專利名稱：：使用高活性酮醇酸還原異構(gòu)酶來發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇的制作方法使用高活性酮醇酸還原異構(gòu)酶來發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及工業(yè)微生物和醇生產(chǎn)領(lǐng)域。更具體地講，通過使用特殊的酮醇酸還原異構(gòu)酶(KARI)以高轉(zhuǎn)換數(shù)工業(yè)發(fā)酵重組;徵生物來生產(chǎn)異丁醇。本發(fā)明還涉及從自然微生物中發(fā)現(xiàn)高活性KARI酶的方法。
背景技術(shù)：
：丁醇是一種重要的工業(yè)化學品，其可用作燃料添加劑、塑料工業(yè)中的化學原料以及食品和香料工業(yè)中的食品級萃取劑。每年，通過石油化學手4殳生產(chǎn)100至120億磅的丁醇，并且對該日用化學品的需求可能還會增加。用于化學合成異丁醇的方法是已知的，如羰基合成、一氧化碳催化氫化(Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,第6版,2003,Wiley-VCHVerlagGmbHandCo.,Weinheim,Germany,Vol.5,pp.716-719)和曱醇與正丁醇的格爾伯特縮合(Carlmi等人，J.Molec.Catal.A:Chem.220,215-220,2004)。這些工藝利用衍生自石油化學品的起始材料并通常昂貴，并且對環(huán)境不友好。用衍生自植物的原材料生產(chǎn)異丁醇將會使溫室氣體排放達到最低程度并將代表本領(lǐng)域的進步。異丁醇在生物學上作為酵母發(fā)酵的副產(chǎn)物產(chǎn)生。它是"雜醇油"的一種組分，雜醇油由這群真菌氨基酸的不完全代謝形成。異丁醇具體地講由L-纈氨酸的分解代謝而產(chǎn)生。在L-纈氨酸的胺基作為氮源被利用后，所得的ot-酮酸被酶脫羧并還原成異丁醇，這就是所謂的Ehrlich途徑(Dickinson等人，J.Biol.Chem.273,25752-25756,1998)。飲料發(fā)酵過程中獲得的雜醇油和/或其組分的收率通常^L低。例如，據(jù)報道在啤酒發(fā)酵中產(chǎn)生的異丁醇的濃度小于16ppm(Garcia等人，ProcessBiochemistry29,303-309,1994)。發(fā)酵中加入外源L-纈氨酸可提高異丁醇的收率，如Dickinson等人所述，同上，其中據(jù)報道通過在發(fā)酵中提供濃度為20g/L的L-纈氨酸能獲得3g/L的異丁醇收率。此外，海藻酸鈣固定化的運動發(fā)酵單胞菌細胞已經(jīng)顯示能產(chǎn)生正丙醇、異丁醇和異戊醇。使用了補充有L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、a-酮異己酸(a-KCA)、a-酮丁酸(a-KBA)或a-酮異戊酸(a-KVA)的10%含葡萄糖培養(yǎng)基(Oaxaca,等人，ActaBiotechnol.;11,523-532,1991)。a-KCA提高了異丁醇含量。氨基酸提供了對應(yīng)的醇，但其數(shù)量少于酮酸。當將亮氨酸、異亮氨酸和/或纈氨酸作為氮源加入培養(yǎng)基時，來自碳水化合物的C3-C5醇的收率顯示增加(WO2005040392)。雖然上述方法顯示了經(jīng)由生物方法生產(chǎn)異丁醇的潛力，但是這些方法當用于工業(yè)規(guī)模的異丁醇生產(chǎn)時受到成本的制約。從糖直接生物合成異丁醇將是經(jīng)濟上可行的并將代表本領(lǐng)域的進步。然而，該生產(chǎn)受到低速酮醇酸還原異構(gòu)酶(KARI)的嚴重阻礙，所述酶催化將乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為二羥基異戊酸的異丁醇途徑中的第二步。因為所述酶已經(jīng)是高水平表達的(S.Epelbaum等人J.Bacteriol.,180,4056-4067,1998)，需要在不增加蛋白質(zhì)數(shù)量的情況下提高KARI酶的活性，即，提高酶比活。申請人已經(jīng)通過發(fā)現(xiàn)一種具有高比活的KARI酶解決了所述問題，所述酶可被用于提高異丁醇的生物性生產(chǎn)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及表達高活性KARI酶的重組生物體。工程化微生物具有高含量的短型KARI酶，所述酶具有顯著更高的比活(大腸桿菌中的KARI酶的6-8倍)并可用于異丁醇的商業(yè)生產(chǎn)。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種用于將乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為二羥基異戊酸的方法，該方法包括a)提供包含編碼多肽的基因構(gòu)建體的微生物宿主細胞，所述多肽具有大于大腸桿菌的酮醇酸還原異構(gòu)酶比活的酮醇酸還原異構(gòu)酶比活；以及b)使所述(a)的宿主細胞接觸乙酰乳酸，其中產(chǎn)生2,3-二羥基異戊酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，基因構(gòu)建體編碼具有基于純化蛋白大于1.1(imol/min/mg的酮醇酸還原異構(gòu)酶比活的多肽，所述比活通過在以下條件下進4亍的NADPH消碑毛測定法來測量a)約7.5的pH值；b)約22.5。C的溫度；和6c)大于約10mM的鉀。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)異丁醇的方法，該方法包括a)提供包括下列基因構(gòu)建體的重組微生物宿主細胞1)至少一種編碼乙酰乳酸合酶的基因構(gòu)建體，所述乙酰乳酸合酶將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰乳酸(途徑步驟a);2)至少一種編碼酮醇酸還原異構(gòu)酶的基因構(gòu)建體，所述酮醇酸還原異構(gòu)酶的比活基于純化蛋白大于l.lpmol/min/mg,所述比活通過在以下條件下進^亍的NADPH消4毛測定法來測量i)約7.5的pH值；ii)約22.5。C的溫度；和iii)大于約10mM的鉀，所述鉀用于將(S)-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基異戊酸，(途徑步驟b);3)至少一種編碼乙酰羥酸脫水酶的基因構(gòu)建體，所述乙酰羥酸脫水酶用于將2,3-二羥基異戊酸轉(zhuǎn)化為a-酮異戊酸，(途徑步驟c);4)至少一種編碼支鏈酮酸脫羧酶的基因構(gòu)建體，所述支鏈酮酸脫羧酶用于將a-酮異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁醛，(途徑步驟d);5)至少一種編碼支鏈醇脫氫酶的基因構(gòu)建體，所述支鏈醇脫氳酶用于將異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇(途徑步驟e);以及b)使(a)的宿主細胞在產(chǎn)生異丁醇的條件下生長。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包括酮醇酸還原異構(gòu)酶的重組宿主細胞，所述酶具有的比活大于大腸桿菌酮醇酸還原異構(gòu)酶的比活。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于鑒定和分離編碼酮醇酸還原異構(gòu)酶的基因構(gòu)建體的方法，所述酶具有基于純化蛋白大于l.lpmol/min/mg的比活，所述比活通過在以下條件下進行的NADPH消誶毛測定法來測量i)約7.5的pH值；ii)約22.5。C的溫度；和iii)大于約10mM的4甲；該方法包括以下步驟a)筌定當在M9基本培養(yǎng)基中生長時倍增時間短于大腸桿菌的倍增時間的菌種；b)篩選(a)的菌種的酮醇酸還原異構(gòu)酶活性以鑒定活性菌種；c)使用與已知編碼酮醇酸還原異構(gòu)酶的基因構(gòu)建體具有同源性的核酸序列來探測(b)活性菌種的基因組DNA,以從所述活性菌種中鑒定和分離編碼酮醇酸還原異構(gòu)酶的基因構(gòu)建體；以及d)從所述活性菌種中擴增并表達編碼酮醇酸還原異構(gòu)酶的基因構(gòu)建體；以及e)從步驟(d)的表達的基因構(gòu)建體中篩選具有基于純化蛋白大于l.lpmol/min/mg的比活的酮醇酸還原異構(gòu)酶的基因構(gòu)建體，所述比活通過在以下條件下進行的NADPH消耗測定法來測量i)約7.5的pH值；ii)約22.5。C的溫度；和iii)大于約10mM的4甲。和本發(fā)明的序列通過下面的具體實施方式、附圖和隨附的序列描述可以更全面地理解本發(fā)明，這些詳細描述、附圖和序列描述形成了本專利申請的一部分。圖1顯示了四種不同的異丁醇生物合成途徑。標記有"a"、"b"、"c"、"d"、"e"、"f，、"g"、"h"、'T，、"j"和"k"的步驟代表下述的底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。下面的序列遵照37C.F.R.1.821-1.825("RequirementsforPatentApplicationsContainingNucleotideSequencesand/orAminoAcidSequenceDisclosures-theSequenceRules"(，寸含有才亥酸序列禾口/或氨基酸序列公開的專利申請的要求一序列規(guī)則))，并且符合WorldIntellectualPropertyOrganization(世界知識產(chǎn)權(quán)組織，WIPO)ST.25標準(1998)以及EPO和PCT的序列清單要求(規(guī)則5.2和49.5(a-bis)以及AdministrativeInstructions(行政指令)的第208節(jié)和附錄C)。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式均遵照37C.F.R.§1.822中列出的規(guī)則。表1優(yōu)選的異丁醇途徑的基因和蛋白質(zhì)SEOIDNO:的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>SEQIDNO:11-22是用于生成實施例1中構(gòu)建體的寡核苷酸引物的核苷酸序列。SEQIDNO:23-30是用于生成實施例2中構(gòu)建體的寡核苷酸引物的核苷酸序列。SEQIDNO:11和12是實施例1中用于ilvC基因的PCR擴增的引物的DNA序列SEQIDNO:13是用于克隆大腸桿菌pBAD載體中的KARI基因的正向引物DNA序列SEQIDNO:14是用于克隆大腸桿菌pBAD載體中的KARI基因的反向引物DNA序列SEQIDNO:15是用于擴增KARI基因的ilvC-trc-SacI-F的正向DNA序列SEQIDNO:16是用于擴增KARI基因的ilvC-trc-HindIII-R的反向DNA序列SEQIDNO:17至22是用于通過SacI消化和DNA測序確認大腸桿菌ilvC插入序列存在的寡核苷酸引物的核苷酸序列。SE(5IDNO17-ilvC國trc-F3SEQIDNO18-ilvC-trc-F5SEQIDNO19-ilvC-trc-R2SEQIDNO20-ilvC-trc隱R4SEQIDNO21-pBAD-eFl9SEQIDNO:22-PALPK-R1SEQIDNO:23至26是用于通過PCR從銅綠假單胞菌(PAOl)和熒光假單胞菌(PF5)的基因組DNA中正向和反向擴增ilvC基因的寡核苷酸引物的核苷酸序列。SEQID#23-PA〇1-C-F1SEQIDNO:24-PA01-C-R1SEQIDNO:25-PF5-C-F1SEQIDNO:26-PF5-C-R1SEQIDNO:21、22、27和28是用于驗證包含假單胞菌屬ilvC基因的陽性克隆DNA序列的寡核苷酸引物的核苷酸序列。SEQIDNO:27-PF5-S-F2SEQIDNO:28-PF5-S-R2以下SEQIDNO對應(yīng)于本發(fā)明中^f吏用的KARI基因的DNA序列SEQIDNO:29-大腸桿菌K12-ilvCSEQIDNO:30-經(jīng)密碼子最優(yōu)化的KARI，來自弧菌，用于大腸桿菌表達SEQIDNO:31-銅綠假單胞菌-PAOl-ilvCSEQIDNO:32-熒光假單胞菌隱PF5-ilvC以下SEQIDNO是分別對應(yīng)于SEQIDN029-32的氨基酸序列SEQIDNO:33-大腸桿菌K12-ilvC-[KARI來自大腸桿菌K12]34-KARI,來自霍亂弧菌35-PAOl國ilvC(laa-338aa)36-PF5-ilvC(laa-338aa)37是正向引物PAL-F1——38是反向引物(PAL-R1)39是正向引物(PAL-EcoRl-Fl)40是反向引物(PAL-EcoRl-Rl)SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種使用包含高活性KARI酶的微生物宿主細胞將乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基異戊酸的方法。由此形成的2,3-二羥基異戊酸經(jīng)由圖1顯示的步驟被進一步轉(zhuǎn)化為異丁醇。本發(fā)明還公開了用于在它們的天然宿主微生物中尋找快速KARI酶的方法和可用于進一步改善它們的催化活性的此類酶的分子進化。本發(fā)明滿足多種商業(yè)需求和工業(yè)需求。丁醇是一種具有多種應(yīng)用的重要工業(yè)日用化學品，其中其作為燃料或燃料添加劑的潛力尤為重要。盡管丁醇僅僅是一種四碳醇，但是其具有與汽油相似的能含量，并且可以與任何化石燃料共混。丁醇是優(yōu)選的燃料或燃料添加劑，因為它在標準內(nèi)燃機中燃燒時僅生成C02并且?guī)缀醪划a(chǎn)生或根本不產(chǎn)生SOx或NOx。另夕卜，丁醇的腐蝕性不及乙醇，是目前為止最優(yōu)選的燃料添加劑。丁醇除了可用作生物燃料或燃料添加劑之外，在新興的燃料電池工業(yè)中還具有影響氫分配問題的潛力。如今，由于氫的運輸和分配存在安全隱患，燃料電池飽受困擾?？梢匀菀椎貙Χ〈贾卣錃浜浚⑶铱梢酝ㄟ^現(xiàn)有的加油站以燃料電池或汽車所需的純度進行分配。以下定義和縮寫用于權(quán)利要求和說明書的判讀。如本文所用，術(shù)語"發(fā)明"或"本發(fā)明"一般應(yīng)用于如權(quán)利要求中所述的本發(fā)明所有實施方案，或如說明書中提供的或后經(jīng)修正或補充的所有實施方案。術(shù)語"異丁醇生物合成途徑"是指用以生產(chǎn)異丁醇的酶途徑。優(yōu)選的異丁醇生物合成途徑在圖1中示出并如本文所述。術(shù)語"NADPH消耗測定法"是指用于確定KARI酶比活的酶測定法，涉及測量酶反應(yīng)中KARI輔因子NADPH的消沖毛，如下文所述(Aulabaugh等人；Biochemistry,29，2824-2830，1990)。"KARI"是酮醇酸還原異構(gòu)酶的縮寫。術(shù)語"乙酰鞋酸還原異構(gòu)酶"和"酮醇酸還原異構(gòu)酶"可互換使用，是指EC編號為EC1丄1.86(EnzymeNomenclature1992,AcademicPress,SanDiego)的酶。酮醇酸還原異構(gòu)酶催化(S)-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基異戊酸的反應(yīng)，這將在下文中詳迷。這些酶可得自多個來源，包括但不限于大腸桿菌基因庫保藏編號(GenBankAccessionNumber)NC_000913區(qū)域3955993..3957468、霍亂弧菌基因庫保藏編號NC—002505區(qū)域157441..158925、銅綠假單胞菌基因庫保藏編號NC—002516區(qū)域5272455..5273471和熒光假單胞菌基因庫保藏編號NC—004129區(qū)域6017379..6018395。術(shù)語"乙酰乳酸合酶"是指催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰乳酸和C02的酶。乙酰乳酸具有(R)-和(S)-兩種立體異構(gòu)體，所述酶優(yōu)選通過生物體系制備的(S)-異構(gòu)體。優(yōu)選的乙酰乳酸合酶已知其EC編號為EC2.2.1.69(EnzymeNomenclature1992,AcademicPress,SanDiego)。這些酶可得自多種來源，包括但不限于枯草芽孢桿菌(基因庫編號(GenBankNo):CAB15618,Z99122,分別是NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)氨基酸序列、NCBI核苷酸序列)、肺炎克雷伯氏菌(基因庫編號AAA25079(SEQIDNO:2)、M73842(SEQIDNO:1))和乳酸乳球菌(基因庫編號AAA25161,L16975)。術(shù)語"乙酰羥酸脫水酶"是指催化2,3-二羥基異戊酸轉(zhuǎn)化為a-酮異戊酸的酶。優(yōu)選的乙酰羥酸脫水酶已知其EC編號為EC4.2丄9。這些酶可得自多種微生物，包括但不限于大腸桿菌(基因庫編號YP—026248(SEQIDNO:6)、NC—000913(SEQIDNO:5))、啤酒糖酵母(基因庫編號NP—012550,NC—001142)、海沼曱烷J求菌(基因庫編號CAF29874,BX957219)和菌株枯草芽孢#干菌(基因庫編號CAB14105,Z99115)。術(shù)語"支鏈a-酮酸脫羧酶"是指催化a-酮異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁醛和C02的酶。優(yōu)選的支鏈a-酮酸脫羧酶已知其EC編號為EC4.1.1.72,并可得自多種來源，包括4旦不限于乳酸乳球菌(基因庫編號AAS49166,AY548760;CAG34226(SEQIDNO:8),AJ746364、鼠傷寒沙門氏菌(基因庫編號NP—461346,NC—003197)和丙酮丁醇梭菌(基因庫編號NP—149189,NC—001988)。術(shù)語"支鏈醇脫氳酶"是指催化異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇的酶。優(yōu)選的支鏈醇脫氳酶已知其EC編號為EC1.1.1.265,但也可以將其歸類為其他醇脫氬酶(具體地講，ECl丄l.l或1.1.1.2)。這些酶利用NADH(還原型煙酰胺腺噤呤二核苷酸)和/或NADPH作為電子供體并可得自多種來源，包括但不限于啤酒糖酵母(基因庫編號NP—010656,NC_001136;NP—014051,NC—001145)、大腸桿菌(基因庫編號NP—417484(SEQIDNO:10),NC—000913(SEQIDNO:9))和丙酮丁醇梭菌(基因庫編號NP—349892,NC—003030)。術(shù)語"支鏈酮酸脫氳酶"是指催化a-酮異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁酰-CoA(異丁酰-輔酶A)的酶，-使用NAD+(煙酰胺腺噤呤二核苷酸)作為電子受體。優(yōu)選的支鏈酮酸脫氬酶已知其EC編號為EC1.2.4.4。這些支鏈酮酸脫氳酶由四個亞基構(gòu)成，并且來自所有亞基的序列可得自多種微生物，包括但不限于菌抹枯草芽孢桿菌(基因庫編號CAB14336,Z99116;CAB14335,Z99116;CAB14334,Z99116;和CAB14337,Z99116)和惡臭假單胞菌(基因庫編號AAA65614,M57613;AAA65615,M57613;AAA65617,M57613;和AAA65618,M57613)。術(shù)語"碳底物"或"可發(fā)酵碳底物"指能夠被本發(fā)明的宿主生物體代謝的碳源，并且特別是選自由下列的碳源單糖、低聚糖、多糖和一石灰底物或它們的混合物。術(shù)語"keat"和"Km"是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，并被描述于EnzymeStructureandMechanism,第2版(Ferst;W丑Freeman:NY,1985;pp98-120)。術(shù)語"kcat"，也常稱之為"轉(zhuǎn)換數(shù)"，定義為每個活性位點每單位時間內(nèi)將底物分子轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的最大數(shù)目，或每單位時間內(nèi)的酶轉(zhuǎn)換次數(shù)。kcat=Vmax/[E]，其中[E]是酶濃度(Ferst,同上)。術(shù)語"總轉(zhuǎn)換"和"總轉(zhuǎn)換數(shù)"本文用于指KARI酶與底物反應(yīng)形成的產(chǎn)物的量。術(shù)語"催化效率"定義為酶的keat/KM。"催化效率"用于測定酶對底物的特異性。術(shù)語"比活"是指酶單位/mg蛋白，其中酶單位定義為在特定溫度、pH、[S]等條件下的形成的產(chǎn)物的摩爾數(shù)/分鐘。術(shù)語"慢速"或"快速，，當用于指酶活性時涉及與標準品比較的酶轉(zhuǎn)換數(shù)。術(shù)語"分離的核酸分子"、"分離的核酸片段"和"基因構(gòu)建體"可以互換使用，并將指單鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合體，任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的分離的核酸片段可由cDNA、基因組DNA或合成DNA的一個或多個片段構(gòu)成。術(shù)語"基因"指能夠被表達為特定蛋白質(zhì)的核酸片段，其任選包括編碼序列前的調(diào)節(jié)序列(5'非編碼序列)和編碼序列后的調(diào)節(jié)序列(3'非編碼序列)。"天然基因"是指天然存在的具有其自己的調(diào)節(jié)序列的基因。"嵌合基因"是指不是天然基因的任何基因，包含在天然情況下不是一起存在的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。因此，嵌合基因可包括源于不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或者包括源于同一來源但以不同于天然存在的方式排列的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。"內(nèi)源性基因"指位于生物的基因組內(nèi)它的天然位置的天然基因。"外來基因"指正常情況下不存在于宿主生物中的基因，它通過基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入宿主生物。外來基因可包含插入到非天然生物體內(nèi)的天然基因，或嵌合基因。"轉(zhuǎn)基因"是通過轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入基因組內(nèi)的基因。如本文所用，術(shù)語"編碼序列"是指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。"合適的調(diào)節(jié)序列"指位于編碼序列的上游(5'非編碼序列)、中間或下游(3'非編碼序列)的核苷酸序列，其可影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性，或者翻譯。調(diào)節(jié)序列可包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應(yīng)子結(jié)合位點和莖環(huán)結(jié)構(gòu)。術(shù)語"啟動子"指能夠控制編碼序列或功能性RNA表達的DNA序列。一般來講，編碼序列位于啟動子序列的3'端。啟動子可以整個源于甚至包括合成的DNA片段。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)當理解，不同的啟動子可以在不同的組織或細胞類型中，或者在不同的發(fā)育階段，或者響應(yīng)不同的環(huán)境條件或生理條件而引導(dǎo)基因的表達。導(dǎo)致基因在大部分時間內(nèi)在大多數(shù)細胞類型中表達的啟動子通常稱為"組成型啟動子"。還應(yīng)當進一步認識到，由于在大多數(shù)情況下調(diào)節(jié)序列的確切邊界尚未完全確定，因此不同長度的DNA片段可能具有相同的啟動子活性。術(shù)語"可操作地連接"指單個核酸片段上的核酸序列的關(guān)聯(lián)，使得其中一個核酸序列的功能受到另一個核酸序列的影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列的表達(即，該編碼序列受到該啟動子的轉(zhuǎn)錄控制)時，則該啟動子與該編碼序列可^:作i也連接。編碼序列可以以有義或反義的取向可操作地連接至調(diào)節(jié)序列。如本文所用，術(shù)語"表達"指源于本發(fā)明核酸片段的有義RNA(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積聚。表達也可指將mRNA翻譯成多肽。如本文所用，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"指將核酸片段轉(zhuǎn)移至宿主生物體的基因組內(nèi)，導(dǎo)致在基因上穩(wěn)定遺傳。含有轉(zhuǎn)化核酸片段的宿主生物被稱為"轉(zhuǎn)基因"或"重組"或"轉(zhuǎn)化"生物體。術(shù)語"質(zhì)粒，，、"載體，，和"盒，，指通常攜帶有不屬于細胞中心代謝的部分的基因的染色體外元件，并且常常是環(huán)狀雙鏈DNA片段的形式。這類元件可以是源自任何來源的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或單鏈或雙鏈DNA或RNA的核苷酸序列(線性或環(huán)狀)，其中多個核苷酸序列已連接或重組進一種獨特構(gòu)建體中，該獨特構(gòu)建體能夠?qū)⑺x基因產(chǎn)物的啟動子片段和DNA序列與相應(yīng)的3'末端非翻譯序列一起引入細胞中。"轉(zhuǎn)化盒"指包含外來基因并且除該外來基因外還具有有利于特定宿主細胞轉(zhuǎn)化的元件的特定載體。"表達盒"指包含外來基因并且除該外來基因以外還具有使得該基因在外來宿主中的表達增強的元件的特定載體。如本文所用，術(shù)語"密碼子簡并性"指允許核苷酸序列在不影響所編碼的多肽的氨基酸序列的情況下發(fā)生變化的遺傳密碼的性質(zhì)。技術(shù)人員非常了解在使用核苷酸密碼子確定給定氨基酸時特定宿主細胞顯示出的"密碼子偏倚性，，。因此，在合成基因以改善其在宿主細胞中的表碼子使用頻率。術(shù)語"經(jīng)密碼子最優(yōu)化的"在其涉及用于轉(zhuǎn)化不同宿主的核酸分子的基因或編碼區(qū)時是指在不改變由DNA編碼的多肽的情況下，改變核酸分子的基因或編碼區(qū)中的密碼子以反映宿主生物體通常的密碼子使用。本文所用的標準重組DNA和分子克隆:技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知，并且描述于以下文獻中Sambrook等人(Sambrook、Fritsch和Maniatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,NY,1989)(在下文中"Maniatis");和Silhavy等人(Silhavy等人,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarbor,NY，1984);以及Ausubel,F.M.等人,(Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,publishedbyGreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience,1987)。本發(fā)明從源自植物的碳源來生產(chǎn)異丁醇，避免了與丁醇生產(chǎn)的標準石油化學工藝相關(guān)的負面的環(huán)境影響。在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于鑒定具有高催化效率的KARI酶的方法，所述酶的高效率將使其不適的KARI酶以及使用本領(lǐng)域熟知的方法對它們進行誘變以提高酶的比活，這些過程將在下文中詳述。酮酸還原異構(gòu)酶(KARI)乙酰鞋酸還原異構(gòu)酶或酮醇酸還原異構(gòu)酶(KARI;EC1.1.1.86)催化支鏈氨基酸生物合成的2個步驟，是它們的生物合成中的關(guān)鍵酶。KARI存在于多種生物體中，跨物種的氨基酸序列比較已經(jīng)揭示所述酶具有兩種類型短型(I類)存在于真菌和大多數(shù)細菌中，長型(n類)一般存在于植物中。短型KARI通常具有330-340個氨基酸殘基。長型KARI具有約490個氨基酸殘基。然而，一些細菌如大腸桿菌具有長型酶，其中的氨基酸序列略微不同于存在于植物中的氨基酸序列。KARI由ilvC基因編碼，是基本培養(yǎng)基中大腸桿菌和其他細菌生長的必需酶。KARI使用NADPH作為輔因子并且其活性需要二價陽離子如Mg++。除了在纈氨酸途徑中利用乙酰乳酸之外，KARI還在異亮氨酸生產(chǎn)途徑中將乙酰羥基丁酸轉(zhuǎn)化為二羥基甲基戊酸。大腸桿菌KARI酶在2.6A分辨率下的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解決(Tyagi等人，ProteinScience,14，3089-3100,2005)。所述酶由2個結(jié)構(gòu)域組成，一個結(jié)構(gòu)域具有混合a/p結(jié)構(gòu)，它類似于存在于其他吡啶核苷酸依賴型脫氳酶中的結(jié)構(gòu)域。第2個結(jié)構(gòu)域主要是oc-螺旋狀結(jié)構(gòu)，并且有有力證據(jù)顯示其具有內(nèi)部重復(fù)。比較大腸桿菌、銅綠假單胞菌和菠菜的KARI活性位點顯示酶活性位點的大多數(shù)殘基占據(jù)保守位點。當把大腸桿菌KARI晶體化成四聚體時，該四聚體可能是合適的生物活性單位，銅綠假單胞菌KARI(Ahn等人，J.Mol.Biol.,328，505-515,2003)形成十二聚體，而來自菠菜的KARI酶形成二聚體。已知的KARI是慢速酶，報道的轉(zhuǎn)換數(shù)為(kcat)2s"(Aulabaugh等人；Biochemistry,29,2824-2830,1990)或0.12s-1(Rane等人，Arch.Biochem.Biophys.338,83-89,1997)乙酰乳酸。已有研究證明大腸桿菌中的異亮氨酸-纈氨酸生物合成的基因操縱不同于銅綠假單胞菌的基因才喿縱(Marinus等人，Genetics,63,547-56,1969)。高活性KARI酶的鑒定和分離?；仡櫫司哂斜却竽c桿菌更高的倍增速率的生物。鑒定了當在M9基本培養(yǎng)基中生長時倍增時間比大腸桿菌更快的三種微生物，它們是銅綠假單胞菌(PAOl)、熒光假單胞菌(PF5)和霍亂弧菌(N16961)。從這些微生物的每個中分離編碼KARI酶的基因并且表達和部分純化所編碼的蛋白。將從高倍增速率生物中分離的酶的比活與大腸桿菌的酶比活進行了比較。KARI使用NADPH消耗測定法進行檢測，該方法在340nm處測量輔因子NADPH在酶將乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為a,(3-二羥基異戊酸過程中的消耗。使用NADPH的6220M"cm^摩爾消光系數(shù)來計算活性并報告為細胞提取物中每mg總蛋白每分鐘消耗的NADPH的pmole數(shù)(參見Aulabaugh和Schloss,Biochemistry,29,2824-2830,1990)。本發(fā)明的一個目標是提供具有比活大于l.l|Limol/min/mgKARI的KARI酶，該比活根據(jù)本文所述的NADPH消耗測定法使用純化蛋白來測量。大腸桿菌KARI是一種慢速酶，它在支鏈氨基酸合成途徑中是必需的。編碼KARI(ilvC)的^f、因當細胞在豐富培養(yǎng)基中生長時不表達,但當在基本培養(yǎng)基中生長時以高水平(約10%的可溶性蛋白)表達(S.Epelbaum等人，同上)。選擇合適KARI酶的方法涉及兩個步驟。第一步是搜索在自然界中分離可用的酶的同源物?；谏锏谋对鰰r間，通過4艮定某種生物最可能具有合適的KARI進行該搜索。第二步涉及通過構(gòu)建強表達載體、誘變并進化KARI編碼序列、并且最后選4奪具有改善KARI活性的變異體來制造并搜索人造差異酶。使用上述方法從熒光布i單胞菌屬(SEQIDNO:35[PA01-ilvC]SEQIDNO:36[PF5-ilvC])和霍亂弧菌(SEQIDNO:34)中分離KARI酶，所述酶具有比分離自大腸桿菌(SEQIDNO:33[大腸桿菌K12-ilvC]的KARI酶更高的比活。本發(fā)明中優(yōu)選的是比活大于約l.lpmol/min/mg的KARI酶。其中約5-40pmol/min/mg的比活是尤其合適的。優(yōu)選使用純化蛋白結(jié)合NADPH消耗測定法(Aulabaugh,同上)來測量KARI的比活，測量溫度在2(TC和25。C之間，其中優(yōu)選約22.5。C,測量在pH值介于7.0和8.0之間，其中優(yōu)選約7.5的pH值，并且在具有約10mM鉀的緩沖液中進4亍，其中至少約10mM至約50mM的鉀是合適的。本發(fā)明中使用的一些具體酶在下表2中列出。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>本發(fā)明不限于本文所述的特定假單胞菌和弧菌酶。例如，這些多肽可用作尋找具有相似活性的同源物的基礎(chǔ)，或作為誘變和蛋白進化的模板。KARI同源物分離本發(fā)明的核酸片段可用于分離編碼來自相同或其他微生物物種的同源蛋白的基因。使用序列依賴性規(guī)程來分離同源KARI基因是本領(lǐng)域熟知的。序列依賴型規(guī)程的實例包括但不限于核酸雜交方法、DNA和RNA擴增方法例如核酸擴增技術(shù)的多種應(yīng)用，例如聚合酶4連反應(yīng)(PCR)(Mullis等人，美國專利公開4,683,202)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、(Tabor等人，Pro"Acad.Sci.USA82,1074,1985)或鏈置換擴增反應(yīng)(SDA)(Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89,392,1992)。例如，編碼與本發(fā)明的那些蛋白或多肽相似的蛋白或多肽的基因可通過使用所有或部分本發(fā)明的核酸片段作為DNA雜交探針，使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法來篩選來自任何所需細菌的文庫而得以直接分離?；诒景l(fā)明的核酸序列的特異性寡核苷酸探針可通過本領(lǐng)域已知的方法(Maniatis，同上)設(shè)計和合成。而且，整個序列可直4妻用于通過熟練技術(shù)人員已知的方法，例如隨機引物DNA標記、切口平移或末端標記技術(shù)，來合成DNA探針，或使用可獲得的體外轉(zhuǎn)錄體系來合成RNA探針。另外，可設(shè)計特異性引物并將其用于擴增部分或全長的本發(fā)明序列。所得的擴增產(chǎn)物可在擴增反應(yīng)過程中直接標記或在擴增反應(yīng)之后標記，并用作探針來在合適的嚴格條件下分離全長的DNA片段。通常，在PCR類型的擴增技術(shù)中，引物具有不同的序列而且彼此之間不互補。取決于所需的檢測條件，應(yīng)該設(shè)計引物序列以便提供既有效又可靠的靶核酸的復(fù)制。PCR引物設(shè)計方法是本領(lǐng)域常見且熟知的，例如Thein禾口Wallace等人，"TheuseofoligonucleotideasspecifichybridizationprobesintheDiagnosisofGeneticDisorders",inHumanGeneticDiseases:APracticalApproach,K.E.Davis編輯，1986,第33-50頁，IRLPress,Herndon,Virginia);和Rychlik(Rychlik,1993，InWhite,B.A.(編輯),MethodsinMolecularBiology,Vol.15,第31-39頁，PCRProtocols:CurrentMethodsandApplications.HumanaPress,Inc.,Totowa,NJ)。通常，可以將本發(fā)明序列的兩個短片段在聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)程中用于從DNA或RNA擴增編碼同源基因的更長的核酸片段。聚合酶鏈反應(yīng)也可以用克隆的核酸片段的文庫進行，其中一個引物的序列源自本發(fā)明的核酸片段，而另一個引物的序列利用編碼微生物基因的mRNA前體的3'端的多腺苦酸片的存在。作為另外一種選擇，第二個引物序列可以基于來源于克隆載體的序列。例如，技術(shù)人員可以按照RACE規(guī)程(Frohman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,8998,1988),通過用PCR擴增在轉(zhuǎn)錄物內(nèi)單個位點與3'或5'端之間的區(qū)域的拷貝來生成cDNA。以3'和5'方向取向的引物可用本發(fā)明的序列i殳計。4吏用可商購獲得的3'RACE或5'RACE體系(LifeTechnologies,Rockville,MD),可以分離特異性的3'或5'cDNA片段(Ohara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,5673,1989);和(Loh等人，Science,243,217-2201989)。作為另外一種選擇，可使用本發(fā)明的序列作為雜交試劑用于鑒定同源物。核酸雜交試驗的基本組成包括探針、懷疑含有目的基因或基因片段的樣本及特定的雜交方法。本發(fā)明的探針通常是與待檢測的核酸序列互補的單鏈核酸序列。探針與待檢測的核酸序列是"可雜交的"。探針長度可從5個堿基至數(shù)萬個堿基不等，這將取決于具體待完成的測試。通常約15個堿基至約30個堿基的探針長度是合適的。只需要探針分子的部分與待檢測的核酸序列互補。另外，探針和靶序列之間不需要完全19的某些堿基沒有與正確的互補堿基配對。雜交方法是非常確實的。通常探針和樣本必須在允許核酸雜交的條針和樣本接觸。探針和樣本核酸必須接觸足夠長的時間，使探針和樣本核酸之間的任何可能的雜交都可發(fā)生?；旌衔镏械奶结樆虬袠说臐舛葘Q定雜交發(fā)生所需的時間。探針或靶標的濃度越高，所需的雜交孵育時間就越短。<壬選地，可以加入離液劑。離液劑通過抑制核酸酶活性來穩(wěn)定核酸。此外，離液劑允許短寡核苷酸探針在室溫下的敏感和嚴格雜交(VanNess等人，Nucl.AcidsRes.19,5143-5151,1991)。合適的離液劑包括氯化胍、碌u氰酸胍、碌u氰酸鈉、四氯乙酸鋰、高氯酸鈉、四氯乙酸銣、碘化鉀和三氟乙酸銫等。通常，離液劑的終濃度將為約3M。如果需要，人們可以加入甲酰胺至雜交混合物中，通常為30-50%(v/v)?？梢圆捎枚喾N雜交溶液。通常，這些雜交溶液包含約20%至60%體積，優(yōu)選30%體積的極性有機溶劑。普通的雜交溶液使用約30-50%v/v甲酰胺、約0.15至l.OM氯化鈉、約0.05至O.IM緩沖液(如檸檬酸鈉、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范圍約6畫9))、約0.05至0.2%去污劑(如十二烷基硫酸鈉)或0.5-20mMEDTA,FICOLL(PharmaciaInc.)(約498-830zg(300-500千道爾頓))、聚乙烯吡咯烷酮(約41SS30zg(250-500千道爾頓))和血清白蛋白。典型的雜交溶液中還將包含約0.1至5mg/mL未經(jīng)標記的載體核酸、片段化的核DNA例如小牛胸腺或鮭精DNA、或酵母RNA、以及任選地約0.5至2%w/v甘氨酸。還可以包含其他添加劑，例如包括多種極性水溶性或可膨脹試劑如聚乙二醇、陰離子聚合物如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯和陰離子糖類聚合物如硫酸葡聚糖在內(nèi)的體積排阻劑。核酸雜交可適用于多種測定形式。最合適的方法形式之一是夾心測定形式。夾心測定尤其適用于在非變性條件下雜交。夾心型測定的主要成分是固體支持體。固體支持體具有吸附或共價連接至其上的固定核酸探針，該探針未經(jīng)標記并且與序列的一部分互補。異丁醇生物合成途徑本發(fā)明的高活性KAR1酶的其中一個主要用途將是作為用于生成異丁醇的代謝途徑中的元件。已經(jīng)闡明并描述了多個這些途徑。利用碳水化合物的微生物將糖酵解(EMP)途徑、恩-杜二氏糖解途徑和戊糖磷酸循環(huán)用作中心代謝途徑以便為生長和維持提供能量和細胞前體。這些途徑均有中間體3-磷酸甘油醛，而且最終會直接形成丙酮酸或與EMP途徑結(jié)合形成丙酮酸。隨后，經(jīng)由多種方法將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰-輔酶A(乙酰-CoA)。乙酰-CoA是關(guān)鍵中間體，例如在生成脂肪酸、氨基酸和次級代謝物的途徑中它是關(guān)鍵中間產(chǎn)物。糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸的組合反應(yīng)產(chǎn)生能量(如5，-三磷酸腺苷，ATP)和還原型等價物(如，還原型煙酰胺腺噤呤二核苦酸NADH,以及還原型煙酰胺A泉嘌p令二核苷酸磷酸鹽NADPH)。NADH和NADPH必須一皮循環(huán)以形成其氧4b形式(分別為NAD+和NADP+)。在存在無才幾電子受體(如，02、NCV和SOZ-)的情況下，所述還原型等價物可以用于增加能量池；作為另外一種選擇，可能形成還原型碳副產(chǎn)物。如圖l所示，用重組微生物有四種潛在的途徑從碳水化合物生成異丁醇。在共有的美國專利申請11/586315中已經(jīng)描述了從碳水化合物轉(zhuǎn)化為異丁醇的所有潛在途徑，該專利申請以引用方式并入本文。將丙酮酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的優(yōu)選途徑由酶催化步驟"a"、"b"、"c"、"d"和"e，，(圖1)組成，并且包括以下底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化a)丙酮酸到乙酰乳酸，由例如乙酰乳酸合酶催^>,b)(S)-乙酰乳酸到2,3-二羥基異戊酸，由例如乙酰羥酸還原異構(gòu)酶催化，c)2,3-二羥基異戊酸到a-酮異戊酸，由例如乙酰羥酸脫水酶催化，d)ot-酮異戊酸到異丁醛，由例如支鏈酮酸脫羧酶催化，以及e)異丁醛到異丁醇，由例如支鏈醇脫氫酶催化。該途徑結(jié)合了在詳述的纈氨酸生物合成(丙酮酸到a-酮異戊酸)和纈氨酸分解代謝(a-酮異戊酸到異丁醇)途徑中涉及的酶。因為許多纈氨酸生物合成酶還催化異亮氨酸生物合成途徑中的類似反應(yīng)，所以底物特異性是選擇基因來源時的主要考慮因素。因此，乙酰乳酸合酶受關(guān)注的主要基因是那些來自芽孢桿菌屬(alsS)和克雷白氏桿菌屬(budB)的基因。已知這些特定乙酰乳酸合酶參與這些生物中的丁二醇發(fā)酵并顯示出對比對酮丁酸更高的丙酮酸親和力(Gollop等人，J.Bacteriol.172,3444-3449,1990);和(Holtzclaw等人，J.Bacteriol.121,917-922,1975)。途徑的第二個和第三個步驟分別由乙酰羥酸還原異構(gòu)酶和脫水酶催化。已知這些酶有多個來源，例如大腸桿菌(Chunduru等人，Biochemistry28,486-493,1989);和(Flint等人，J.Biol.Chem,268,14732-14742,1993)。優(yōu)選的異丁醇途徑的最后兩步已知發(fā)生在酵母中，酵母能利用纈氨酸作為氮源并在該過程中分泌異丁醇。a-酮異戊酸能^皮多個酮酸脫羧酶如丙酮酸脫羧酶轉(zhuǎn)化為異丁醛。為了防止異丁醇生產(chǎn)中的丙酮酸錯用，需要一種對丙酮酸親和力4交〗氐的脫羧酶。迄今為止，本領(lǐng)域已知兩種此類酶(Smit等人，Appl.Environ.Microbiol.71,303-311,2005);和(delaPlaza等人，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.238,367-374,2004)。兩種酶都來自乳酸乳球菌菌抹并優(yōu)選酮異戊酸，對酮異戊酸的親和力高于丙酮酸50至200倍。最后，已經(jīng)鑒定了酵母中的多個醛還原酶，許多醛還原酶具有重疊的底物特異性。那些已知的相比乙醛更優(yōu)選支鏈底物的酶包括但不限于醇脫氳酶VI(ADH6)和Yprlp(Larroy等人，Biochem.J.361,163-172，2002);和(Ford等人，Yeast19,1087-1096,2002),二者都使用NADPH作為電子供體。NADPH依賴型還原酶YqhD對支鏈底物有活性，它最近也在大腸桿菌中被鑒定(Sulzenbacher等人，J.Mol.Biol.342,489-502,2004)。其他兩種潛在的異丁醇生產(chǎn)途徑還包含最初的三步"a"、"b"和"c"。一種途徑由酶催化步驟"a"、"b"、"c"、"f，、"g，，、"e"組成。步驟"f'包含"支鏈酮酸脫氬酶"，所述酶EC編號為EC1.2.4.4。步驟"g，，包含"?；┟摎涿福?，，所述酶EC編號為EC1.2.1.10和1.2.1.57,此外步驟"e"包含"支鏈醇脫氫酶"。另一種潛在途徑由步驟"a"、"b，，、"c"、"h"、T、"j，，、"e"組成。術(shù)語"轉(zhuǎn)氨酶"(步驟"h")EC編號為EC2.6.1.42和2.6.1.66。步驟"h"或由"纈氨酸脫氳酶"組成，EC編號為EC1.4.1.8和1.4.1.9,或由步驟"i，，"纈氨酸脫羧酶"組成，EC編號為EC4.1丄14。最終步驟"j"將利用EC編號為EC2.6丄18的"D轉(zhuǎn)氨酶"生成異丁醛，步驟"e"將其還原生成異丁醇。所有將丙酮酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的潛在途徑均在圖1中進行了描述。此外，已知多個生物體經(jīng)由丁酰-CoA中間體產(chǎn)生丁酸鹽和/或丁醇(Diirre等人，F(xiàn)EMSMicrobiol.Rev.17,251-262,1995);和(Abbad-Andaloussi等人，Microbiology142，1149-1158，1996)。因此在這些生物體中利用圖l所示的步驟"k"、"g"和"e"將生成異丁醇。步驟"k"將使用EC編號為EC5.4.99.13的"異丁酰-CoA變位酶"。嵌套步驟將涉及使用EC編號為EC1.2.1.10和1.2.1.57的"?；┟摎涿?來制備異丁醛，隨后由酶催化步驟"e"來制備異丁醇。在共有美國專利申請11/586315中詳述了所有這些步驟，該專利申請全文以引用方式并入本文。用于異丁醇生產(chǎn)的微生物宿主用于生產(chǎn)異丁醇的微生物宿主可以選自細菌、藍細菌、絲狀真菌和酵母。用于生產(chǎn)異丁醇的微生物宿主將是異丁醇耐受性的，以便收率不總亍兩t志，w"aaim六文、:念命ik亞AASl亇跖t乂v;i+、>aa處i>t/1^St4XJt^j""igr'i工wvlP、rlJ'Jo^P"r口J/又/J、，"V7"lJIl、^0J,口>八wV'I外入J-TVy^一i、ZV本領(lǐng)域所熟知的。盡管已從產(chǎn)溶劑梭菌(solventogenicClostridia)中分離了丁醇耐受性突變體，但有關(guān)其他潛在可用的細菌菌抹的丁醇耐受性方面的信息幾乎沒有。關(guān)于細菌中醇耐受性的比較的大部分研究表明，丁醇的毒性大于乙醇(deCavalho等人，Microsc.Res.Tech.64,215-22,2004),并且(Kabelitz等人，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.220,223-227,2003,Tomas等人J.Bacteriol.186,2006-2018,2004)報道了在丙酮丁醇梭菌發(fā)酵期間1-丁醇的收率可能受1-丁醇毒性的限制。l-丁醇對丙酮丁醇梭菌的主要影響是破壞膜功能(Hermann等人，Appl.Environ.Microbiol.50,1238-1243,1985)。選擇用于生產(chǎn)異丁醇的微生物宿主應(yīng)該是異丁醇耐受性的，并應(yīng)能將碳水化合物轉(zhuǎn)化為異丁醇。選擇合適微生物宿主的標準包括如下對異丁醇的固有耐受性、對葡萄糖的高利用率、用于基因操縱的遺傳工具的可用性、以及產(chǎn)生穩(wěn)定的染色體變異的能力。具有異丁醇耐受性的合適宿主菌抹可以通過基于菌抹的固有耐受性進行篩選而鑒定。微生物對異丁醇的固有耐受性可以通過測定在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時造成生長率50%抑制的異丁醇濃度(IC5。)來測量。IC50值可以利用本領(lǐng)域已知的方法來確定。例如，可讓所關(guān)注的孩i生物在含有多種量的異丁醇的情況下生長，通過測量600納米(OD6G。)下的光密度來監(jiān)測生長率。倍增時間可以從生長曲線的對數(shù)部分計算并用作生比對異丁醇濃度的曲線圖來測定。優(yōu)選地，宿主菌抹將具有大于約0.5%的異丁醇IC50。23用于生產(chǎn)異丁醇的微生物宿主還應(yīng)以高速率利用葡萄糖。大多數(shù)微生物都能夠利用碳水化合物。然而，某些環(huán)境微生物不能高效利用碳水化合物，因此它們將不是合適的宿主。在遺傳上修飾宿主的能力對任何重組微生物的產(chǎn)生來說十分關(guān)鍵?；蜣D(zhuǎn)移技術(shù)的模式可以是電穿孔、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)或自然轉(zhuǎn)化?？衫枚喾N宿主接合性質(zhì)粒和藥物抗性標記。基于可在宿主中產(chǎn)生作用的抗生素抗性標記的性質(zhì)，針對該宿主生物體來定制克隆載體。還必須操縱微生物宿主以便通過刪除多種基因而使竟爭碳流的途徑失活。這就需要存在轉(zhuǎn)座子或染色體整合載體用以引導(dǎo)失活。此外，生產(chǎn)宿主應(yīng)能受到化學誘變以便得到改善的異丁醇固有耐受性的突變體?；谏鲜鰳藴?，用于生產(chǎn)異丁醇的合適微生物宿主包括但不限于梭菌屬(C7o^n^ww)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymowo，s)、埃希氏菌屬(￡^c/ze"'c/n'a)、沙、門氏菌屬(iS"a/附owe〃a)、纟工；求菌屬(W/zc^ococcw5)、假單胞菌屬(尸化wt/cwomw)、芽孢桿菌屬(S〃/m)、弧菌屬()、乳酸菌屬(丄a"oZ)"".〃wa)、腸3求菌屬(i"/^rococcw《)、產(chǎn)石咸斥干菌屬(j/ca/zge"^)、克雷伯氏菌屬(A7eZwe〃a)、類芽i包桿菌屬(Paem力"cz'〃w5)、節(jié)桿菌屬(J/^/zn^acfer)、棒狀桿菌屬(Co/7"e6a"en'ww)、4豆斥干菌屬(i^ew力(2c&rz'wm)、畢赤酵母屬(Pichia)、々支絲酵母屬(Qw^J")、漢遜酵母屬(//a朋e"w/a)和#唐酵母屬(Sacc/z"/w^c^)。4尤選的宿主包4舌大腸4干菌、真養(yǎng)產(chǎn)石咸桿菌(j/ca/,"e《e旨o//z船)、地衣芽孑包桿菌(Bacilluslicheniformis)、浸麻類芽孑包桿菌(尸aem力"cz'〃ws附acera朋)、紅串紅J求菌(i^ot/ococcwser_yf/zro/x>/&)、惡臭々￡單月包菌(T^ez^fowowos*/w〃da)、才直物等L4干菌(Z^/cfo6""'〃ws)、屎腸J求菌(iwfeAcoccws^2ec/w附)、享鳥，鳥腸球菌(i"fen9coccw^ga〃z力a〃.w附)、糞腸球菌(5Vferococcz^/^eca/^)、枯草芽孢軒菌(Sac/〃m)和啤酒糖酵母(Sacc/mromycesCg^W^S7'M)。生產(chǎn)宿主的構(gòu)建可以采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來構(gòu)建含有必需基因的重組生物體，所述必需基因?qū)⒕幋a用于將可發(fā)酵碳底物轉(zhuǎn)化為異丁醇的酶途徑。如上所述，在本發(fā)明中，編碼本發(fā)明其中一種異丁醇生物合成途徑的酶的基因可從多個來源分離獲得，所述酶例如乙酰乳酸合酶、乙酰羥酸還原異構(gòu)酶、乙酰羥酸脫水酶、支鏈a-酮酸脫羧酶和支4連的醇脫氪酶。從細菌基因組中獲得所需基因的方法是分子生物學領(lǐng)域中常用并且為人所熟知的。例如，如果基因的序列已知，則可以通過限制性內(nèi)切酶消化來產(chǎn)生合適的基因組文庫并且可以用與所需基因序列互補的探針來篩選。分離了序列之后，即可以用標準的引物引導(dǎo)的擴增方法如聚合酶鏈反應(yīng)(美國專利4,683,202)來擴增DNA,以獲得適于使用合適載體轉(zhuǎn)化的量的DNA。用于優(yōu)化密碼子以在異源宿主細胞內(nèi)表達的工具很容易得到。一些密碼子優(yōu)化工具可基于宿主生物體的GC含量獲得。鑒定并分離了相關(guān)途徑的基因之后，即可將它們通過本領(lǐng)域中已知的方法轉(zhuǎn)化到合適的表達宿主內(nèi)。可用于轉(zhuǎn)化多種宿主細胞的載體或試劑盒是常見的并且可以從一些公司商購獲得，例如EPICENTRE(Madison,WI)、InvitrogenLtd.(Carlsbad,CA)、Stratagene(LaJolla,CA)和NewEnglandBiolabs,Inc.(Beverly,MA)。通常，載體或盒包含指導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、可選標記和允許自主復(fù)制或染色體整合的序列。合適的載體包含含有轉(zhuǎn)錄起始控制的基因5'區(qū)域和控制轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段3'區(qū)域。這兩種控制區(qū)均可來源于與轉(zhuǎn)化的宿主細胞同源的基因，但是應(yīng)當理解，這種控制區(qū)也可能來源于對被選擇作生產(chǎn)宿主的特定物種來說是非天然的基因?？捎糜隍?qū)動相關(guān)途徑編碼區(qū)在所需宿主細胞中表達的起始控制區(qū)或啟動子有很多，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。事實上，任何能夠驅(qū)動這些遺傳元件的啟動子均適用于本發(fā)明，包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GALIO、ADH1、PGK、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在糖酵母屬中表達)；AOXl(用于在畢赤酵母屬中表達)；和lac、ara、tet、trp、1PL、1PR、T7、tac、以及trc(用于在大腸桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬和假單胞菌屬中表達)以及amy、apr、npr啟動子和多個噬菌體啟動子，用于在枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和浸麻類芽孢桿菌中表達。終止控制區(qū)也可以源于對優(yōu)選宿主天然的多種基因。任選地，終止位點可能是不必要的，然而，如果含有終止位點則是最優(yōu)選的。某些載體能夠在廣泛的宿主細菌中復(fù)制并可通過接合進行轉(zhuǎn)移?？?5利用完全并注解的序列pRK404和三個相關(guān)載體-pRK437、pRK442和pRK442(H)。這些衍生物已被證明是在革蘭氏陰性菌中進行遺傳操縱的有用工具(Scott等人，Plasmid50(1):74-79(2003)。廣宿主范圍的IncP4質(zhì)粒RSF1010的幾種衍生質(zhì)粒也可獲得，其具有在一系列革蘭氏陰性菌中發(fā)揮功能的啟動子。質(zhì)粒pAYC36和pAYC37具有連同多個克隆位點一起的活性啟動子，使得在革蘭氏陰性菌中的異源基因能夠表達。染色體基因置換工具也可廣泛獲得。例如，將廣宿主范圍的復(fù)制子pWV101的熱敏性變體進行改良以構(gòu)建可用于在一系列革蘭氏陽性菌內(nèi)實現(xiàn)基因置換的質(zhì)粒pVE6002(Maguin等人，J.Bacterio1.174,5633-5638,1992)。此外，體外轉(zhuǎn)座體可得自商業(yè)來源(例如EPICENTRE),用以在各種基因組中產(chǎn)生隨機突變。異丁醇生物合成途徑在多種優(yōu)選的微生物宿主中的表達在下面進行了更詳細的描述。異丁醇生物合成途徑在大腸桿菌中的表達可用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌的載體或試劑盒是4艮普遍的并且可以從上述公司中商購獲得。例如，異丁醇生物合成途徑的基因可從多個來源分離、克隆到經(jīng)修飾的pUC19載體中并轉(zhuǎn)化進大腸桿菌NM522中。異丁醇生物合成途徑在紅串紅球菌中的表達一系列大腸桿菌-紅球菌穿梭載體可用于在紅串紅球菌中表達，所述穿梭載體包括但不限于pRhBR17和pDA71(Kostichka等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.62,61-68,2003)。此外，一系列啟動子可用于異源基因在紅串紅球菌中表達(Nakashima等人，Appl.Environ.Microbiol.70,5557-5568,2004和Tao等人，Appl,Microbiol.Biotechnol.68,346-354,2005)。紅平紅球菌染色體基因中的靼向基因中斷可以利用Tao等人(同上)和Brans等人(Appl.Environ.Microbiol.66,2029-2036,2000)描述的方法予以生成。最初可以將如上所述的產(chǎn)生異丁醇所需的異源基因克隆至pDA71或pRhBR71內(nèi)，并轉(zhuǎn)4b進大腸桿菌中。然后，可以通過電穿孔將載體轉(zhuǎn)化進紅串紅球菌中，如Kostichka等人(同上)所述。重組體可在含有葡萄糖的合成培養(yǎng)基中生長，并隨后可利用本領(lǐng)域已知的方法來產(chǎn)生異丁醇。異丁醇生物合成途徑在枯草芽孢桿菌中的表達枯草芽孢桿菌中基因表達及突變產(chǎn)生的方法也是本領(lǐng)域所熟知的。例如，異丁醇生物合成途徑的基因可從多個來源分離、克隆到經(jīng)修飾的pUC19載體中并轉(zhuǎn)化進枯草芽孢桿菌BE1010中。此外，可將異丁醇生物合成途徑的五個基因分裂成兩個操縱子用于表達。可將該途徑的三個基因(bubB、ilvD和kivD)整合進枯草芽孢桿菌BE1010的染色體中(Payne等人，J.Bacteriol.173,2278-2282,1991)?？蓪⑹Ｓ嗟膬蓚€基因(ilvC和bdhB)克隆到表達載體中并轉(zhuǎn)化進攜帶整合的異丁醇基因的芽孢桿菌菌抹中。異丁醇生物合成途徑在地衣芽孢桿菌中的表達在枯草芽孢桿菌中復(fù)制的大多數(shù)質(zhì)粒和穿梭載體可用于通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或電穿孔來轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌?？蓪惗〈忌a(chǎn)所需的基因克隆在質(zhì)粒pBE20或pBE60衍生物中(Nagarajan等人，Gene114,121-126,1992)。轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌的方法是本領(lǐng)域已知的(Fleming等人，Appl.Environ.Microbiol.,61,3775-3780,1995)。所構(gòu)建的用于在枯草芽孢桿菌中表達的質(zhì)?？梢?皮轉(zhuǎn)化進地衣芽孢桿菌內(nèi)以產(chǎn)生可生產(chǎn)異丁醇的重組孩￡生物宿主。異丁醇生物合成途徑在浸麻類芽孢桿菌中的表達可按照上面關(guān)于在枯草芽孢桿菌中表達的描述來構(gòu)建質(zhì)粒，并通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將該質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化浸麻類芽孢桿菌，以產(chǎn)生可生產(chǎn)異丁醇的重組樣i生物宿主。異丁醇生物合成途徑在真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌中的表達用于在真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌中進行基因表達和產(chǎn)生突變的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(Taghavi等人，Appl.Environ.Microbiol.,60,3585-3591,1994)?？梢詫惗〈忌锖铣赏緩降幕蚩寺∵M上述任何廣宿主范圍的載體中，并通過電穿孔以形成生產(chǎn)異丁醇的重組體。產(chǎn)堿桿菌屬中的聚羥基丁酸酯途徑已經(jīng)有詳細描述，多種改良真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌基因組的遺傳技術(shù)是已知的，并且這些工具可以應(yīng)用于工程化異丁醇生物合成途徑。異丁醇生物合成途徑在惡臭假單胞菌中的表達在惡臭假單胞菌中表達基因的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(參見例如Ben-Bassat等人，美國專利6,586,229,該文獻以引用方式并入本文)?？蓪⒍〈纪緩交虿迦雙PCU18中，并且該連接DNA可通過電穿孔進入電穿孔感受態(tài)惡臭假單胞菌D0T-T1C5aARl細胞中以形成能生產(chǎn)異丁醇的重纟且體。異丁醇生物合成途徑在啤酒糖酵母中的表達用于啤酒糖酵母中基因表達的方法是本領(lǐng)域已知的(例如，Enzymology,Volume194,GuidetoYeastGeneticsandMolecularandCellBiology,PartA,2004,ChristineGuthrie和GeraldR.Fink,編輯，ElsevierAcademicPress,SanDiego，CA中的方法)。酵母中的基因表達通常需要在受關(guān)注的基因前的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子?？墒褂枚鄠€酵母啟動子來構(gòu)建編碼異丁醇生物合成途徑的基因的表達盒，包括但不限于組成型啟動子FBA、GPD、ADH1和GPM,和i秀導(dǎo)型啟動子GALl、GAL10和CUPl。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于FBAt、GPDt、GPMt、ERG10t、GALlt、CYC1和ADH1。例如，可將合適的啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子和異丁醇生物合成途徑基因克隆到大腸桿菌-酵母穿梭載體中。異丁醇生物合成途徑在植物乳桿菌中的表達乳桿菌屬屬于乳桿菌科(Lactobacillales),并且用于轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌和鏈球菌的許多質(zhì)粒及載體可用于轉(zhuǎn)化乳桿菌屬。合適載體的非限制性實例包括pAMpi及其衍生物(Renault等人，Gene183,175-182,1996);和(O，Sullivan等人,Gene137,227-231,1993);pMBBl和pHW800,pMBBl的衍生物(Wyckoff等人Appl.Environ.Microbiol.62,1481-1486,1996);pMGl,接合質(zhì)粒(Tanimoto等人，J.Bacteriol.184,5800-5804,2002);pNZ9520(Kleerebezem等人，Appl.Environ.Microbiol.63,4581-4584,1997);pAM401(Fujimoto等人，Appl.Environ.Microbiol.67,1262-1267,2001);和pAT392(Arthur等人，Antimicrob.AgentsChemother.38,1899-1903,1994)。也已經(jīng)報道了幾種來源于植物享'L斗干菌的質(zhì)并立(vanKranenburg等人,Appl.Environ.Microbiol.71,1223-1230,2005)。異丁醇生物合成途徑在多個腸球菌菌種中的表達(屎腸球菌、鶉雞腸球菌和糞腸球菌)腸球菌屬屬于乳桿菌科，上述用于轉(zhuǎn)化乳酸桿菌、桿菌和鏈球菌種的多種質(zhì)粒和載體也可用于腸球菌種。合適載體的非限制性實例包括pAMpi及其衍生物(Renault等人，Gene183，175-182,1996);和(0，Sullivan等人，Gene137,227-231，1993);p應(yīng)Bl和pHW800,pMBBl的衍生物(Wyckoff等人Appl.Environ.Microbiol.62,1481-1486,1996);pMGl，接合質(zhì)粒(Tanimoto等人，J.Bacteriol.184,5800-5804,2002);pNZ9520(Kleerebezem等人，Appl.Environ.Microbiol.63,4581-4584，1997);pAM401(Fujimoto等人，Appl.Environ.Microbiol.67,1262-1267,2001);和pAT392(Arthur等人，Antimicrob.AgentsChemother.38,1899-1903,1994)。還可使用采用來自乳球菌屬(Lactococcus)的msA基因的用于糞腸球菌的表達載體(Eichenbaum等人，Appl.Environ.Microbiol.64,2763-2769,1998)。另外，可使用用于在屎腸球菌染色體中進行基因置換的載體(薩aapareddy等人，Appl.Environ.Microbiol.72,334-345,2006))。發(fā)酵培養(yǎng)基本發(fā)明中的發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有合適的碳底物。合適的底物可包括但不限于單糖，例如葡萄糖和果糖；低聚糖，例如乳糖或蔗糖；多糖，例如淀粉、纖維素或它們的混合物；以及來自可再生原料的未純化混合物，例如干酪乳清滲透物、玉米漿、甜菜糖蜜及大麥麥芽。另外，碳底物也可以為已證明可以凈皮代謝轉(zhuǎn)化為關(guān)4建生化中間產(chǎn)物的諸如二氧4t碳之類的一碳底物或曱醇。除了一碳和二碳底物之外，甲基營養(yǎng)生物體也已知可以利用多種其他含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺及用于代謝活動的多種氨基酸。例如，曱基營養(yǎng)酵母已知可利用來自甲胺的碳來形成海藻糖或甘油(Bellion等人，Microb.GrowthCICompd.,[Int.Symp.〗，7th(1993),415-32.(eds):Murrell,J.Collin;Kelly,DonP.Publisher:Intercept,Andover,UK)。類似地，^絲酵母屬的多種物種將會^Ri射丙氨酸或油酸(Suiter等人，Arch.Microbiol.153,485-489,1990)。因此，預(yù)期本發(fā)明中所利用的碳源可涵蓋各種含碳底物并且將僅受限于生物體的選擇。盡管預(yù)期所有上述碳底物及它們的混合物均適用于本發(fā)明，但優(yōu)選的》灰底物為葡萄糖、果糖和蔗糖。除了合適的碳源外，發(fā)酵培養(yǎng)基還必須含有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適于培養(yǎng)物生長并促進生產(chǎn)異丁醇所必需的酶途徑的礦物質(zhì)、鹽、輔因子、緩沖劑及其他組分。培養(yǎng)條件通常，使細胞在約25。C至約40。C的溫度范圍下在合適的培養(yǎng)基中生長。本發(fā)明中合適的生長培養(yǎng)基是普通的商業(yè)制備的培養(yǎng)基，例如LuriaBertani(LB)肉湯、SabouraudDextrose(SD)肉湯或酵母培養(yǎng)基(YM)肉湯。也可以使用其他確定的或合成的生長培養(yǎng)基，微生物學或發(fā)酵科學領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道用于具體微生物生長的合適培養(yǎng)基。已知可以直接或間接調(diào)節(jié)分解代謝物阻遏的試劑，如環(huán)腺苷酸2',3'-單磷酸(cAMP),也可以4參入發(fā)酵培養(yǎng)基中。適于發(fā)酵的pH范圍在pH5.0到pH9.0之間，其中pH6.0至pH8.0優(yōu)選作為起始條件。發(fā)酵可以在有氧或厭氧條件下進行，厭氧或微氧條件是優(yōu)選的。工業(yè)分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵本發(fā)明的工藝采用分批發(fā)酵方法。經(jīng)典的分批發(fā)酵是封閉系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基的組成在發(fā)酵開始時設(shè)定并且在發(fā)酵過程中不進行人工改變。因此在發(fā)酵開始時，用所需生物體對培養(yǎng)基進行接種，在不向系統(tǒng)添加任何物質(zhì)的情況下進行發(fā)酵。然而，通常來說，"分批"發(fā)酵是指碳源的添加是成批的，但經(jīng)常試圖控制諸如pH和氧濃度之類的因素。在分批發(fā)酵系統(tǒng)中，代謝產(chǎn)物和生物質(zhì)組成持續(xù)改變直至發(fā)酵結(jié)束時。在分批培養(yǎng)物內(nèi)，細胞緩慢通過靜態(tài)延滯期到達高速生長對數(shù)期，并最后達到穩(wěn)定期，此時生長速率減緩或終止。如果不加以處理，穩(wěn)定期中的細胞將最終死亡。通常，對數(shù)期中的細胞負責產(chǎn)生大部分終產(chǎn)物或中間產(chǎn)30物。標準分批式系統(tǒng)的一種變型是補料分批系統(tǒng)。補料分批發(fā)酵工藝也適用于本發(fā)明，并且包括典型的分批式系統(tǒng)，不同的是隨著發(fā)酵進程遞增地添加底物。在代謝產(chǎn)物往往抑制細胞的代謝作用以及其中期望培養(yǎng)基中具有有限量的底物時，補料分批式系統(tǒng)是有用的。補料分批式系統(tǒng)中的實際底物濃度難于測量并因而可根據(jù)一些可測量因素(例如pH、溶解的氧以及廢氣例如co2的分壓)進行評估。分批發(fā)酵和補料分批發(fā)酵在本領(lǐng)域內(nèi)是常用的且眾所周知，并且實例可見于如下文獻ThomasD.Brock,Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,第二版,(1989),SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA.或Deshpande,Mukund(Appl.Biochem.Biotechnol.,36,227,1992),該文獻以引用方式并入本文。盡管本發(fā)明是以分批模式進行，但預(yù)期該方法將可適用于連續(xù)發(fā)酵方法。連續(xù)發(fā)酵是一種開放式系統(tǒng)，其中將設(shè)定好的發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)加入生物反應(yīng)器中，并同時移出等量條件培養(yǎng)基用于加工。連續(xù)發(fā)酵一般使培養(yǎng)物維持在其中細胞主要處于對數(shù)生長期的恒定高密度。連續(xù)發(fā)酵允許調(diào)節(jié)一種因素或任意數(shù)目的因素，這些因素影響細胞生長或終產(chǎn)物濃度。例如，一種方法將以固定的速率維持限制性營養(yǎng)物質(zhì)例如碳源或氮水平并且允許所有其他參數(shù)適度。在其他系統(tǒng)中，影響生長的許多因素可以連續(xù)改變，而通過培養(yǎng)基濁度測量的細胞濃度保持不變。連續(xù)系統(tǒng)力求維持穩(wěn)態(tài)的生長條件，并因而在發(fā)酵過程中由于培養(yǎng)基被取出而導(dǎo)致的細胞損失必須與細胞的生長率保持平衡。用于調(diào)節(jié)連續(xù)發(fā)酵工藝中的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子的方法以及使產(chǎn)物形成速率保持最高水平的方法是工業(yè)微生物領(lǐng)域眾所周知的，并且多種方法已由Brock(同上)詳細描述。預(yù)期可以或者采用分批發(fā)酵、補料分批發(fā)酵或者采用連續(xù)發(fā)酵工藝來實施本發(fā)明，并且任何已知的發(fā)酵模式均將適用。另外，預(yù)期可以將細胞固定在底物上而作為完整的細胞催化劑并讓其經(jīng)受發(fā)酵條件以生產(chǎn)異丁醇。用于從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離異丁醇的方法可使用丙酮-丁醇-乙醇(ABE)發(fā)酵領(lǐng)域已知的方法從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離生物生產(chǎn)的異丁醇(參見例如Durre,Appl.Microbiol.Biotechnol.49,639-648,1998),和(Groot等人，Process.Biochem.27,61-75,1992以及本文參考)。例如，可通過離心、過濾、潷析從發(fā)酵培養(yǎng)基中移除固體，可使用蒸餾、共沸蒸餾、液液萃取、吸附、汽提、膜蒸發(fā)、或全蒸發(fā)方法從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離異丁醇。實施例本發(fā)明將在下面的實施例中進一步限定。應(yīng)當理解，盡管這些實施例說明了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但僅是以例證的方式給出的。通過上述論述和這些實施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定本發(fā)明的實質(zhì)性特征，并且在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可對本發(fā)明進行各種變化和》務(wù)改以適應(yīng)多種用途和條件。一般方法實施例中所用的標準重組DNA4支術(shù)和分子克隆技術(shù)在領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，并且在下列文獻中有所描述Sambrook等人(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.的MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,1989,本文稱為Maniatis)矛口Maniatis(同上)以及Silhavy等人，(Silhavy等人，ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.1984)和Ausubel等人，(Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,pub.GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience,1987)。適合細菌培養(yǎng)物維持及生長的材料和方法在領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。以下實施例中適用的才支術(shù)描述可在下列文獻中查到ManualofMethodsforGeneralBacteriology(Phillippetal,eds.,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC.，1994)或ThomasD.Brockin(Brock,Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,第二版,SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA(1989)。<吏用的用于細菌細月包生長和維持的所有試劑、限制性內(nèi)切酶和材料均得自AldrichChemicals(Milwaukee,WI)、BDDiagnosticSystems(Sparks,MD)、LifeTechnologies(Rockville,MD)或SigmaChemicalCompany(St丄ouis,MO),除非另外指明。表3給出了以下實施例中使用的寡核苦酸引物。表3本發(fā)明中使用的寡核苷酸引物<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>縮寫的含義如下"sec"是指秒，"min"是指分鐘，"h"是指小時，"nm"是指納米，>L"是指微升，"mL"是指毫升，"mg/mL"是指毫克每毫升，"L"是指升，"nm"是指納米，"mM"是指毫摩爾，"M，，是指摩爾，"mmol"是指毫摩爾，'Vmole"是指微摩爾，"kg"是指千克，"g"是指克，>g"是指微克，"ng"是指納克，"PCR"是指聚合酶鏈反應(yīng)，"OD"是指光密度，"OD6o。"是指在600nm波長下測量的光密度，"kDa"是指千道爾頓，"g"是指引力常數(shù)，"bp"是指堿基對，"kbp"是指千堿基對，"kb"是指千堿基，"％"是指百分比，"％w/v"是指重量/體積百分比，"％v/v"是指體積/體積百分比，"HPLC"是指高效液相色譜，"g/L"是指克每升，>g/L"是指微克每升，"ngL"是指納克每微升，"pmolL"是指皮摩爾每微升，"RPM"是指每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，、mol/min/mg"是指微摩爾每分鐘每毫克，"w/v，，是指每單位體積重量，"v/v"是指每單位體積體積。實施例1(比4支)KARI酶活性分析該實施例描述制備ilvC基因過表達構(gòu)建體以及使用乙酰乳酸依賴型KARI酶氧化NADPH來測量酶活性，KARI酶由大腸桿菌的ilvC基因編碼。構(gòu)建pBAD-ilvC表達質(zhì)粒--,人大腸桿菌中分離ilvC基因ilvC基因編碼區(qū)使用RCR從大腸桿菌菌抹FM5(ATCC53911)基因組DNA擴增得到。細胞在包含4mLLuriaBertani(LB)培養(yǎng)基(MediatechInc.,Herndon,VA)的50mL培養(yǎng)管中生長過夜(37°C,300RPM振蕩培養(yǎng))。然后通過在1000xg下離心3分鐘來收獲細胞，并<吏用GentraPuregenei式劑盒(GentraSystems,Inc.,Minneapolis,MN;目錄號D-5000A)，按照制造商說明書來制備所述細胞的基因組DNA。使用大腸桿菌DNA作為模板及引物SEQIDNO:11和12,通過PCR來制備ilvC編碼區(qū)DNA片段。使用FinnzymesPhusionHigh-FidelityPCRMasterMix(NewEnglandBiolabsInc.,Beverly,MA;目錄號F-531),4姿照制造商*見程進行PCR。擴增在DNA熱循環(huán)儀GeneAmp9700(PEAppliedBiosystems,Fostercity,CA)中進行。將未經(jīng)進一步純化的PCR產(chǎn)物(0.5pL)連接到pCR4BluntTOPO(Invitrogen,Carlsbad,CA,目錄號#45-0031)中，并轉(zhuǎn)化進入到化學法感受態(tài)TOP10細胞(Invitrogen44-0301)中。將連接產(chǎn)物劃線接種到包含加入100pg/mL氨千青霉素(TeknovaInc,Hollister,CA,目錄號#L1004)的LB培養(yǎng)基的平板上。通過SacI/BamHI限制消化來確認包含ilvC插入序列的克隆。消化后4個質(zhì)粒中的三個應(yīng)具有預(yù)料的1.5kbp條帶。將所得的克隆命名為pCR4BluntTOPO-ilvC。通過SacI/BamHI消化釋方文出來自pCR4BluntTOPO-ilvC克隆載體的ilvC片段，并使用T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)將其連接到經(jīng)SacI/BamHI消化的pTrc99A(Amann,等人，Gene,69,301-315,1988)中。將該構(gòu)建體通過電穿孔轉(zhuǎn)入電穿孔感受態(tài)大腸桿菌TOP10細胞(Invitrogen44-0035)中，并劃線接種到如上所述的LB/氨節(jié)青霉素平板上。將包含1.5kb插入序列的載體命名為pTrc99A-ilvC。制備。BAD載體用于克隆使用Sacl/Hindlll限制位點，構(gòu)建在基因5'末端包含Sacl位點的pBAD.HisA(Invitrogen)載體的衍生物，以用于將ilvC基因克隆到pBAD中。制造該構(gòu)建體需要三個步驟。第一步，將來自粘紅酵母的苯基丙氨酸氨裂合酶(PAL;EC4.3.1.5)編碼區(qū)克隆到pBAD-HisA載體中以制備pBAD-PAL。第二步，將EcoRI位點添加到緊接著pBAD-PAL構(gòu)建體的起始密碼子之前的基因5'末端，以制備pBAD-PAL-EcoRI。第三步，用SacI位點置換EcoRI位點，并用Sacl/Hmdlll消化所得的載體以制備用于ilvC基因克隆的pBAD-SacI載體。首先從pKK223-PAL載體中PCR擴增PAL基因(USPatent#6521748)，使用的是正向引物(PAL-F1)(SEQIDNO:37)和反向引物(PAL-R1)(SEQIDNO:38)。在PerkinElmerPCR9700熱循環(huán)儀(PEAppliedBiosystems,Fostercity,CA)中使用TaKaRaTaqDNA聚合酶預(yù)混物(TAKARABioUSA,Madison，WI，目錄號jTTAK—R004A)按照制造商規(guī)程進行PCR。使用QIAQuikPCR純化試劑盒(Qiagencat#28106)部分地純化PCR產(chǎn)物，并用Bbsl和Hindlll消化產(chǎn)物。這生成了在5'末端包含Ncol突出的片段。然后將消化產(chǎn)物連接到pBAD.HisA(Invitrogen)載體中，該載體已經(jīng)用Ncol/Hindlll消化過。使用T4DNA連接酶(Promega)按照制造商提供的標準規(guī)程進行連接反應(yīng)。按照制造商說明書利用Bio-RADGenePulserII(Bio-RadLaboratoriesInc,Hercules,CA),使用兩連接產(chǎn)物來轉(zhuǎn)36化TOP10電穿孔感受態(tài)細胞(Invitrogen)。將轉(zhuǎn)化過的細胞劃線接種在包含加入100pg/mL氨千青霉素(TeknovaInc，Hollister,CA,目錄號#L1004)的LB培養(yǎng)基的瓊脂板上，在37。C下培養(yǎng)過夜。通過NcoI/Hindin限制消化來確認包含PAL插入序列的克隆。將此構(gòu)建體命名為pBAD-PAL。然后使用QuikChangeIIXL定點誘變試劑盒(Stratagene,LaJollaCA,Catalogue#200524)將EcoRI位點添加到上述構(gòu)建體中的PAL基因5'末端上。設(shè)計正向引物(PAL-EcoRI-Fl)(SEQIDNO:39)和反向引物(PAL-EcoRl-Rl)(SEQIDNO:40)并按照制造商的說明書來制備反應(yīng)混合物。上文制備的pBAD-PAL構(gòu)建體在下文反應(yīng)中用作模板。50|iL反應(yīng)混合物包含1.0|iL50ng/(iL的模板質(zhì)粒、l.OjiL10pmolL的各種引物、5pL10x反應(yīng)緩沖液、1.0)iLdNTP混合物和3pLQmk溶液，30pL水以及l(fā).O(iLpfu-ultra高保真DNA聚合酶，置于200pL薄壁管中。在上文的QuikChangeIIXL試劑盒中提供該反應(yīng)中使用的所有試劑和聚Fostercij,CA)中進行，使用的是以下條件。起始溫度為96°C2分鐘，隨后進行18個加熱/冷卻循環(huán)。每個循環(huán)由96°C30秒，6CTC30秒，72。C160秒組成。在溫度循環(huán)完成后，將樣本保持在72。C下600秒或更長，然后在4。C下復(fù)性。反應(yīng)完成后，加入l.O[iL限制性酶Dpnl(來自上述試劑盒)到反應(yīng)中，然后在37。C下孵育3小時以消化反應(yīng)中的模板質(zhì)粒。然后用BioRADGenePulserII(Bio-RadLaboratoriesInc,Hercules,CA)按照制造商說明書將2.0^LDpnl消化反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到50^L大腸桿菌TOP10電穿孔感受態(tài)細胞(Invitrogen)中。將不同體積的(2攀,5.0pL和20pL)轉(zhuǎn)化細胞劃線接種在包含LB培養(yǎng)基和100(ig/mL氨節(jié)青霉素的10cm瓊脂平板上，并將平板在37。C下孵育過夜。從包含分離良好的菌落的平板上采集三個克隆。使用Qiaprepspin小量制備試劑盒(Qiagen,ValenciaCA,目錄號#27106),按照制造商的說明書來純化來自三個克隆的質(zhì)粒。使用限制性酶EcoRI和HindIII(Promega,Madison，WI)通過限制性消化分析來鑒定陽性克隆，酶消化通過將l.OpL10x反應(yīng)緩沖液(Promega緩沖液)，l.OpL純化質(zhì)粒和l.OpL各種限制性酶置于6.0(aL去離子水中進行。將反應(yīng)混合物在37。C下孵育60分鐘。每個克隆的消化產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖E凝膠(Invitrogen,目錄號#G5018-08)上分離。一個2.1kbp和一個4.0kbp的DNA片l更在凝月交上一皮發(fā)現(xiàn)存在于樣本中，該樣本在構(gòu)建體中存在EcoRI和HindIII限制性位點。然后使用質(zhì)粒才莫板pBAD-PAL-EcoRI和引物SEQIDNO:13按照上述相同規(guī)程用Sacl位點來置換該構(gòu)建體中的EcoRI位點。使用限制性酶Sacl和HindIII(Promega,Madison,WI)進行限制性消化分析以確認陽性克隆。一旦鑒定了陽性克隆，就建立更大規(guī)模(50^L)的上述限制性消化反應(yīng)。使用1%瓊脂糖凝膠和QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen,ValenciaCA,目錄號#28704),按照制造商規(guī)程從混合物中純化包含消化載體凝膠的4kbp片段。將該構(gòu)建體命名為pBAD陽SacL用于過表達KARI的宿主菌抹4吏用宿主菌才朱大腸桿菌Bw25U3(AilvC)即ilvC基因敲除菌才朱來制備過表達KARI酶的構(gòu)建體。在該菌抹中，大腸桿菌染色體中的完整ilvC基因被卡那霉素盒置換，該置換使用的是Lambdared同源重組技術(shù)(Datsenko和Wanner,Proc.Natl.AcadSci.USA.97,6640-6645,2000)。所有使用該技術(shù)制備基因敲除菌抹所需的菌株和載體均從Prof.BarryWanner(PurdueUniversity,WestLafayette,IN)處獲得。制備用于克隆的ilvC編碼區(qū)用高保真pfu-ultra聚合酶(Stratagene,LaJolla,CA)來擴增ilvC編碼區(qū)，將Sacl位點添加到正向引物ATG之前的5'末端,將HindIII位點添加到反向引物終止密碼子之后的5，末端。該反應(yīng)使用具有SEQIDNO:15(正向ilvc-trc-SacI-F)的引物和具有SEQIDNO:16(反向ilvc-trc-HindIII-R)的引物。PCR反應(yīng)中使用的才莫板是上述ptrc99A-ilvC構(gòu)建體。50pL反應(yīng)混合物包含5.0pL10x反應(yīng)緩沖液、pfu-ultra聚合酶(Stratagene)、l.O^iL50ng/(iL才莫板、l.OpL每個lOpmol/pL的正向和反向引物、1都L40mMdNTP混合物(Clonetech,MountainView,CA)、l.O^Lpfu-ultraDNA聚合酶(Stratagene)和39pL水。將該反應(yīng)混合物置于薄壁200pL管中用于在DNAThermocyclerGeneAmp2400(PEAppliedBiosystems,Fostercity,CA)中的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件如下起始溫度為94°C2分鐘。隨后進行30個加熱/冷卻循環(huán)。每個循環(huán)由94°C30秒，58°C30秒，68°C1分鐘40秒組成。在溫度循環(huán)完成后，將樣本保持在6(TC下IO分鐘或更長，然后在fC下復(fù)性。用QIAquikPCR純化試劑盒(Qiagen,cat#28106)部分地純化PCR產(chǎn)物，并用HindIII和Sacl進行消化，然后通過如上所述的規(guī)程來純化凝膠。將消化的PCR片段連接到用同樣的酶消化的pBAD-SacI載體中。20pL連接反應(yīng)包含l.O^LT4DNA連接酶(Promega),與T4DNA連接酶一起的2.0pL10x反應(yīng)緩沖液，45ng載體和45ng插入序列以及去離子7jc。反應(yīng)在Eppendorf熱循環(huán)4義(EppendorfNorthAmerica,Westbury,NY)中在16。C下孵育過夜。使用Bio-RADGenePulserII(Bio-RadLaboratoriesInc,Hercules,CA)將兩連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10電穿孔感受態(tài)細胞(Invitrogen)中。在包含LB培養(yǎng)基和100貼/mL氨千青霉素的瓊脂平4反上選4奪轉(zhuǎn)化過的克隆。通過Sacl消化和DNA測序來確i人克隆中大腸桿菌ilvC基因插入序列的存在，DNA測序使用引物SEQIDNO:17至22。將具有ilvC基因插入序列的構(gòu)建體命名為pBAD-K12-ilvC制備用于KARI表達分析的菌抹上文的pBAD-K12-ilvC構(gòu)建體和pTrc99A-ilvC的質(zhì)粒均在TOP10宿主菌柹、中，它們-使用Qiaprepspin小量制備試劑盒(Qiagen,ValenciaCA,catalogue#27106)按照制造商說明書，從在包含100jig/mL氨千青霉素的LB培養(yǎng)基中的3mL過夜培養(yǎng)物中制備。使用BioRADGenePulserII(Bio-RadLaboratoriesInc,Hercules,CA)4要照制造商說明書，將一pBAD-K12-ilvC和一|iLpTrc99A-ilvC分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Bw25113(AilvC)電穿孔感受態(tài)細胞中。將轉(zhuǎn)化過的細胞劃線接種在包含加入100(ig/mL氨千青霉素的LB培養(yǎng)基的瓊脂板上，在37。C下培養(yǎng)過夜。使用來自這些平板的菌落來制備細胞游離提取物。制備細胞游離提取物使包含pBAD-K12-ilvC和pTrc99A-ilvC的細胞在3.0mLLB培養(yǎng)基中生長，該培養(yǎng)基包含100pg/mL氨卡青霉素以及誘導(dǎo)劑0.02%(w/v)39阿拉伯糖和lmM異丙基P-D-1—琉代半乳糖苦(IPTG),培養(yǎng)條件分別為37。C，在2S0卬m下振蕩。通過在6000xg下離心5分鐘來收獲細胞，離心溫度為22.5°C，將細胞沉淀物重懸于1.5mL微量離心管中的300(iL100mMHEPES緩沖液中(pH7.5),用40%水和60%水(按體積計)進行水浴，并超聲處理2-3分鐘(3.0秒脈沖，強度1.0檔，隨后是3.0秒停頓)，超聲處理使用的是Misonix300超聲波破碎儀(Misonix，F(xiàn)armingdaleNY)。通過離心來移除細胞碎片(Eppendorf微型離心機，型號5415D,在9300xg下處理5分鐘，溫度為22.5°C)。作為另外一種選擇，使用基于去污劑的蛋白提取試劑BugBuster主混合物(Novagen,目錄號#71456)來制備細胞提取物。將來自3.0mL培養(yǎng)物的細胞沉淀物重懸在300pLBugBuster主混合物中并室溫培養(yǎng)20分鐘。通過離心移除細胞碎片(Eppendorff微型離心機，型號5415D),在9300xg,22.5。C下離心5分鐘。蛋白質(zhì)量化通過BradfordCoomassie觀'J定〉去(BCAM吏用CoomassiePlus(Pierce#23238,Rockford，IL)來測量樣本中的總蛋白濃度。按照制造商規(guī)程在96孔微板中制備樣本和蛋白標準品(BovineSerumAlbumin,BSA)。蛋DevicesCorporation,Sunnyvale,CA)進4亍現(xiàn)'J量。KARI酶測定規(guī)程按照以下文獻中所述的方法來合成測定底物(R,S)-乙酰乳酸Aulabaugh和Schloss(Aulabaugh和Schloss,Biochemistry,29，2824-2830,1990):將1.0g2-乙酰氧基-2-甲基-3-氧代丁酸乙酯(Aldrich,Milwaukee,WI)與10mL1.0MNaOH混合并在室溫下攪拌。當溶液pH變?yōu)橹行詴r，緩慢加入NaOH以維持約8.0的pH值。測定法中使用的所有其他化學藥品均購自Sigma。用KARI將乙酰乳酸酶轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基異戊酸，然后使用分光光度計(AgilentTechnologies,SantaClara,CA)測量在340nm處輔因子NADPH在反應(yīng)中的消耗。使用NADPH的GSZOM-Vm-1摩爾消光系數(shù)來計算活性。使用的原液是lOOmMHEPES-鉀鹽，用HC1/KOH調(diào)節(jié)至40pH7.5;1.0MMgCl2;20mMNADPH和90mM乙酰乳酸。40mL反應(yīng)緩沖液混合原液包含lOOmMHEPES原液和400pLMgCl2原液。將反應(yīng)緩沖液(194nL)與NADPH(2.0pL)原液和細胞提取物(2.0|iL)在一次性塑料管(EppendorfUVette,EppendorfAG,Hamburg,Germany)中混合，并且記錄在340nm處22.5。C下的吸光度20秒。最初的A，通常為約0.9-1.0。然后將乙酰乳酸(2.0pL)加入管中開始反應(yīng)。測定法中的成分終濃度為pH值為7.5的100mM鉀HEPES、10mMMgCl2、200uMNADPH和900uM乙酰乳酸。完全混合該溶液，并且額外記錄在340nm處的吸光度80秒。將該處報告的KARI活性定義為每mg細胞提取物中的總蛋白每分鐘消耗的NADPHpmole數(shù)。表4顯示了細胞提取物中的蛋白濃度和KARI活性的結(jié)果，該細胞提取物從用pBAD-K12-ilvC質(zhì)粒和ptrc99A-ilvC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌Bw25113(AilvC)細胞中制備。制備兩個細胞提取物樣本用于pBAD-K12-ilvC構(gòu)建體，一個通過超聲波降解，另一個使用BugBuster。使用BugBuster制備用于pTrc99A-ilvC構(gòu)建體的細胞提取物樣本。這些分析顯示KARI蛋白在包含pBAD-K12-ilvC質(zhì)粒的細胞中的表達水平高于在那些包含pTrc99A-ilvC質(zhì)粒的細胞中的表達水平，然而，通過兩種不同方法制備的細胞提取物樣本中的酶比活并無顯著差異。使用由pBAD-HisB(Invitrogen)轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌菌抹Bw25113作陰性對照。陰性對照中的NADPH消耗速率是極低的(測得的消耗速率為那些包含pBAD-K12-ilvC基因的菌抹的約1%至2%)。表4KARI和在包含ilvC基因的克隆中的總蛋白濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>實施例2鑒定來自多種微生物的高比活KARI酶該實施例的目的是為了描述如何筌定包含具有高比活的KARI酶的微生物。那些包含KARI的生物當在基本培養(yǎng)基中生長時具有比大腸桿菌更快的倍增時間，假設(shè)它們包含高活性KARI酶。筌定了當在M9基本培養(yǎng)基中生長時具有比大腸桿菌更快的倍增時間的三種微生物，它們是銅綠假單胞菌(PAOl)、熒光假單胞菌(PF5)和霍亂弧菌(N16961)(參見下文)。這些生物的基因組DNA制備可商購獲得。表5顯示了這些生物當在M9基本培養(yǎng)基中生長時與大腸桿菌相比的倍增時間。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>參考1.Nddhardt,FC，等人，J,Bacteriol.119,736-747,1974。2.BrmkmanFSL,等人，J.Bacteno1.181,4746-4754,1999。3.SilvaAJ和BenitezJA,J.Bacteriol.188,794-800,2006。如上所述，已經(jīng)將KARI酶分成不同類別。l叚單胞菌屬PF5和PAOl酶屬于I類KARI,它是家族中最大的一類，而大腸桿菌和霍亂弧菌酶屬于II類細菌KARI。銅綠假單胞菌(PAOl,ATCC47085)和熒光々支單胞菌(PF5，ATCCBAA-477)的純化基因組DNA購自ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801UniversityBlvd,Manassas,VA)。來自每個生物的基因組DNA(每個10pg)在100pL10mMTris-HCl,pH8.5中進4亍再水合以用于PCR反應(yīng)。以下引物對具有連接到正向引物(SEQIDNO:23和25)的Sacl位點和連結(jié)到反向引物(SEQIDNO:24和26)的HindIII位點，使用它們通過PCR利用高保真pfu-ultraDNA聚合酶(Stratagene)從PAOl和PF5的基因組DNA擴增ilvC基因編碼區(qū)?；谶@些生物的公用(GeneBank)序列PF5和PAOlilvC基因來設(shè)計引物。每個50pLPCR反應(yīng)包含1.0pL基因組DNA和每個基因的l.OpL，每個10pmolL的正向和反向引物。PCR反應(yīng)在Eppendorf主循環(huán)梯度(EppendorfNorthAmerica,Westbury,NY)下進行，使用以下反應(yīng)條件。起始溫度為95°C2分鐘。隨后進行5個加熱/冷卻循環(huán)。每個循環(huán)由95。C30秒，55。C30秒，72°C1分鐘30秒組成。然后再進4亍25個加熱/冷卻循環(huán)。每個這些循環(huán)由95。C30秒，65。C30秒，72。C1.0分鐘30秒組成。在這些溫度循環(huán)完成后，將樣本保持在72。C下10分鐘或更長，然后在4。C下復(fù)性。使用實施例I中所述的規(guī)程將所得的PCR片段用HindIII和Sacl消化并克隆到pBAD-SacI表達載體中，然后轉(zhuǎn)化進入ilvC敲除菌抹BW25113(AilvC)中。通過限制性酶消化來鑒定陽性克隆并通過全長DNA測序進行確^人，測序使用的是引物，SEQIDNO:21(pBAD-eFl)、SEQIDNO:22(PALPK-R1)、SEQIDNO:27(PF5-S-F2)和SEQIDNO:28(PF5-S-R2)。將所得的菌抹命名為BW25113(AilvC)-PAOl-ilvC和BW25113(AilvC)-PF5-ilvC?；魜y弧菌VC0162基因編碼區(qū)經(jīng)密碼子最優(yōu)化以用于大腸桿菌表達，該優(yōu)化基于已知蛋白序列(AccessionNP一229819.1)并通過委托基因合成(DNA2.0,Inc.MenloPark,CA)來制備。它用粘附到基因末端的Sacl和HmdIII位點來制備。也使用Sacl和HindIII限制位點將該DNA片段克隆到pBAD-SacI表達載體中并轉(zhuǎn)化進ilvC敲除菌抹BW25113(AilvC)中。將所得的菌才朱命名為BW25113(AilvC)-VCopt-VC0162。給予經(jīng)密碼子最優(yōu)4匕的VC0162序列以SEQIDNO:30。來自K12、PA01、PF5和VC菌抹的蛋白質(zhì)和KARI活性測定通過BugBuster如實施例1中所述來制備均表達KARI酶的菌才朱BW25113(AilvC)醫(yī)K12畫ilvC、BW25113(AilvC)-PA01-ilvC.BW25113(AilvC)隱PF5畫ilvC和BW25113(AilvC)-VCopt-VC0162的細胞游離提取物。通過使用188nL反應(yīng)緩沖液、2.0pL20mM的NADPH原液、稀釋在測定緩沖液中的5.0pL20%細胞提取物和5.0pL90mM乙酰乳酸來進行KARI測定。因此該實施例中的測定的最終溶液由酶、100mM的鉀誦HEPES、10mM的MgCl2、200uM的NADPH和2.25mM的乙酰乳酸組成。表6顯示了四種不同生物的KARI比活，所述生物在存在0.02%(w/v)阿拉伯糖作誘導(dǎo)劑的情況下生長過夜。如上所述來測量細胞提取物中的總蛋白量和KARI活性。如表6所列出的那樣，來自經(jīng)筌定當在基本培養(yǎng)基(表5)中生長時具有更快倍增時間的生物的KARI酶均具有比來自大腸桿菌的KARI酶更高的比活。根據(jù)SDS-PAGE(未顯示數(shù)據(jù))的評估，每個提取物具有大約相等的KARI蛋白表達水平。這些結(jié)果支持這一假設(shè)可將在基本培養(yǎng)基中生長期間的倍增時間用作鑒定具有更高比活的KARI酶的方法。表6比較來自不同生物的KARI比活菌抹分子量(KDa)KARI類細月包提取物中的總蛋白ng/mLKARI比活拜ol/min/mg總蛋白BW25113(Az/VC)-K12-,7vC54II66930.72BW25113(Az/vC)54II67301.1BW25113(A"vC)-PAOl丟C36I49881.2BW25113(A"vC)-PF5-z/vC36I76711.8實施例3分沖斤純化的K12-KARI和PF5-KARI的比活為了更好地確定觀察到的實施例2中的粗細胞提取物KARI比活的提高，將K12-KARI和PF5-KARI純化到同質(zhì)以允許精確定量單個蛋白44的濃度并測定純化的KARI酶的比活。純化K12-KARI和PF5-KARIK12-KARI和PF5-KARI使用弱陰離子交換離心柱VivapureIEXD,miniH(VivasdenceAG,Hannover,Germany)進行純化,然后在Microcon裝置中4吏用100KDa分子量截止電壓(YM100,Millpore,Bedford,MA)進行濃縮。純化程序在室溫(22.5°C)下進行。陰離子交換離心柱中使用的原液是pH7.0的lOOmM鉀-HEPES、1.0MMgCl2、250mMEDTA、10%Brij35和2MKC1。洗滌緩沖液(BufferA)通過以下方法制備將5.0mLlOOmMHEPES原液加入到15mL水中，另外加入50pLMgCl2原液、20pLEDTA原液和10nL10%Brij35。洗脫緩沖液#1(緩沖液B)通過以下方法制備將5.0mLlOOmMHEPES、2.0mLKC1原液加入到13mL水中，另外加入50pLMgCh原液、20pLEDTA原液和lOpL10%Brij35。洗脫緩沖液#2(緩沖液C)通過以下方法制備將5mLlOOmMHEPES原液、5.0mLKC1原液加入到10mL水中，另外加入50MgCl2原液、20|iiLEDTA原液和10pL10%Brij35。緩沖液B中的KC1終濃度為約200mM,緩沖液C中為約500mM。菌抹BW25113(AilvC)-K12-ilvC和BW25113(AilvC)-PF5-ilvC的細胞游離提取物通過BugBuster如實施例1中所述進行制備。為了制備載入VivapureIEXD柱的稀釋細胞提取物，將600pL雙重去離子水加入到200|iL的提取物中。VivapureIEXD柱首先用400fiL緩沖液A洗滌，洗滌通過在2000xg下離心(Eppendorf微型離心機型號5415D)5分鐘。在整個Vivapure正XD純化程序中使用相同設(shè)備和方法。將稀釋細胞提取物(如上所述)加載到柱上，分兩批離心，每批400pL。然后用400pL緩沖液A洗滌(x2)。就PF5-KARI樣本而言，將400pL緩沖液B上樣以將所述酶從柱中洗脫到收集管中。就K12-KARI樣本而言，改為使用400iliL緩沖液C。MicroconYM100裝置首先用400pL去離子水洗滌，洗滌通過在13800xg下離心(Eppendorf微型離心機型號5415D)5分鐘。然后將從VivapureIEXD純化中收集的樣本進樣并在13800xg下離心4分鐘。棄去流通液并將400pL緩沖液B加入到樣本室中，在13800xg下離心4分鐘。在加入200(iL緩沖液B到樣本室前重復(fù)洗滌程序(x2)。將樣本45室中的樣本倒入潔凈管中并在5000xg下離心2分鐘以收集純化的樣本。通過毛細管電；永(Agilent2100Bioanalyzer,AgilentTechnology,SantaClara，CA)驗證每個純化KARI樣本的純度。使用Protein230試劑盒制備樣本，并按照制造商說明書施用到ProteinLabchip(與試劑盒一起提供)，用Bioanalyzer進行分析。在電描記圖上能觀察到每個純化樣本極低背景的單峰。純化的KARI樣本的蛋白質(zhì)量化使用分光光度計(AgilentTechnology,SantaClara,CA)和1cm-各徑長度的一次性塑涉牛管(UVette,eppendorf,Hamburg,Germany)，于KARI純化樣本進4亍在280nm處的UV吸收測定，以定量純化樣本中的KARI。PF5-KARI(0.73,lmg/mL)和K12-KARI(0.98,lmg/mL)在280nm處的消光系數(shù)通過程序Protparam進4亍預(yù)測，該程序來自ExPASy網(wǎng)站(Pace,C.N.等人，ProteinSci.11,2411-2423,1995)。將純化樣本在緩沖液B中稀釋成20%(v/v)用于UV吸收測定。稀釋的PF5-KARI樣本的A28Q為0.41,稀釋的K12-KARI的A28o為0.36。純化的KARI的活性測定該實施例中使用的測定條件與實施例2中相同，不同的是使用5[iL20%(v/v)純化樣本代替細胞提取物。純化樣本的蛋白濃度以及它們的比活在表7中示出。測得的最快生長生物的純化PF5-KARI的比活是K12-KARI的兩倍。這些結(jié)果與實施例2中使用這兩種酶的粗制備物獲得的數(shù)據(jù)一致，因此為以下假設(shè)提供了進一步支持在基本培養(yǎng)基中生長期間的倍增時間可用作鑒別具有比大腸桿菌酶更高比活的KARI酶的方法。表7大腸桿菌和假單胞菌屬菌抹中的KARI濃度和比活<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>權(quán)利要求1.用于將乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為二羥基異戊酸的方法，所述方法包括a)提供包含編碼多肽的基因構(gòu)建體的微生物宿主細胞，所述多肽具有大于大腸桿菌酮醇酸還原異構(gòu)酶比活的酮醇酸還原異構(gòu)酶比活；以及b)使所述(a)的宿主細胞接觸乙酰乳酸，其中產(chǎn)生2，3-二羥基異戊酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述基因構(gòu)建體編碼具有基于純化蛋白大于1.1pmol/min/mg的酮醇酸還原異構(gòu)酶比活的多肽，所述比活通過在以下條件下進4亍的NADPH消4毛測定法來測量a)約7.5的pH值；b)約22.5。C的溫度；和c)大于約10mM的鉀。3.用于生產(chǎn)異丁醇的方法，所述方法包括a)提供包括下列基因構(gòu)建體的重組微生物宿主細胞1)至少一種編碼乙酰乳酸合酶的基因構(gòu)建體，所述乙酰乳酸合酶將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰乳酸(途徑步驟a);2)至少一種編碼酮醇酸還原異構(gòu)酶的基因構(gòu)建體，所述酮醇酸還原異構(gòu)酶的比活基于純化蛋白大于l.lpmol/min/mg,所述比活通過在以下條件下進行的NADPH消耗測定法來測量i)約7.5的pH值；ii)約22.5。C的溫度；和iii)大于約10mM的鉀，所述鉀用于將(S)-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為2,3-二鞋基異戊酸，(途徑步驟b);3)至少一種編碼乙酰羥酸脫水酶的基因構(gòu)建體，所述乙酰羥酸脫水酶用于將2,3-二羥基異戊酸轉(zhuǎn)化為a-酮異戊酸，(途徑步驟c);4)至少一種編碼支鏈酮酸脫羧酶的基因構(gòu)建體，所述酮酸脫羧酶用于將a-酮異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁醛，(途徑步驟d);5)至少一種編碼支鏈醇脫氬酶的基因構(gòu)建體，所述醇脫氬酶用于將異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇(途徑步驟e);以及b)使(a)的宿主細胞在產(chǎn)生異丁醇的條件下生長。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其中所述至少一種編碼具有酮醇酸還原異構(gòu)酶活性的多肽的基因構(gòu)建體分離自假單胞菌屬。5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其中所述宿主細胞選自細菌、藍細菌、絲狀真菌和酵母。6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述宿主細胞是選自下組的屬的成員梭菌屬、發(fā)酵單胞菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、克雷伯氏菌屬、類芽胞桿菌屬、節(jié)桿菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、弧菌屬和糖酵母屬。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述宿主細胞是大腸桿菌。8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述細胞是植物乳桿菌。9.權(quán)利要求6的方法，其中所述細胞是啤酒糖酵母。10.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述乙酰乳酸合酶具有如SEQIDNO:2所示出的氨基酸序列。11.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其中所述具有酮醇酸還原異構(gòu)酶活性的多肽具有選自SEQIDNO:34、SEQIDNO:35和SEQIDNO:36的氨基酸序列。12.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述乙酰羥酸脫水酶活性具有如SEQIDNO:6所示出的氨基酸序列。13.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述支鏈醇脫氬酶具有如SEQIDNO:IO所示出的氨基酸序列。14.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述支鏈a-酮酸脫羧酶具有如SEQIDNO:8所示出的氨基酸序列。15.包含酮醇酸還原異構(gòu)酶的重組宿主細l包，所述酮醇酸還原異構(gòu)酶具有的比活大于大腸桿菌酮醇酸還原異構(gòu)酶的比活。16.權(quán)利要求15的重組宿主細胞，其中所述酮醇酸還原異構(gòu)酶具有基于純化蛋白大于1.1jimol/min/mg的比活，所述比活通過在以下條件下進行的NADPH消耗測定法來測量a)約7.5的pH值；b)約22.5。C的溫度；和c)大于約10mM的《甲。17.用于鑒定和分離編碼酮醇酸還原異構(gòu)酶的基因構(gòu)建體的方法，所述酮醇酸還原異構(gòu)酶具有基于純化蛋白大于1.1pmol/min/mg的比活，所述比活通過在以下條件下進行的NADPH消耗測定法來測量i)約7.5的pH值；ii)約22.5。C的溫度；和iii)大于約10mM的鉀；所述方法包括以下步驟a)鑒定當在M9基本培養(yǎng)基中生長時倍增時間短于大腸桿菌倍增時間的菌種；b)篩選(a)的菌種的酮醇酸還原異構(gòu)酶活性以筌定活性菌種；c)使用與已知編碼酮醇酸還原異構(gòu)酶的基因構(gòu)建體具有同源性的核酸序列來探測(b)的活性菌種的基因組DNA,以從所述活性菌種中鑒定和分離編碼酮醇酸還原異構(gòu)酶的基因構(gòu)建體；以及d)從所述活性菌種中擴增并表達編碼酮醇酸還原異構(gòu)酶的基因構(gòu)建體；以及e)從步驟(d)的表達的基因構(gòu)建體中篩選具有基于純化蛋白大于1.1nmol/min/mg的比活的基因構(gòu)建體，所述比活通過在以下條件下進行的NADPH消庫毛測定法來測量i)約7.5的pH值；ii)約22.5。C的溫度；和iii)大于約10mM的《甲。18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述活性菌種選自梭菌屬、發(fā)酵單胞菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、弧菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、克雷伯氏菌屬、類芽胞桿菌屬、節(jié)桿菌屬、棒狀桿菌屬和短桿菌屬。19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中當在M9基本培養(yǎng)基中生長時步驟(a)的倍增時間等于或小于大腸桿菌的倍增時間的80%。全文摘要本發(fā)明提供發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇的方法，所述方法是通過發(fā)酵法培養(yǎng)除了用于將葡萄糖轉(zhuǎn)化為異丁醇所需的其他酶之外還表達高活性酮醇酸還原異構(gòu)酶的重組微生物。文檔編號C12P7/16GK101680007SQ200880012258公開日2010年3月24日申請日期2008年4月16日優(yōu)先權(quán)日2007年4月18日發(fā)明者M·G·布拉穆奇,M·J·奈爾遜,廖德瑛申請人:納幕爾杜邦公司