專利名稱：異檸檬酸測定試劑(盒)及異檸檬酸濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種異檸檬酸測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定異檸檬酸濃度
的方法，屬于食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
異擰檬酸isocitric acid是擰檬酸的異構(gòu)體，雖然量少，但廣泛存在于生物界。 在落地生根屬(Bryophyllum)等多汁植物的葉、或懸鉤子類中特別多，生物能夠利用的是D 型。是三羧酸循環(huán)中的一個成分。檸檬酸在鳥頭酸酶的作用下可逆地生成異檸檬酸和順鳥 頭酸。在異檸檬酸脫氫酶(EC 1. 1. 1.41 ;EC 1. 1. 1.42)的作用下變成a-酮戊二酸，在異 檸檬酸裂合酶(isocitrate lyase, EC4. 1. 3. 1)的作用下變成琥珀酸與乙醛酸。
中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)，GB T16771-1997，規(guī)定了橙、柑、桔汁及其飲料中D_異 檸檬酸的測定方法_紫外分光光度法。該方法適用于判定橙、柑、桔濃縮汁和果汁，以及果 汁含量不低于2. 5%的橙、柑、桔汁飲料的總D-異檸檬酸的測定。其測定原理異檸檬酸脫 氫酶isocitrate dehydrogenase有兩種類型以NAD為輔酶的酶(EC1. 1. 1. 41)和要NADP 為輔酶的酶(EC1. 1. 1.42)，兩者催化同一反應(yīng)。
異檸檬酸+ NAD(P)+S^ a-酮戊二酸+ C02 + NAP(P)H + H1" 在異檸檬酸脫氫酶催化下，樣品中的D-異檸檬酸鹽與NAD或NADP作用，生成NADH 或NADPH的含量，相當(dāng)于D-異檸檬酸鹽的量。在波長340nm處測定吸光度，確定樣品中總 D-異檸檬酸的含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長處吸光度的變化，得以測定異檸檬酸濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以 實現(xiàn)該方法的異檸檬酸測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、 全自動生化分析儀上進(jìn)行異檸檬酸濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切 實的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明異檸檬酸濃度測定方法如下 異檸檬酸異檸檬酸裂解酶琥珀酸+乙醛酸 乙醛酸+谷氨酸甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶甘氨酸+2-酮戊二酸 2-酮戊二酸+谷氨酰胺+還原型輔酶谷氨酸合成酶谷氨酸+輔酶 這種方法應(yīng)用異檸檬酸裂解酶(isocitrate lyase ;EC 4. 1. 3. 1)酶(偶)聯(lián)甘
氨酸轉(zhuǎn)氨酶(glycine t:rans咖inEise ;EC 2.6. 1. 4)、谷氨酸合成酶(glut咖ate synthase ;
EC 1.4.1.13)酶促反應(yīng)比色終點法。異檸檬酸裂解酶酶解異檸檬酸反應(yīng)產(chǎn)生乙醛酸，再通過(偶)聯(lián)合甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸合成酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收 峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度 下降的程度，通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算異檸檬酸的濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單 劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明異檸檬酸測定試劑(盒)較為理想








緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 異擰檬酸裂解酶
谷氨酸合成酶
谷氨酰胺
本發(fā)明的異檸檬酸;
100,1/L 500,1/L 0. 25,1/L 6000U/L 8000U/L 8000U/L 12mmol/L 15mmol/L
J定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、異檸檬酸裂解酶、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸合成酶、谷 氨酸、谷氨酰胺。
試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸、谷氨酰胺。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸裂解酶、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸合成酶。 還原型輔酶、異擰檬酸裂解酶、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸、谷氨酰胺在 試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使 用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸、谷氨酰胺。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸合成酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸裂解酶。
還原型輔酶、異擰檬酸裂解酶、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸、谷氨酰胺在 試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶 解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定異檸檬酸濃度的方法，其還原型輔酶可以 是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。









具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實施例一 本實施例的異檸檬酸測定試劑為單試劑，包括 [OO42]三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L 異檸檬酸裂解酶 6000U/L
甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶 8000U/L
谷氨酸合成酶 8000U/L
谷氨酸 12,1/L
谷氨酰胺 15mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測異檸檬酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)
方向為負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。 實施例二
本實施例的異檸檬酸測定試劑為雙試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶













谷氨酰胺 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
異擰檬酸裂解酶
100,1/L 50mmol/L 0. 25,1/L 12mmol/L 15mmol/L
谷氨酸合成酶
100,1/L 500,1/L 6000U/L 8000U/L 8000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測異檸檬酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為 2/20/5，反應(yīng)方向為負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。
















實施例三
本實施例的異檸檬酸測定試劑為三試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol 穩(wěn)定劑 500mmol/L 異檸檬酸裂解酶 6000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定異檸檬酸濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間IO分鐘， 起始吸光度1. 8±0. 7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測異檸檬酸樣品與試劑1、 試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向為負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約0分 鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá)到本發(fā)明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0007 ;吸光度時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈下 降曲線直至終點；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)30mmol/L ;試劑測試的不準(zhǔn)確 度，其相對偏差不超過±5% ;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《3% ;試劑 的靈敏度可達(dá)O. 012±0. 006 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本 發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的異檸檬酸濃度測定方法，其方法如下異檸檬酸異檸檬酸裂解酶琥珀酸+乙醛酸乙醛酸+谷氨酸 甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶 甘氨酸+2-酮戊二酸2-酮戊二酸+谷氨酰胺+還原型輔酶 谷氨酸合成酶 谷氨酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出異檸檬酸的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種異檸檬酸測定試劑(盒)，主要成分包括 緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 異擰檬酸裂解酶谷氨酸合成酶-50mmol/L谷氨酰胺 1——50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會 反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、異檸檬酸裂解酶、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸合成酶、谷氨 酸、谷氨酰胺組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、異檸檬酸裂解酶、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸合成酶、谷氨 酸、谷氨酰胺組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸、谷氨酰胺組 成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸裂解酶、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸合成酶組成。還原型 輔酶、異擰檬酸裂解酶、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸、谷氨酰胺在試劑1或試劑2 中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、異檸檬酸裂解酶、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸合成酶、谷氨 酸、谷氨酰胺組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸、谷氨酰胺組 成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸合成酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定 劑、異擰檬酸裂解酶組成。還原型輔酶、異擰檬酸裂解酶、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸合成酶、谷 氨酸、谷氨酰胺在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(A,niaSulfate)、甘油 (Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐齊U中的至少一 種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的異檸檬酸測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定異檸檬酸濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、谷氨酸、谷氨酰胺、異檸檬酸裂解酶、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸合成酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。
文檔編號C12Q1/52GK101793733SQ20091002849
公開日2010年8月4日 申請日期2009年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月4日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司