專利名稱：：一種篩選乳酸生產(chǎn)率高的菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種篩選乳酸生產(chǎn)率高的菌株的方法。技術(shù)背景隨著石油資源的不斷減少以及不可再生資源價(jià)格的節(jié)節(jié)攀升，開發(fā)利用環(huán)境友好的生物基產(chǎn)品己成為轉(zhuǎn)變經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)方式、保障生態(tài)鏈良性循環(huán)、實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略需求。乳酸是一種重要的、多用途生物基平臺(tái)化合物，它有兩種旋光異構(gòu)體，其中L-乳酸可用作酸味劑、芳香劑、防腐劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等，在食品、制藥、釀造、制革、紡織和農(nóng)業(yè)中具有廣泛用途。乳酸的兩個(gè)功能集團(tuán)可以進(jìn)行多種化學(xué)反應(yīng)，包括聚合、酯化、還原和取代反應(yīng)。利用這些反應(yīng)，乳酸可被用來(lái)生產(chǎn)多種在工業(yè)和消費(fèi)品領(lǐng)域中具有重要用途的產(chǎn)品，包括高聚物(如聚乳酸)、溶劑(如乳酸乙酯、乳酸丙酯、乳酸丁酯等)及含氧化學(xué)品(如丙二醇、環(huán)氧丙烷、丙烯酸等)，其中最重要、最大宗的工業(yè)應(yīng)用，是用于生產(chǎn)可降解聚合物-聚乳酸，聚乳酸具有生物相容性、生物可降解性及優(yōu)良的機(jī)械性能和物理性能，因而被產(chǎn)業(yè)界認(rèn)為是新世紀(jì)最有發(fā)展前途的新型包裝材料，將有望逐步替代聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等材料。作為一種能夠由可再生碳水化合物轉(zhuǎn)化而來(lái)的重要平臺(tái)化合物，近年來(lái)乳酸受到了全世界研究人員和生產(chǎn)企業(yè)的極大關(guān)注。2005年全球乳酸產(chǎn)量己經(jīng)達(dá)到12萬(wàn)噸，其中20-30%應(yīng)用在新的工業(yè)領(lǐng)域中。隨著乳酸新的、大宗的應(yīng)用不斷開發(fā)，全球乳酸的市場(chǎng)需求將持續(xù)增長(zhǎng)。根據(jù)預(yù)測(cè)，如果10-20年后全球范圍內(nèi)生物基塑料能夠替代石油基塑料消費(fèi)量的10-20%,聚乳酸的年需求量將達(dá)到1150-2300萬(wàn)噸。目前全球乳酸產(chǎn)量只有這一預(yù)測(cè)值的1%，其核心問(wèn)題是L-乳酸生產(chǎn)成本和市場(chǎng)價(jià)格仍然偏高。解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵之一是提高菌株的乳酸生產(chǎn)率，目前己知的大多數(shù)菌種的發(fā)酵生產(chǎn)率較低，導(dǎo)致發(fā)酵周期長(zhǎng)，生產(chǎn)成本偏高，從而導(dǎo)致聚乳酸市場(chǎng)開拓受阻。在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上對(duì)已有菌株進(jìn)行簡(jiǎn)單優(yōu)化或改良對(duì)進(jìn)一步提高乳酸生產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本貢獻(xiàn)甚微，因此需要從天然生境中篩選高乳酸生產(chǎn)率的優(yōu)良菌株，并通過(guò)正向、反向和進(jìn)化代謝工程等技術(shù)手段進(jìn)一步提高并改進(jìn)菌株的乳酸生產(chǎn)效率、對(duì)環(huán)境的脅迫能力，從而使菌株能夠高效、大量生產(chǎn)L-乳酸，突破聚合級(jí)L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)的技術(shù)瓶頸，為以可再生生物質(zhì)為原料大規(guī)模、低成本地生產(chǎn)高純度L-乳酸奠定技術(shù)基礎(chǔ)。菌種是乳酸發(fā)酵的主體和基本要素，能夠產(chǎn)生乳酸的微生物有很多，但就工業(yè)意義上來(lái)說(shuō)，乳酸桿菌具有最大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。乳酸桿菌包括兩種發(fā)酵類型，同型發(fā)酵和異型發(fā)酵。同型發(fā)酵菌株在發(fā)酵過(guò)程中只產(chǎn)生乳酸作為發(fā)酵產(chǎn)物，因此是理想的工業(yè)乳酸發(fā)酵菌株。目前在工業(yè)上獲得應(yīng)用的同型發(fā)酵菌株主要包括鼠李糖乳桿菌(Za"oZ^ci72〃51r/a/masiAs)、干酪乳桿菌(La"o力3ci77w5case力禾口德氏乳桿菌03"oZ^cj7^asoW力rwech'力等。自然界中蘊(yùn)藏著大量有潛力的乳酸產(chǎn)生菌，從環(huán)境中篩選天然優(yōu)良菌株是提高乳酸發(fā)酵性能、降低乳酸發(fā)酵成本的第一步。美國(guó)阿貢國(guó)家實(shí)驗(yàn)室Tsai等根據(jù)選擇合適碳源、乳酸發(fā)酵類型、對(duì)產(chǎn)物耐受能力、產(chǎn)物立體專一性、菌體細(xì)胞分離的難易程度、高溫耐受等篩選標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)2輪8套篩選，最終篩選獲得耐高溫、耐自身發(fā)酵產(chǎn)物的優(yōu)良菌種。Carlson和Peters的專利公開了耐乳酸同型發(fā)酵的篩選方案，他們從玉米浸漬漿水中分離了近百株同型乳酸發(fā)酵菌種，得到一株在葡萄糖和不同量玉米漿水的培養(yǎng)基中47。C發(fā)酵6h產(chǎn)乳酸接近100g/L的耐酸菌種。上述方法雖然能有效篩選到目的菌株，但是其不足是不能高通量篩選，存在極大的局限性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種輔助篩選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌的方法。本發(fā)明所提供的輔助篩選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌的方法，包括如下步驟1)培養(yǎng)待篩選樣品，挑取產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣的菌株，獲得產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株；2)培養(yǎng)所述產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株，挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率高于0.2h-'的菌株，獲得候選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌；所述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率是按照如下公式計(jì)算的V二(0D,-0D。)/At;0D。為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)檢測(cè)起始時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的0D6Q。值；0Di為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)檢測(cè)終止時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的0D6。。值；At為終止時(shí)間點(diǎn)至起始時(shí)間點(diǎn)之間的時(shí)間段。V為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率。所述挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率高于0.2h—'的菌株的方法包括如下步驟將所述產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株接種于裝有培養(yǎng)基的孔板中，再將所述孔板置于酶標(biāo)儀中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)期的不同時(shí)間點(diǎn)直接讀取培養(yǎng)液的0D6。。值，按照所述公式計(jì)算得到所述菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率，篩選獲得對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率高于0.2h—'的菌株。此步驟是利用酶標(biāo)儀進(jìn)行培養(yǎng)和讀數(shù)，方便了生長(zhǎng)率的獲得，省時(shí)省力。所述培養(yǎng)中所用到的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基。所述乳酸菌為同型發(fā)酵乳酸菌。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種篩選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌的方法。本發(fā)明所提供的篩選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌的方法，是用上述任一所述方法獲得候選菌后，再對(duì)候選菌的乳酸生產(chǎn)率進(jìn)行鑒定，如果所述候選菌的乳酸生產(chǎn)率大等于3.9±0.1g/Lh，則所述候選菌為乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌。同型發(fā)酵菌株在發(fā)酵過(guò)程中只產(chǎn)生乳酸，而且這一途徑是唯一的產(chǎn)能途徑，因此同型發(fā)酵菌株的產(chǎn)乳酸過(guò)程與菌株的生長(zhǎng)和繁殖是直接相關(guān)的，因此通過(guò)篩選生長(zhǎng)快速的同型發(fā)酵菌株可以獲得高乳酸生產(chǎn)率的菌株。本發(fā)明基于這一原理，建立了通過(guò)酶標(biāo)儀從天然環(huán)境中高通量篩選高生產(chǎn)率乳酸菌的方法。本發(fā)明篩選方法將來(lái)自自然環(huán)境中的發(fā)酵樣品用生理鹽水連續(xù)10倍稀釋后，涂布在含溴甲酚綠的MRS平板上培養(yǎng)，獲得產(chǎn)酸圈較大的產(chǎn)酸菌；通過(guò)在96深孔板倒置的杜氏小管中觀察是否產(chǎn)氣，篩選不產(chǎn)氣的細(xì)菌即為同型發(fā)酵菌株；然后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定菌株生長(zhǎng)曲線，選取生長(zhǎng)速率高的菌株即為乳酸生產(chǎn)率高的菌株。在本發(fā)明篩選方法的基礎(chǔ)上，可以通過(guò)生理生化試驗(yàn)鑒定菌株的種類，建立高生產(chǎn)率乳酸菌株庫(kù)，為乳酸發(fā)酵的工業(yè)化提供更加充足的菌種資源；可以通過(guò)進(jìn)一步的耐高鹽、耐高糖等發(fā)酵性能的檢測(cè)，篩選出滿足工業(yè)化生產(chǎn)的潛在菌株；還可以對(duì)具有乳酸高生產(chǎn)率的菌株做進(jìn)一步的遺傳改造，獲得更優(yōu)良工業(yè)菌株。本發(fā)明篩選方法實(shí)現(xiàn)了乳酸生產(chǎn)率高菌株的快速、高通量篩選，解決了目前工業(yè)乳酸菌株篩選過(guò)程中費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、篩選效率不高的缺點(diǎn)，為乳酸發(fā)酵提供了大量的供選擇的菌種資源，為進(jìn)一步優(yōu)化改良提高乳酸產(chǎn)量和生產(chǎn)率、降低成本奠定了基石出。.圖1為乳酸生產(chǎn)率高菌株的篩選流程圖。圖2為51株同型發(fā)酵乳酸菌菌株的生長(zhǎng)速率與乳酸生產(chǎn)率的關(guān)系圖。圖3為L(zhǎng)-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所使用的培養(yǎng)基的組成如下篩選培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基均為MRS培養(yǎng)基，其組成為20g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母提取物、2g/LK2HP04、2g/L檸檬酸銨、2g/L醋酸鈉、0.58g/LMgS047H20、0.25g/LMnS044H20、1ml/LTween-80，其余為水，pH為6.2。發(fā)酵培養(yǎng)基組成150g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母提取物、3g/LK2HP04、3g/LKH2P04、2g/L醋酸鈉、0.58g/LMgS047H20、0.25g/LMnS044H20、1ml/LTween-80。以6mol/LNaOH為中和劑，i周節(jié)pH為5.5。實(shí)施例1、乳酸菌的生長(zhǎng)速率與乳酸生產(chǎn)率的正相關(guān)性驗(yàn)證一、對(duì)51株同型發(fā)酵乳酸菌株進(jìn)行檢測(cè)1、菌生長(zhǎng)速率與乳酸生產(chǎn)率的測(cè)定將51株保存在-8(TC冰箱中的同型發(fā)酵乳酸菌菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37t:厭氧培養(yǎng)24h，得到發(fā)酵培養(yǎng)液；然后將培養(yǎng)液各分成兩份一份用MRS液體培養(yǎng)基稀釋到光密度大約為0.05時(shí)，取200uL稀釋液加到經(jīng)75%酒精浸泡滅菌的恥孔板中，放入酶標(biāo)儀中37T:培養(yǎng)6h(所有的菌株都完成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)，期間每隔0.5h檢測(cè)一次OD,值，計(jì)算對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)的生長(zhǎng)速率；另一份培養(yǎng)液用MRS液體培養(yǎng)基稀釋到光密度大約為0.05，然后將稀釋液加入到MRS1培養(yǎng)基中，37'C厭氧培養(yǎng)24h，檢測(cè)24小時(shí)內(nèi)的平均乳酸生產(chǎn)率。MRS1培養(yǎng)基的組成為以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，其中的葡萄糖濃度變?yōu)?0g/L，同時(shí)含有4%CaC03作為中和劑。定量檢測(cè)乳酸含量的方法是高效液相色譜法(HPLC)，所用色譜柱為HPX-87H，柱溫4(TC，檢測(cè)器為示差檢測(cè)器，流動(dòng)相為0,05mmol/LH2S04，流速為0.5ml/L。在此色譜條件下，L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖如圖3所示，L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為14.974min。其中，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)菌的生長(zhǎng)速率的計(jì)算公式如下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)菌生長(zhǎng)速率二(OD「0D。)/At;0D。為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)檢測(cè)起始時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的0D6Q。值；OD,為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)檢測(cè)終止時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的OD,值；At為終止時(shí)間點(diǎn)至起始時(shí)間點(diǎn)之間的時(shí)間段。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果表明，51株同型發(fā)酵乳酸菌菌株的乳酸生產(chǎn)率和生長(zhǎng)速率均表現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系(圖2,橫坐標(biāo)為各菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)的生長(zhǎng)速率，縱坐標(biāo)為各菌株的乳酸生產(chǎn)率)。因此可以通過(guò)檢測(cè)乳酸菌株的生長(zhǎng)速率來(lái)篩選高生產(chǎn)率的乳酸菌。二、檢測(cè)植物乳桿菌NCIMB5105、鼠李糖乳桿菌CCUG36679和植物乳桿菌NC腿8826鼠李糖乳桿菌CCUG36679購(gòu)買自瑞典大學(xué)微生物菌種保藏中心，植物乳桿菌NCIMB5105購(gòu)自英國(guó)國(guó)家工業(yè)、食品和海洋細(xì)菌菌種保藏中心和植物乳桿菌NCIMB8826購(gòu)自英國(guó)國(guó)家工業(yè)、食品和海洋細(xì)菌菌種保藏中心。從已知的乳酸菌中選取2株生長(zhǎng)速率高的菌株植物乳桿菌NCIMB5105(L3c"力acj72"sp7朋fara/z)、鼠李糖乳桿菌CCUG36679aac"力ad7乃5，以及1株生長(zhǎng)速率較低的植物乳桿菌NCIMB8826，將其分別接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中，37'C厭氧培養(yǎng)24h后，得到發(fā)酵培養(yǎng)液，然后按照一中所述方法稀釋發(fā)酵培養(yǎng)液及檢測(cè)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率、24h內(nèi)的乳酸含量及平均乳酸生產(chǎn)率。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)菌株的生長(zhǎng)速率及乳酸的產(chǎn)量和乳酸生產(chǎn)率如表1所示，表明對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)菌株的生長(zhǎng)速率和菌株的24小時(shí)內(nèi)平均乳酸生產(chǎn)率具有直接正相關(guān)性，進(jìn)一步驗(yàn)證了圖2所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表l、不同生長(zhǎng)速率菌株乳酸發(fā)酵結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>同型發(fā)酵菌株在發(fā)酵過(guò)程中只產(chǎn)生乳酸，而且這一途徑是唯一的產(chǎn)能途徑，因此同型發(fā)酵菌株的產(chǎn)乳酸過(guò)程與菌株的生長(zhǎng)和繁殖是直接相關(guān)的，而異型發(fā)酵菌株因?yàn)樵诎l(fā)酵過(guò)程中除產(chǎn)生乳酸外，還產(chǎn)生乙醇、乙酸和C02等多種產(chǎn)物，因此其乳酸合成與生長(zhǎng)是不直接相關(guān)的。綜上表明，可以通過(guò)檢測(cè)乳酸菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率輔助篩選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌。實(shí)施例2、從環(huán)境樣品中篩選乳酸高生產(chǎn)率菌株本實(shí)施例是從5種發(fā)酵物(泡菜、鹽漬大白菜、酸梅湯、酸菜和離體的瘤胃)中篩選出乳酸生產(chǎn)率高的菌株，每種發(fā)酵物設(shè)2-3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)(表2)。一、候選菌的篩選方法1、篩選培養(yǎng)過(guò)程中能產(chǎn)酸的菌用生理鹽水分別洗滌(除酸梅湯外的其余四種)或稀釋(酸梅湯)5種發(fā)酵物，將洗滌液或稀釋液再用生理鹽水稀釋，依次10倍稀釋，稀釋至滿足實(shí)驗(yàn)要求；分別取100iiL稀釋液涂布在以溴甲酚綠為指示劑的MRS平板上，37"培養(yǎng)24h，挑取菌落周圍顏色變黃菌落(圖1A)，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，共挑選了約320個(gè)菌落。2、篩選培養(yǎng)過(guò)程中不能產(chǎn)氣的菌將步驟1篩選的菌落，分別接種至含有0.6mlMRS液體培養(yǎng)基的96孔深孔板中，向杜氏小管中注滿MRS液體培養(yǎng)基，并將其倒置于96孔深孔板中，放入?yún)捬豕拗?7。C培養(yǎng)15h，篩選到不產(chǎn)氣的菌株，共191株(圖1B);3、篩選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)平均生長(zhǎng)速率大于0.2h—1的菌將步驟2獲得的191株菌的菌液分別用MRS液體培養(yǎng)基稀釋到其OD,值約為0.05，各取200yL加到經(jīng)75%酒精浸泡滅菌的96孔板中，在酶標(biāo)儀中37'C培養(yǎng)6h(所有的菌株都完成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)(因?yàn)槿樗峋羌嫘詤捬蹙?，既能在厭氧條件下生長(zhǎng)，也能在好氧條件下生長(zhǎng)，因此可以在酶標(biāo)儀中培養(yǎng)，不需要保證厭氧條件)，期間每隔0.5h檢測(cè)一次0De。。值，測(cè)定生長(zhǎng)曲線，計(jì)算對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)菌的生長(zhǎng)速率，計(jì)算方法同實(shí)施例1中所述。結(jié)果篩選到11株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率大于0.2h—1的菌株(圖1C和表2，圖1C中，橫坐標(biāo)為發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)為發(fā)酵液的OD,值)，即為候選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌。二、證明候選菌的發(fā)酵產(chǎn)物為乳酸及乳酸生產(chǎn)率的測(cè)定將步驟一中篩選得到的11株菌株分別接種于裝有3L上述發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中，以NaOH為中和劑，37"C厭氧培養(yǎng)24h，發(fā)酵結(jié)束，檢測(cè)24小時(shí)內(nèi)平均乳酸生產(chǎn)率。定量檢測(cè)乳酸含量的方法及乳酸生產(chǎn)率的計(jì)算如實(shí)施例1中所述。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。11株菌的乳酸生產(chǎn)率如表2所示。結(jié)果表明，經(jīng)本發(fā)明篩選方法篩選出的菌株均為乳酸菌，且乳酸生產(chǎn)率均高于4.0g/L41。綜合以上實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的篩選方法準(zhǔn)確、可信度高。三、菌株的鑒定對(duì)篩出的11株菌株進(jìn)行生理生化鑒定，最后鑒定SMB-0788為植物乳桿菌，SMB-0789為干酪乳桿菌、SMB-0790為干酪乳桿菌、SMB-0791為植物乳桿菌、SMB-0792為植物乳桿菌、SMB-0793為鼠李糖乳桿菌、SMB-0794為嗜酸乳桿菌、SMB-0795為類植物乳桿菌、SMB-0796為干酪乳桿菌、SMB-0797為鼠李糖乳桿菌、SMB-0798為唾液乳桿菌(表2)。表2、高生產(chǎn)率菌株的篩選結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1、一種輔助篩選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌的方法，包括如下步驟1)培養(yǎng)待篩選樣品，挑取產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣的菌株，獲得產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株；2)培養(yǎng)所述產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株，挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率高于0.2h-1的菌株，獲得候選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌；所述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率是按照如下公式計(jì)算的V＝(OD1-OD0)/Δt；OD0為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)檢測(cè)起始時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的OD600值；OD1為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)檢測(cè)終止時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的OD600值；Δt為終止時(shí)間點(diǎn)至起始時(shí)間點(diǎn)之間的時(shí)間段。V為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率高于0.2h—1的菌株的方法包括如下步驟將所述產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株接種于裝有培養(yǎng)基的孔板中，再將所述孔板置于酶標(biāo)儀中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)期的不同時(shí)間點(diǎn)直接讀取培養(yǎng)液的OD,值，按照所述公式計(jì)算得到所述菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率，篩選獲得對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率高于0.2h—i的菌株。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)中所用到的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基。4、根據(jù)權(quán)利要求l、2或3所述的方法，其特征在于所述乳酸菌為同型發(fā)酵乳酸菌。5、一種篩選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌的方法，是用權(quán)利要求1-4中任一所述方法獲得候選菌后，再對(duì)候選菌的乳酸生產(chǎn)率進(jìn)行鑒定，如果所述候選菌的乳酸生產(chǎn)率大于等于3.9±0.1g/Lh，則所述候選菌為乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌。全文摘要本發(fā)明公開了一種輔助篩選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌的方法。本發(fā)明方法包括如下步驟1)培養(yǎng)待篩選樣品，挑取產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣的菌株，獲得產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株；2)培養(yǎng)所述產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株，挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率高于0.2h^-1的菌株，獲得候選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌。本發(fā)明篩選方法實(shí)現(xiàn)了乳酸生產(chǎn)率高菌株的快速、高通量篩選，解決了目前工業(yè)乳酸菌株篩選過(guò)程中費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、篩選效率不高的缺點(diǎn)，為乳酸發(fā)酵提供了大量的供選擇的菌種資源，為進(jìn)一步優(yōu)化改良提高乳酸產(chǎn)量和生產(chǎn)率、降低成本奠定了基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101307354SQ200810116218公開日2008年11月19日申請(qǐng)日期2008年7月7日優(yōu)先權(quán)日2008年7月7日發(fā)明者張延平,徐洪濤,寅李申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所