一種肝素酶Ⅰ缺失突變體編碼基因及其蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種肝素酶Ⅰ缺失突變體蛋白及其編碼基因。本發(fā)明提供的肝素酶Ⅰ缺失突變體蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示,本發(fā)明的蛋白的編碼基因也在保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明首次通過PCR技術(shù)設(shè)計(jì)引物使得肝素酶Ⅰ缺失N端氨基酸序列，獲得分子量更小，比活性較高的肝素酶Ⅰ，比活可達(dá)106IU/mg，并通過親和層析純化，本發(fā)明可廣泛用于生產(chǎn)肝素酶Ⅰ缺失突變體。
【專利說明】一種肝素酶I缺失突變體編碼基因及其蛋白【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酶的基因工程改造，特別涉及到肝素酶I缺失突變體編碼基因及其蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002]肝素酶是一類作用于肝素或者硫酸乙酰肝素的多糖裂解酶，在許多微生物中發(fā)現(xiàn)，包括棒狀桿菌Corynebacterium sp,枯草芽抱桿菌Bacillus subtilis ,環(huán)狀芽抱桿菌Bacillus circulans,糞便擬桿菌和肝素黃桿菌等，但肝素黃桿菌是商業(yè)化肝素酶的唯一來源。
[0003]肝素酶的研究頗具價(jià)值:肝素酶是一種多糖裂解酶，肝素酶及其底物多糖肝素之間相互作用的研究有助于解釋多糖裂解酶的作用機(jī)制；肝素酶可以用于解析肝素等復(fù)雜粘多糖的結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能；此外，肝素酶還可以用于解析人體內(nèi)的凝血和抗凝血機(jī)制、制備低分子的抗凝血藥物低分子肝素、去除臨床血液殘存肝素、防止手術(shù)后出血、處理PCR反應(yīng)iu的血液制品。
[0004]早在1993年肝素酶I的基因就已經(jīng)被克隆并在大腸桿菌中表達(dá)出來，但其活性較低(Applied Biological Sciences.1993 Vol.90, pp.3660-3664.)自此以后肝素酶 I的克隆就成為研究熱點(diǎn)，1996年，Ram等利用PET系統(tǒng)優(yōu)化了肝素酶I的重組發(fā)酵，但是仍需要復(fù)性后才能形成活性蛋白(Biochem.J.1996 vol.315:589-597)，2004年國內(nèi)清華大學(xué)(專利號(hào)CN 1312183C)利用基因克隆技術(shù)，將切除信號(hào)肽的肝素酶基因克隆至原核表達(dá)載體PMAL-C2X，表達(dá)MBP肝素酶I融合蛋白。活性可達(dá)270IU/L發(fā)酵液，同時(shí)可以使得肝素酶I表達(dá)量90%為可溶，最終利用MBP純化可以實(shí)現(xiàn)95%以上的純度。
[0005]本實(shí)驗(yàn)室對(duì)肝 素酶I的基因進(jìn)行缺失突變，切除N端的一段氨基酸序列，將其克隆至表達(dá)載體PMAL-C2X，得到活性較高的肝素酶I突變體蛋白HePA-1，且其帶有MBP標(biāo)簽方便純化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是為了提供一種缺失突變的肝素酶I基因以及表達(dá)蛋白。
[0007]本發(fā)明所提供的肝素酶I蛋白，名稱為!fePA-l，其肝素酶H印A-1是具有序列表中SEQ IDNo: 2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
[0008]序列表中的SEQ ID No: 2由349個(gè)氨基酸殘基組成。
[0009]肝素酶I缺失突變體蛋白編碼基因，名稱為!fepA-l，其具有下列核苷酸序列之
1)序列表中SEQID N0.1的DNA序列:
2)編碼序列表中SEQID N0.2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；
序列I中的DNA序列由1047個(gè)堿基組成，該基因的開放閱讀框架為自5’端第 I到第1047位堿基。[0010]擴(kuò)增該蛋白編碼基因中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0011]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種表達(dá)缺失突變肝素酶I蛋白的方法。
[0012]本發(fā)明所提供的表達(dá)缺失突變肝素酶I蛋白的方法，是將含有上述肝素酶I蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入表達(dá)宿主菌，表達(dá)缺失突變肝素酶I蛋白，且其帶有MBP標(biāo)簽。
[0013]pMal-hepA-Ι是通過BamHI和HindIIIl將肝素酶I編碼基因全序列插入pMal-C2x，pMalc2x表達(dá)載體中得到的肝素酶I蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體。其中，所述肝素酶I編碼基因全序列是以構(gòu)建好的PMAL-C2X-!fepA為模板，以5’ GTGCGGATCCCAGGCCGACAGTGCTAAG 3 和 5’ GACTAAGCTTTCTGGCAGTTTCGCTGTAC 3 為引物，按照常規(guī)PCR方法得到的。所述宿主菌可為大腸桿菌，所述大腸桿菌可為以下菌株:BL21。
[0014]缺失突變體肝素酶I蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件可為0.7mM IPTG.16攝氏度誘導(dǎo)20小時(shí):所采用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L。
[0015]本發(fā)明通過PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)引物使得肝素酶I缺失了的N端一段氨基酸序列，構(gòu)建了肝素酶I缺失突變體表達(dá)載體，因其帶有MBP標(biāo)簽，從而能通過amylose樹脂實(shí)現(xiàn)一步親和分離得到了分子量更小，比活更高的的肝素酶I缺失突變體蛋白；大腸桿菌E coliBL21 (DE3) (pMAL-hepA-Ι)在37攝氏度培養(yǎng)3小時(shí)后加入0.7mM IPTG，誘導(dǎo)溫度16攝氏度20h，通過缺失突變方法為肝素酶I的活性與結(jié)構(gòu)研究提供了現(xiàn)實(shí)基礎(chǔ)，本發(fā)明為將在低分子肝素鈉的生產(chǎn)上發(fā)揮重要作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為H印A-1的PCR電泳圖譜。
[0017]圖2為陽性轉(zhuǎn)化子的雙酶切鑒定示意圖。
[0018]圖3為HEPA-1蛋白通過直鏈淀粉樹脂親和分離的SDS-PAGE電泳圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整的說明:
實(shí)施例1、缺失肝素酶I蛋白H印A-1的表達(dá)
1、表達(dá)載體pMal- HepA-1的構(gòu)建
模板PMal- HepA的構(gòu)建參考專利，專利號(hào)為CN 1312183C。
[0020]表達(dá)載體pMal- HepA-1的構(gòu)建具體過程如下:以已經(jīng)構(gòu)建好的PMAL- HepA為模板，所用的上下游引物分別為5’GTGCGGATCCCAGGCCGACAGTGCTAAG 3 (帶下劃線的堿基為BamHI 的酶切位點(diǎn))，5’GACTAAGCTTTCTGGCAGTTTCGCTGTAC 3 (帶下劃線的堿基為 HindIII 酶切位點(diǎn))，分別引入BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:50ng模板DNA，200nmol每種引物，5XPS buffer擴(kuò)增緩沖液，2.5uMol/L每種dNTP，I單位高保Pfu酶；擴(kuò)增程序?yàn)?95攝氏度變性5分鐘，50-60攝氏度引物退火15秒，72攝氏度引物延伸120秒，30個(gè)循環(huán)后，72攝氏度延伸5分鐘結(jié)束反應(yīng)。該P(yáng)CR.結(jié)果如圖1所示，表明擴(kuò)增得到1.1kb的肝素酶I基因片段。圖1中，2-7分別為引物退火溫度為51、53、55、57、59、61°C擴(kuò)增結(jié)果，8為分子量marker DL10, 000，目標(biāo)片斷處為1.lkb。
[0021]將H印A-1和pMal-c2x載體和PCR產(chǎn)物分別用BamHI和HindIII雙酶切，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化BL21，提質(zhì)粒通過BamHI和HindIII雙酶切驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果如圖2示，同時(shí)將結(jié)果送去測(cè)序,其中序列完全正確的一株命名為重組大腸桿菌BL21 (pMal-hepA-Ι)。
[0022]2、缺失突變肝素酶I蛋白H印A-1的表達(dá)
重組大腸桿菌BL21 (pMal- HepA-1)在LB培養(yǎng)基(含100ng/ml Amp) 37°C培養(yǎng)3小時(shí)，待0D600=0.7-0.8時(shí)加入0.7mM IPTG在15°C進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)20小時(shí)后菌液在8000rpm下離心10min，棄濾液后重懸在40ml 20mmol Tris.HCl中超聲破碎(超聲功率為150W，超聲5s,間歇時(shí)間5s，超聲200個(gè)循環(huán))，18000rpm.30min離心。
[0023]實(shí)施例2、通過直鏈淀粉柱純化肝素酶I蛋白H印A-1及肝素酶I H印A-1活性測(cè)定
1.肝素酶I蛋白H印A-1及肝素酶I H印A-1的純化
本發(fā)明中利用的融合伙伴(fusion partner)麥芽糖結(jié)合蛋白MBP能夠與直鏈淀粉親和吸附實(shí)現(xiàn)一步分離。具體的親和分離步驟如下:將0.7mmol IPTG誘導(dǎo)表達(dá)20小時(shí)的菌體誘導(dǎo)后菌液在8000rpm下離心10min,棄濾液后重懸在40ml 2OmmoI Tris.HCl中超聲破碎(超聲功率為150W，超聲5s，間歇時(shí)間5s，超聲200個(gè)循環(huán))，18000rpm.30min離心。離心后上清液體以0.5ml/min通過20ml預(yù)平衡的直鏈淀粉親和分離柱,通過IOmM 0.5ml/min麥芽糖梯度洗脫并收集。
[0024]用IOmM麥芽糖在10個(gè)柱體積下能夠?qū)⒛繕?biāo)蛋白洗脫。結(jié)果如圖3所示，表明經(jīng)過直鏈淀粉樹脂一步純化后目標(biāo)蛋白可占95%以上。圖3，為不同濃度的麥芽糖濃度梯度洗脫SDS-PAGE電泳圖，I為分子量marker，2，3為可溶目標(biāo)蛋白MBP- HepA-1-1,分子量為80KD。
[0025]2.肝素酶HePA-1活性測(cè)定
肝素酶活性測(cè)定:在5 ml石英比色皿中加入在35 1:預(yù)熱過的2.5 ml肝素濃度為Img/ml 的 Tris-HCl (50 mM,含 CaCl2 10 mM, ρΗ7.0)緩沖液，移取 20 μL 酶液，搖勻后在 232 nm 測(cè)定吸光值，讀取每分鐘的變化量。以雙鍵的摩爾消光系數(shù)3500計(jì)算其形成量，換算為酶液中酶的國際單位。蛋白濃度測(cè)定采用Bradford法。
【權(quán)利要求】
1.一種肝素酶I缺失突變體蛋白，是由序列表中序列SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因的核苷酸序列式序列表中SEQID NO:1所述的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2所 述基因的工程菌。
【文檔編號(hào)】C12N9/88GK103992994SQ201410241959
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月4日
【發(fā)明者】杜宏銀, 馬小來, 李鋰 申請(qǐng)人:深圳市海普瑞藥業(yè)股份有限公司