，可以根據(jù)所述的遺傳標(biāo)志設(shè)計(jì)并制備出一系列的引物，只要保證擴(kuò)增所得的產(chǎn)物含有所述遺傳標(biāo)志中的遺傳多態(tài)位點(diǎn)或突變位點(diǎn)即可。所述的引物的長度為5-20個(gè)核苷酸，優(yōu)選10-15個(gè)核苷酸。所述的引物或探針優(yōu)選是經(jīng)生物素、放射性標(biāo)記的。所述的探針也可被固定在固相載體上的。將探針固定到固相載體上的方法是不受任何限制的，可以采用本領(lǐng)域中所常用的任何一種方法將所述探針固定到固相載體如尼龍膜上。所述探針包含在本發(fā)明方法中所用相應(yīng)遺傳標(biāo)志中的遺傳多態(tài)位點(diǎn)或突變位點(diǎn)并與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)。所述探針的長度優(yōu)選為15-25個(gè)核苷酸。
申請(qǐng)人相信所有糖尿病人將會(huì)受益于利用上述遺傳標(biāo)志的檢查，以評(píng)估其發(fā)展為糖尿病腎病的機(jī)會(huì)。這些遺傳信息將會(huì)促使高危病人改變生活方式，堅(jiān)持治療，并有利于醫(yī)生制定目標(biāo)治療，以改變外在的危險(xiǎn)因素。再者，發(fā)現(xiàn)這些遺傳標(biāo)志與糖尿病腎病之間的關(guān)系，將使我們加強(qiáng)認(rèn)識(shí)此疾病的發(fā)展并開辟新藥開發(fā)的機(jī)會(huì)。鑒于種族之間單核苷酸多態(tài)性有所差異，這組在中國人中檢驗(yàn)出的標(biāo)記尤其適用于中國人人群。本發(fā)明的方法相對(duì)于其他只以單一基因或生化或環(huán)境上的危險(xiǎn)因素作為風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)的方法，更為準(zhǔn)確及令醫(yī)護(hù)人員可作針對(duì)性治療。
在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，申請(qǐng)人認(rèn)為上述11個(gè)遺傳標(biāo)志可用于評(píng)估糖尿病患者患糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)性。同時(shí)，申請(qǐng)人也提供了一種用于評(píng)估糖尿病患者患糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)性的方法和試劑盒。
申請(qǐng)人通過下文的具體的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)的描述，應(yīng)當(dāng)理解的是以下實(shí)施例是舉例說明性的，不對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求的內(nèi)容為準(zhǔn)。
B.PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(其中50mM KCl，10mM Tris，pH8，15mMMgCl2，各50μM dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，采用1μM正向引物5’CCGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTCT-3’，和1μM反向引物5’CAGGGTGCTGTCCACACTGGACCCC-3’，Taq DNA聚合酶1單位及25ngDNA模板；反應(yīng)總體積為5微升。采用PE/AB GeneAmpPCR儀對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增。循環(huán)條件為起始變性溫度為90℃ 3分鐘，然后進(jìn)行94℃ 1分鐘、68℃ 1分鐘、72℃ 1分鐘的10個(gè)循環(huán)，接著進(jìn)行90℃ 30秒，68℃ 1分鐘，72℃ 30秒的30個(gè)循環(huán)，最后在72℃延長10分鐘。
C.等位基因的檢測(cè)及基因型的確定將3μl PCR產(chǎn)物用含有5單位Tth111I酶的限制性酶切緩沖液中稀釋至10μl，并在65℃過夜消化。然后PCR產(chǎn)物在2.5％瓊脂糖凝膠上電脈分離。Thr等位基因的存在使PCR產(chǎn)物(165bp)被消化為兩個(gè)片段，其一為141bp，其二為24bp。因此，對(duì)于Thr位點(diǎn)為純合的樣品顯示出各為141bp和24bp的兩條帶。對(duì)于Met位點(diǎn)為純合的樣品只顯示出一條165bp的帶。而所述位點(diǎn)為雜合態(tài)時(shí)，電脈結(jié)果則顯示出各為165bp、141bp和24bp的三條帶。
按照上述有關(guān)血管緊張素原基因Met235Thr這一遺傳標(biāo)志的描述，采用目前已知的任一適當(dāng)?shù)姆椒?，確定被測(cè)糖尿病患者的有關(guān)脂蛋白脂肪酶基因Ser447Term、對(duì)氧磷酶1基因Met55Leu、對(duì)氧磷酶2基因Ser311Cys、G蛋白β3亞單位基因C825T、載脂蛋白B基因Thr71Ile、β3-腎上腺素能受體基因Trp64Arg、肝脂肪酶基因C-480T、內(nèi)皮氧化氮合酶A-922G、基質(zhì)溶素3基因5A/6A、血管緊張素II1型受體基因A1166C這些遺傳標(biāo)志的基因型。計(jì)算各等位基因的頻率。
D.結(jié)果及分析對(duì)所獲得的基因型或等位基因頻率用方差檢驗(yàn)來比較。利用統(tǒng)計(jì)分析，兩組無及患有腎病的糖尿病人的遺傳標(biāo)記的基因型或等位基因頻率用方差檢驗(yàn)去計(jì)算危險(xiǎn)系數(shù)，然后利用邏輯回歸及結(jié)構(gòu)方程模式去檢察基因之間及基因與可改變危險(xiǎn)因素相互的關(guān)系，從而評(píng)估患上糖尿病腎病或血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)。所得結(jié)果列于如下表2至表5表2基因型與糖尿病腎病在211個(gè)有腎病及212個(gè)無腎病的II型糖尿病人的關(guān)系基因 基因多態(tài)性 無糖尿病腎病有糖尿病腎病(AA/Aa/aa) (AA/Aa/aa)蛋白脂肪酶Ser447Term 0.71/0.27/0.02 0.84/0.15/0.01*對(duì)氧磷酶1 Met55Leu0/0.08/0.92 0/0.03/0.97*G蛋白β3亞單位C825T 0.23/0.41/0.35 0.17/0.55/0.28*“A”代表前面的等位基因，“a”代表后面的等位基因。*P值小于0.05(用方差檢驗(yàn)法)表3等位基因頻率與糖尿病腎病在211個(gè)有腎病及212個(gè)無腎病的II型糖尿病人的關(guān)系基因 基因多態(tài)性無糖尿病腎病 有糖尿病腎病 等位基因“a”的危險(xiǎn)(A/a) (A/a)系數(shù)(95％可信區(qū)間)脂蛋白脂肪酶 Ser447Term0.85/0.15 0.92/0.080.51(0.33-0.79)*對(duì)氧磷酶1Met55Leu 0.04/0.96 0.02/0.982.53(1.04-6.16)*載脂蛋白BThr71Ile 0.83/0.17 0.87/0.130.71(0.48-1.04)**β3腎上腺素能受體Trp64Arg 0.85/0.15 0.90/0.100.68(0.45-1.03)**肝脂肪酶 C-480T0.65/0.35 0.59/0.411.3(0.98-1.71)**對(duì)氧磷酶2Ser311Cys 0.77/0.23 0.82/0.180.74(0.53-1.04)***P值小于0.05(用方差檢驗(yàn)法)
**P值小于0.1表4基因型頻率與糖尿病血脂失調(diào)在211個(gè)無腎病的II型糖尿病人的關(guān)系基因 基因多態(tài)性 無血脂失調(diào) 有血脂失調(diào)(AA/Aa/aa) (AA/Aa/aa)載脂蛋白B Thr711Ile0.78/0.20/0.02 0.62/0.34/0.04*內(nèi)皮酸化窒素合酶 A-922G 0.86/0.12/0.02 0.76/0.24/0*基質(zhì)金屬蛋白酶3 啟動(dòng)5A/6A0.04/0.25/0.71 0/0.15/0.85*“A”代表前面的等位基因，“a”代表后面的等位基因。
*P值小于0.05(用方差檢驗(yàn)法)表5基因型頻率與糖尿病血脂失調(diào)在212個(gè)有腎病的二型糖尿病人的關(guān)系基因 基因多態(tài)性 無血脂失調(diào) 有血脂失調(diào)(AA/Aa/aa) (AA/Aa/aa)血管緊張素2受體一型 A1166C 0.73/0.27/00.93/0.07/0*血管緊張素原 Met235Thr0.09/0.39/0.52 0.02/0.23/0.75*G蛋白β3亞單位C825T0/0.67/0.330.20/0.53/0.27*“A”代表前面的等位基因，“a”代表后面的等位基因。
*P值小于0.05(用方差檢驗(yàn)法)
表6在423個(gè)無(＝0)或有(＝1)腎病的II型糖尿病患者中，以邏輯回歸法檢驗(yàn)基因與可改變危險(xiǎn)因素關(guān)系來預(yù)測(cè)糖尿病腎病的危險(xiǎn)系數(shù)

所檢查的基因型包括脂蛋白脂肪酶Ser447Term，對(duì)氨磷酶1Met55Leu，G蛋白β3亞單位，載脂蛋白B Thr71Ile，β3腎上腺素能受體Trp64Ang，肝脂肪酶C-480T，對(duì)氧磷酶2Ser311Cys，及這些基因與高血壓、高血脂及肥胖之關(guān)系。其中無或有高血壓、高血脂及肥胖以分別0和1表示。
F.結(jié)論對(duì)于表6中所列的各基因型，＞1的危險(xiǎn)系數(shù)表示與基因型0相比，具有基因型1的糖尿病患者患上糖尿病腎病的危險(xiǎn)增大，而＜1的危險(xiǎn)系數(shù)則表示與基因型0相比，具有基因型1的糖尿病患者患上糖尿病腎病的危險(xiǎn)減少。
以脂蛋白脂肪酶基因Ser447Term為例，如果患者的基因型為Ser/Term，則將該基因型設(shè)定為1，將基因型Ser/Ser設(shè)定為0。具有基因型1的糖尿病患者與具有基因型0的糖尿病患者相比患上糖尿病腎病的可能性要小些。再以對(duì)氧磷酶1為例，對(duì)于具有Met/Leu基因型的患者而言，其發(fā)展為糖尿病腎病患者的風(fēng)險(xiǎn)要比那些具有Met/Met基因型的患者大。
針對(duì)表6中所列出的各因素，可以按下列方程式計(jì)算出某一糖尿病患者個(gè)體患上糖尿病腎病的總的風(fēng)險(xiǎn)Ln總風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)＝-1.10×脂蛋白脂肪酶Ser447Term-0.53×載脂蛋白B基因Thr71Ile+1.52×對(duì)氧磷酶1基因Met55Leu×血脂失調(diào)+1.05×G蛋白β3亞單位C825T多態(tài)性1×高血壓+2.60×G蛋白β3亞單位C825T多態(tài)性2×高血壓公式中名獨(dú)立的變量(基因型或風(fēng)險(xiǎn)因素)均根據(jù)表6所示，相應(yīng)地以0和1代替，則個(gè)體的Ln系數(shù)將在0和1之間。當(dāng)該值＞0.5時(shí)，表明此個(gè)體患糖尿病腎病的風(fēng)險(xiǎn)較大，而當(dāng)該值＜0.5時(shí)，表明此個(gè)體患糖尿病腎病的風(fēng)險(xiǎn)較小。
綜上所述，可以得出結(jié)論與心血管疾病有關(guān)的遺傳標(biāo)志例如那些選自脂蛋白脂肪酶基因Ser447Term、對(duì)氧磷酶1基因Met55Leu、對(duì)氧磷酶2基因Ser311Cys、G蛋白β3亞單位基因C825T、載脂蛋白B基因Thr71Ile、β3-腎上腺素能受體基因Trp64Arg、肝脂肪酶基因C-480T、內(nèi)皮氧化氮合酶A-922G、基質(zhì)溶素3基因5A/6A、血管緊張素II1型受體基因A1166C和血管緊張素原基因Met235Thr的遺傳標(biāo)志可作為評(píng)估糖尿病患者患糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)。上述表2至表6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示心血管(大血管)疾病和糖尿病腎病(微血管疾病)有著可能共同的致病途徑。
權(quán)利要求
1.與心血管疾病有關(guān)的遺傳標(biāo)志的應(yīng)用，其特征在于所述遺傳標(biāo)志用于評(píng)估糖尿病患者患糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)。
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的與心血管疾病有關(guān)的遺傳標(biāo)志選自脂蛋白脂肪酶基因Ser447Term、對(duì)氧磷酶1基因Met55Leu、對(duì)氧磷酶2基因Ser311Cys、G蛋白β3亞單位基因C825T、載脂蛋白B基因Thr71Ile、β3-腎上腺素能受體基因Trp64Arg、肝脂肪酶基因C-480T、內(nèi)皮氧化氮合酶A-922G、基質(zhì)溶素3基因5A/6A、血管緊張素II1型受體基因A1166C和血管緊張素原基因Met235Thr。
3.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中所述的遺傳標(biāo)志選自脂蛋白脂肪酶基因Ser447Term、對(duì)氧磷酶1基因Met55Leu、對(duì)氧磷酶2基因Ser311Cys、G蛋白β3亞單位基因C825T、載脂蛋白B基因Thr71Ile、β3-腎上腺素能受體基因Trp64Arg和肝脂肪酶基因C-480T，所述的遺傳標(biāo)志用于評(píng)估糖尿病患者患糖尿病腎病的風(fēng)險(xiǎn)。
4.權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中還包括利用所述的糖尿病患者的臨床及生化分析資料。
5.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中所述的遺傳標(biāo)志選自載脂蛋白B基因Thr71Ile、內(nèi)皮氧化氮合酶A-922G、基質(zhì)溶素3基因5A/6A、血管緊張素II1型受體基因A1 166C、血管緊張素原基因Met235Thr和G蛋白β3單位基因C825T，所述的遺傳標(biāo)志用于評(píng)估糖尿病患者患糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)。
6.一種利用與心血管疾病有關(guān)的遺傳標(biāo)志評(píng)估糖尿病患者患糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述的與心血管疾病有關(guān)的遺傳標(biāo)志選自脂蛋白脂肪酶基因Ser447Term、對(duì)氧磷酶1基因Met55Leu、對(duì)氧磷酶2基因Ser311Cys、G蛋白β3亞單位基因C825T、載脂蛋白B基因Thr71Ile、β3-腎上腺素能受體基因Trp64Arg、肝脂肪酶基因C-480T、內(nèi)皮氧化氮合酶A-922G、基質(zhì)溶素3基因5A/6A、血管緊張素II1型受體基因A1166C和血管緊張素原基因Met235Thr，該方法包括1)針對(duì)所述的各遺傳標(biāo)志確定所述糖尿病患者的基因型；2)根據(jù)步驟1)獲得的基因型確定糖尿病患者患糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的危險(xiǎn)系數(shù)；和3)判斷所述糖尿病患者患糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)。
7.權(quán)利要求6的方法，進(jìn)一步包括結(jié)合所述的糖尿病患者的臨床及生化分析資料。
8.一種試劑盒，其中包括包含引物、DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸、反應(yīng)緩沖液的用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)液，所述引物是基于如下遺傳標(biāo)志而設(shè)計(jì)并制備的脂蛋白脂肪酶基因Ser447Term、對(duì)氧磷酶1基因Met55Leu、對(duì)氧磷酶2基因Ser311Cys、G蛋白β3亞單位基因C825T、載脂蛋白B基因Thr71Ile、β3-腎上腺素能受體基因Trp64Arg、肝脂肪酶基因C-480T、內(nèi)皮氧化氮合酶A-922G、基質(zhì)溶素3基因5A/6A、血管緊張素II1型受體基因A1166C或血管緊張素原基因Met235Thr，從而使擴(kuò)增所得的產(chǎn)物含有所述遺傳標(biāo)志中的遺傳多態(tài)位點(diǎn)或突變位點(diǎn)；基于所述遺傳標(biāo)志而設(shè)計(jì)并制備的特異于所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的探針；和指導(dǎo)如何進(jìn)行所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地講，本發(fā)明涉及利用與心血管疾病有關(guān)的一些遺傳標(biāo)志評(píng)估糖尿病患者患糖尿病腎病和/或糖尿病血脂失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)性。本發(fā)明該提供了評(píng)估所述風(fēng)險(xiǎn)性的方法和試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1465709SQ0212259
公開日2004年1月7日 申請(qǐng)日期2002年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月14日
發(fā)明者陳重娥, 克萊夫·斯圖爾特·科克拉姆, 伍楚賢, 斯圖爾特 科克拉姆 申請(qǐng)人:香港中文大學(xué)