專(zhuān)利名稱(chēng)：用于篩選蛋白酶生產(chǎn)菌的培養(yǎng)基的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物領(lǐng)域，具體涉及一種用于篩選蛋白酶生產(chǎn)菌的培養(yǎng)基 的制備方法。
背景技術(shù)：
蛋白酶是催化分解蛋白質(zhì)肽鍵的一群酶的總稱(chēng)。它作用于蛋白質(zhì)，將其 分解為蛋白胨、多肽及游離氨基酸，廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品、制藥、制革等行業(yè)。
由于動(dòng)植物資源有限，工業(yè)上生產(chǎn)蛋白酶制劑主要利用枯草桿菌、棲土曲霉等微 生物發(fā)酵制備。出于對(duì)于生產(chǎn)菌復(fù)壯的需要，以及隨著各種行業(yè)對(duì)于蛋白酶的需求越來(lái)越 多樣化，因此需要對(duì)蛋白酶生產(chǎn)菌加以篩選。 Raja Noor Zaliha Raj a Abd Rahman等(J Ind Mi crob i o 1 Biotechno1(2007)34 :509-517)使用脫脂奶粉瓊脂糖培養(yǎng)基作為篩選蛋白酶生產(chǎn)菌的培 養(yǎng)基。由于脫脂奶粉在溶解后形成不透明的分散體系，該培養(yǎng)基將脫脂奶粉作為一種氮源， 微生物分泌蛋白酶后會(huì)將脫脂奶粉水解，在培養(yǎng)基上能形成一個(gè)明顯的透明圈，透明圈的 大小就顯示了微生物的產(chǎn)酶能力。 但由于脫脂奶粉的加入，帶來(lái)了一些滅菌問(wèn)題按傳統(tǒng)的滅菌方法，難以掌握控制 滅菌溫度和滅菌時(shí)間，滅菌溫度稍高或滅菌時(shí)間稍長(zhǎng)，會(huì)造成脫脂奶粉沉淀。滅菌溫度稍低 或滅菌時(shí)間稍短，會(huì)造成滅菌不徹底。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于篩選蛋白酶生產(chǎn)菌的培養(yǎng)基的制備方 法，解決傳統(tǒng)的滅菌方法所帶來(lái)的脫脂奶粉沉淀或滅菌不徹底的問(wèn)題。 本發(fā)明是這樣來(lái)實(shí)現(xiàn)的是將一種在水溶液中形成不透明分散體系的氮源以及其 他營(yíng)養(yǎng)成分(能溶于水但不形成不透明分散體系)采用分別滅菌、無(wú)菌混合的方法加以制 備；所述的氮源具有以下特點(diǎn)在溶解后形成穩(wěn)定的乳狀分散體系，不透明，可在瓊脂的作 用下，溶液冷卻后能形成不透明乳狀固定培養(yǎng)基；在蛋白酶的作用下會(huì)水解成透明狀，可以 用來(lái)鑒定細(xì)菌的產(chǎn)酶情況。 —般地本發(fā)明所述在水溶液中形成不透明分散體系的氮源為脫脂奶粉，采用高壓 蒸汽滅菌法單獨(dú)滅菌；其他營(yíng)養(yǎng)成分的混合液中加入瓊脂進(jìn)行滅菌，瓊脂加入量為12-20 克/升，而脫脂奶粉的水溶液中不加入瓊脂，其他營(yíng)養(yǎng)成分中的不可知因素不會(huì)與脫脂奶 粉發(fā)生相互作用，導(dǎo)致發(fā)生沉淀、變色的不利情況，影響培養(yǎng)基的鑒定效果。
所述的滅菌溫度為(115°C _126°C )，優(yōu)選12rC滅菌，時(shí)間為15-20分鐘。無(wú)菌混 合時(shí)溫度在5(TC _701:之間。分開(kāi)滅菌、無(wú)菌混合后，在無(wú)菌條件下倒平板、冷卻凝固。
本發(fā)明方法克服了現(xiàn)有技術(shù)滅菌過(guò)程中脫脂奶粉沉淀或滅菌不徹底弊端，具有以 下特點(diǎn) 第一 在高壓蒸汽滅菌過(guò)程中(高溫下)，其他營(yíng)養(yǎng)成分中的不可知因素不會(huì)與脫 脂奶粉接觸，不會(huì)發(fā)生相互作用，導(dǎo)致發(fā)生沉淀、變色等不利情況，影響培養(yǎng)基的鑒定效果。
第二 滅菌結(jié)束后，等培養(yǎng)基冷卻后，在無(wú)菌環(huán)境中將上述兩個(gè)部分進(jìn)行混合。 本發(fā)明所使用的混合溫度在50°C -701:之間，在此溫度下混合，瓊脂糖溶液尚未 凝固，而且其他營(yíng)養(yǎng)成分中的不可知因素不會(huì)與脫脂奶粉發(fā)生相互作用，導(dǎo)致發(fā)生沉淀、變 色等不利情況，影響培養(yǎng)基的鑒定效果。

具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但其并不限制本發(fā)明
的保護(hù)范圍。
實(shí)施例 培養(yǎng)基(g/L)配方:蛋白胨，4. 0 ;酵母粉，3. 0 ;脫脂奶粉，12. 0 ;瓊脂，18. 0 ;pH =
7. 5， 制備過(guò)程取蛋白胨，2g;酵母粉，1.25g;瓊脂，9.0g加入250ml自來(lái)水，調(diào)pH至 7.5，置于1L三角瓶中。另取脫脂奶粉6.0g，加250ml自來(lái)水，調(diào)節(jié)pH至7. 5，置于1L三角 瓶中。將兩個(gè)三角瓶置于滅菌鍋中進(jìn)行滅菌，滅菌條件12rC，20分鐘。滅菌結(jié)束后，將兩 個(gè)三角瓶置于50 °C烘箱3小時(shí)左右，在超凈工作臺(tái)中近火焰無(wú)菌條件中，將上述兩瓶溶液 進(jìn)行混合后立即倒平板，在室溫、無(wú)菌條件下靜置、冷卻、凝固后即可得到脫脂奶粉分布均 勻，且滅菌徹底的篩選蛋白酶生產(chǎn)菌的培養(yǎng)基平板。將平板置于37t:培養(yǎng)箱中，48小時(shí)內(nèi) 不會(huì)出現(xiàn)菌落。
對(duì)比實(shí)施例(一) 培養(yǎng)基(g/L)配方:蛋白胨，4. 0 ;酵母粉，3. 0 ;脫脂奶粉，12. 0 ;瓊脂，18. 0 ;pH =
7. 5， 制備過(guò)程取蛋白胨，2g ;酵母粉，1. 25g ;瓊脂，9. 0g，脫脂奶粉6. 0g加入500ml自 來(lái)水，調(diào)pH至7.5，置于1L三角瓶中。將三角瓶置于滅菌鍋中進(jìn)行滅菌，滅菌條件115t:， 15分鐘。 滅菌結(jié)束后，將三角瓶置于5(TC烘箱3小時(shí)左右，在超凈工作臺(tái)中近火焰無(wú)菌條
件中，將上述溶液倒平板在室溫、無(wú)菌條件下靜置、冷卻、凝固后可得到脫脂奶粉分布均勻
的篩選蛋白酶生產(chǎn)菌的培養(yǎng)基平板。將平板置于37t:培養(yǎng)箱中，24-48小時(shí)內(nèi)會(huì)出現(xiàn)菌落，
表明滅菌不徹底。
對(duì)比實(shí)施例(二) 培養(yǎng)基(g/L)配方:蛋白胨，4. 0 ;酵母粉，3. 0 ;脫脂奶粉，12. 0 ;瓊脂，18. 0 ;pH = 7. 5， 制備過(guò)程取蛋白胨，2g ;酵母粉，1. 25g ;瓊脂，9. 0g，脫脂奶粉6. 0g加入500ml自 來(lái)水，調(diào)pH至7.5，置于1L三角瓶中。將三角瓶置于滅菌鍋中進(jìn)行滅菌，滅菌條件126t:， 15-20分鐘。 滅菌結(jié)束后，溶液中出現(xiàn)淡黃色絮狀沉淀，脫脂奶粉未能在培養(yǎng)基中均勻分散。
權(quán)利要求
一種用于篩選蛋白酶生產(chǎn)菌的培養(yǎng)基的制備方法，其特征是將一種在水溶液中形成分散體系、不透明的氮源以及其他能在水溶液中溶解的營(yíng)養(yǎng)成分采用分開(kāi)滅菌、無(wú)菌混合的方法加以制備；所述的氮源具有以下特點(diǎn)在溶解后形成穩(wěn)定的乳狀分散體系，不透明，可在瓊脂的作用下，溶液形成不透明乳狀固定培養(yǎng)基；在蛋白酶的作用下會(huì)水解成透明狀，可以用來(lái)鑒定細(xì)菌的產(chǎn)酶情況。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于所述氮源為脫脂奶粉。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于所述其他能在水溶液中溶解的營(yíng)養(yǎng)成分 能溶于水，但不會(huì)如所述氮源(脫脂奶粉)那樣在水溶液中形成不透明的分散體系。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于采用高壓蒸汽滅菌法滅菌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述制備方法，其特征在于滅菌過(guò)程中，其他營(yíng)養(yǎng)成分與脫脂奶 粉分開(kāi)滅菌，其他營(yíng)養(yǎng)成分中的不可知因素不會(huì)與脫脂奶粉發(fā)生相互作用，導(dǎo)致發(fā)生沉淀、 變色的不利情況，影響培養(yǎng)基的鑒定效果。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述制備方法，其特征在于其他營(yíng)養(yǎng)成分的混合液中加入瓊脂， 加入量為15-20克/升，而脫脂奶粉的水溶液中不加入瓊脂。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述制備方法，其特征在于滅菌溫度為115°C _1261:，滅菌時(shí)間 為15-20分鐘。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于無(wú)菌混合時(shí)溫度在50°C _701:之間。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于分開(kāi)滅菌、無(wú)菌混合后，在無(wú)菌條件下倒 平板、冷卻凝固。
全文摘要
本發(fā)明屬微生物領(lǐng)域，具體涉及一種用于篩選蛋白酶生產(chǎn)菌的培養(yǎng)基的制備方法。本發(fā)明是這樣來(lái)實(shí)現(xiàn)的是將一種在水溶液中形成分散體系、不透明的氮源以及其他能在水溶液中溶解的營(yíng)養(yǎng)成分采用分別滅菌、無(wú)菌混合的方法加以制備；本發(fā)明所使用的混合溫度在50℃-70℃之間，在此溫度下混合，瓊脂糖溶液尚未凝固，而且其他營(yíng)養(yǎng)成分中的不可知因素不會(huì)與脫脂奶粉發(fā)生相互作用，不會(huì)導(dǎo)致發(fā)生沉淀、變色等不利情況，影響培養(yǎng)基的鑒定效果。
文檔編號(hào)C12R1/00GK101787349SQ20091002847
公開(kāi)日2010年7月28日 申請(qǐng)日期2009年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月22日
發(fā)明者李冰峰 申請(qǐng)人:南京化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院