專利名稱：：一種預(yù)測高血壓繼發(fā)左心室肥厚的方法及檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種預(yù)測高血壓繼發(fā)左心室肥厚的方法及檢測試劑盒，更具體地說是內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因多態(tài)位點(diǎn)在預(yù)測中國人高血壓繼發(fā)左心室肥厚中的用途，屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：左心室肥厚(leftventricularhypertrophy,LVH)是高血壓的主要直接并發(fā)癥。據(jù)調(diào)査，在我國農(nóng)村4270例高血壓患者中，有心臟肥厚者占42.8%。左心室肥厚被公認(rèn)為心衰的前期病變，是心衰、腦中風(fēng)、冠心病和猝死的重要獨(dú)立危險因素。研究表明，左室肥厚易導(dǎo)致心臟內(nèi)血液淤滯，易引起房顫等心律失常，促進(jìn)血栓形成，使缺血性腦卒中的發(fā)生危險增加2.5倍。此外，左心室肥厚使心血管疾病的總發(fā)生率平均增加2.3倍，使高血壓患者及總體人群的總死亡率平均增加2.5倍。因此，控制心肌肥厚可以減少腦中風(fēng)、冠心病、心衰及死亡。這對延長我國人民壽命，提高生活質(zhì)量，節(jié)省醫(yī)療資源具有極為重要的意義。雖然高血壓是心臟肥厚最重要的危險因素，但是其他多種因素，如年齡、性別、生活方式、肥胖程度、藥物治療、糖尿病以及遺傳因素等，都會對左室重量有影響。其中，血壓水平對左室重量的影響約占25%，而遺傳因素對左心室重量的影響約占所有非血壓因素的60%。將左心室肥厚作為多種疾病的中間表型，尋找其中的致病基因，從分子水平揭示高血壓引發(fā)的靶器官損傷的復(fù)雜發(fā)病機(jī)理，可為及早發(fā)現(xiàn)左心室肥厚的危險人群、干預(yù)左心室肥厚發(fā)生和發(fā)展提供有利手段。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase,eNOS)是心肌肥厚和心肌重構(gòu)過程中的關(guān)鍵調(diào)控基因。該基因位于第7號染色體長臂(7q35-7q36)上，全長約為21kb，由26個外顯子和25個內(nèi)含子組成，編碼mRNA長度為4052nt，表達(dá)產(chǎn)物為135kDa。eNOS是內(nèi)皮細(xì)胞合成NO的關(guān)鍵酶，其表達(dá)增加可改善心肌功能失調(diào)，抑制心肌梗死后心肌的纖維化，抑制(3腎上腺素能刺激引起的肥厚效應(yīng)，減輕異丙腎上腺素緩慢注射引起的心臟重量(HW)、心臟重量/體重比(HW/BW)增加，同時還減少心肌肥厚時心鈉素(ANP)mRNA的表達(dá)。心肌細(xì)胞特異高表達(dá)eNOS可以顯著抑制心梗引起的左室代償性肥厚。與此相反，eNOS(-A)大鼠在壓力后負(fù)荷升高刺激后，左室出現(xiàn)非擴(kuò)張性向心性肥厚，其收縮、舒張功能受損，呈現(xiàn)間質(zhì)纖維化。鑒于內(nèi)皮型一氧化氮合酶對心肌重構(gòu)的顯著抑制功能，我們采用功能候選基因策略，研究了該基因的基因多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)對高血壓繼發(fā)左心室肥厚的影響。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種根據(jù)內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因多態(tài)位點(diǎn)預(yù)測高血壓繼發(fā)左心室肥厚的方法。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是，提供一種根據(jù)內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因多態(tài)位點(diǎn)預(yù)測高血壓繼發(fā)左心室肥厚的臨床檢測試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案以eNOS為功能候選基因，在河南省信陽市農(nóng)村社區(qū)原發(fā)性高血壓人群中研究eNOS的基因單核苷酸多態(tài)性對高血壓繼發(fā)左心室肥厚的影響。我們發(fā)現(xiàn)，一個位于eNOS第七外顯子區(qū)的標(biāo)簽SNP(tagSNP)rsl799983與原發(fā)性高血壓的左心室肥厚發(fā)生及肥厚程度緊密相關(guān)。據(jù)此結(jié)果，我們建立了一個預(yù)測高血壓繼發(fā)左心室肥厚的試劑盒，并在山東省日照市的另一個獨(dú)立的高血壓人群中對該試劑盒的預(yù)測作用進(jìn)行了驗證，結(jié)果表明，該試劑盒預(yù)測效果顯著，結(jié)果準(zhǔn)確。本發(fā)明的重要意義心肌肥厚是所有心腦疾病發(fā)生的獨(dú)立危險因素，也是一個可以控制的因素。eNOS的基因多態(tài)性對高血壓繼發(fā)心肌肥厚的程度有良好的預(yù)測性，這就為高血壓患者的個性化診斷提供了指導(dǎo)，為預(yù)后判斷提供了重要參考，也為高血壓繼發(fā)左心室肥厚的治療提供了潛在的藥物干預(yù)靶位點(diǎn)。一種預(yù)測高血壓繼發(fā)左室肥厚的檢測引物，具有序列表SEQIDNo.l和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。一種預(yù)測高血壓繼發(fā)左室肥厚的試劑盒，成分和含量如下(50人份)，于一20'C保存50^L10xPCR緩沖液(TaKaRa)，50nLlOmmol/LdNTP混合液(TaKaRa)，12nL(5U/uL)TaqDNA聚合酶(TaKaRa)，各20j_iL(10umol/L)SEQIDNO.l和SEQIDNO.2引物(北京奧科生物公司)5ml去離子雙蒸水(ddH20)，100pL10xBanl1限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液(美國NewEnglandBiolabs公司)20nL(10U爾L)限制性內(nèi)切酶BanII(美國NewEnglandBiolabs公司)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和創(chuàng)新性在于1.本發(fā)明是世界上首次將內(nèi)皮型一氧化氮合酶的基因多態(tài)和中國人的高血壓繼發(fā)左室肥厚相關(guān)聯(lián)，確認(rèn)了eNOS基因多態(tài)在高血壓繼發(fā)左心室肥厚中的預(yù)測作用，是創(chuàng)新性的工作。2.本發(fā)明的研究對象為我國中部內(nèi)陸和東部沿海地區(qū)的兩個獨(dú)立的農(nóng)村社區(qū)人群，數(shù)目大，代表性高，由此得出的研究結(jié)論是真正適合國人的個體化診療方案；3.本研究發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮型一氧化氮合酶的基因多態(tài)對高血壓繼發(fā)左心室肥厚的預(yù)測效果非常顯著；4.標(biāo)簽SNPrsl799983的基因型分型費(fèi)用低，準(zhǔn)確性高，使用本發(fā)明的方法很大程度上降低了檢測的費(fèi)用，提高了檢測了可行性和可信度；5.預(yù)測高血壓繼發(fā)左心室肥厚的引物序列(SEQIDNO.1和SEQIDNO.2)為我實(shí)驗室自主設(shè)計，檢測的敏感性和特異性好，成本低。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并非對本發(fā)明的限制，凡是依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做出的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。圖1為SNP+894G/T(rsl799983)位點(diǎn)的分型圖譜，M為核酸標(biāo)準(zhǔn)品。具體實(shí)施方式實(shí)施例1本研究為中國農(nóng)村社區(qū)高血壓人群左心室肥厚流行病及相關(guān)危險因素調(diào)查研究的子課題。我們采用隨機(jī)整群抽樣法從河南信陽的7個自然村中檢測出40歲至75歲的原發(fā)性高血壓患者5，421例，并對其中4，869位進(jìn)行了超聲心動圖檢查。從總共7個自然村中，我們隨機(jī)挑選了3個，將所有已進(jìn)行超聲心動圖檢測的高血壓患者入選本研究，排除所有患有其他影響左心室肥厚的心血管疾病(肥厚型心肌病、瓣膜性心臟病、肺動脈高壓及冠狀動脈病)的病人，最終產(chǎn)生了包含2，179名(767名男性，1412名女性)原發(fā)性高血壓患者的研究人群。對照組和病例組在各中心同時入選，年齡在40-74歲之間，對照組選擇與病例組年齡不超過土5歲，均為漢族，彼此無親緣關(guān)系，無心血管疾病癥狀和病史，總共入選對照812名。一.臨床指標(biāo)測定1.血壓水銀血壓計測量坐位右上肢血壓，取兩次平均值。高血壓定義根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)，即收縮壓^140和/或舒張壓290和/或服用降壓藥物。2.超聲一維和二維的超聲心動圖檢測嚴(yán)格按照AHA標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。在M型超聲心動圖上，記錄每個病人的左室舒張末期直徑(leftventricularinternaldimensionatend-diastole，LVIDD)禾卩收縮末其月直《§(leftventricularinternaldimensionatend-systole，LVISD)，舒張末期室間隔厚度(interventricularseptalthickness,IVST)和左室后壁厚度(posteriorwallthicknesses,PWT)。取三個連續(xù)心動周期的平均值。相對室壁厚度(Relativewallthickness,RWT)計算公式為RWT=100x2xPWT/LVIDD。左室重量(leftventricularmass,LVM)運(yùn)用以下公式計算LVM(g)=0.8x(1.04x(LVIDD十IVST+PWT)3—(LVIDD)3)+0.6，左室重量指數(shù)(LVMI),用以下公式計算LVM^LVM/身高27。高血壓左心室肥厚(LVH)的診斷標(biāo)準(zhǔn)LVMI男性不少于49.2g/m2.7女性不少于46.7g/m27。3.生化指標(biāo)所有病人均回答有關(guān)生活方式和藥物史的問巻，進(jìn)行詳細(xì)的體征測量，并取尿和空腹12小時靜脈血，檢測相關(guān)的生化指標(biāo)。糖尿病為空腹血糖^7.0mmol/L，或有糖尿病病史者。體重指數(shù)(BMI)-體重(kg)Z身高(m)2。"曾經(jīng)吸煙"定義為有生以來吸煙多于20包，或者持續(xù)一年每天吸煙至少一支；"曾經(jīng)飲酒"定義為飲酒持續(xù)一年，平均每周至少一次。二.基因分型1.SNP入選本研究采取標(biāo)簽SNP結(jié)合功能候選SNP策略來挑選SNP。通過對HapMap數(shù)據(jù)庫的分析并結(jié)合以前的報道，本研究共挑選了eNOS基因的三個SNP，分別為rs2070744，eNOS4a/4b(串聯(lián)重復(fù)序列，VNTR)，rsl799983，相對于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的編號分別為-786C/T，eNOS4a/4b，+894G/T。HapMap數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，-786C/T(rs2070744)位于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，文獻(xiàn)報道其可以影響啟動子區(qū)的活性，C-786可以使啟動子區(qū)活性減少50%。eNOS4a/b位于4號內(nèi)含子，是長度為27bp的串聯(lián)重復(fù)單位，可以影響體內(nèi)eNOSmRNA和蛋白水平的表達(dá)，也有文獻(xiàn)報道eNOS4a/b與血漿內(nèi)NO濃度相關(guān)。+894G/T(rsl799983)在中國漢族人群中為標(biāo)簽SNP,位于7號外顯子，雖然沒有與其他SNP位點(diǎn)連鎖，但是由于其可以導(dǎo)致eNOS成熟蛋白的第298位氨基酸由谷氨酸變?yōu)樘於彼?G-T，Glu-Asp)，進(jìn)而導(dǎo)致eNOS成熟蛋白的功能活性降低，因此我們將其入選。2.基因分型2.1試劑(1)人血基因組DNA純化試劑盒DP318-02(天根生化科技，北京，中國)(2)10%SDS:lO.OgSDS溶于卯ml水中，調(diào)pH7.2，加水定容至100ml。(3)TE:10mMTris-HCl(pH8,0),lmMEDTA-Na2(pH8.0)(4)50xTAE電泳緩沖液242.OgTris-HCl，27.5ml冰乙酸，100ml0.5mMEDTA-Na2，終體積1升。(5)制性內(nèi)切酶均購自美國NewEnglandBiolabs公司(6)所有引物均購自北京奧科生物公司2.2儀器及設(shè)備(1)PCR儀DNAengine美國Bio-Rad公司(2)冷凍離心機(jī)RC-5C美國SORVALL公司(3)天平JA5003上海天平儀器廠(4)凝膠電泳槽北京六一儀器廠2.3實(shí)驗步驟(1)使用血基因組DNA純化試劑盒(DP318-02)從4ml外周血中提取基因組DNA，所有步驟均按照說明書進(jìn)行。(2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性(PCR-PFLP)法對三個SNP進(jìn)行基因分型，具體如下A.PCR擴(kuò)增目的片段三個SNP進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物、退火溫度(Tm)及產(chǎn)物長度見表l。表1:eNOS基因多態(tài)位點(diǎn)PCR具體信息PCR產(chǎn)退火內(nèi)切SNPs引物(5，-3，)物(bp)(°C)酶陽786T/CF:GACACAGAACTACAAACCCC17860MspI(rs2070744)R:GCAGGTCAGCAGAGAGACTAF:AGGCCCTATGGTAGTGCCTT393或eNOS4a/b56R:TCTCTTAGTGCTGTGGTCAC420+894G/TF:GCTCAGCCCCAGAACCCCCT17166BanII(rs1799983)R:GCTCCAGGGGCACCTCAAGG注eNOS4a/b不用酶切，4a含有4個串聯(lián)重復(fù)單位，擴(kuò)增產(chǎn)物為393bp，4b含有5個串聯(lián)重復(fù)單位，擴(kuò)增產(chǎn)物為420bp。所有的SNP位點(diǎn)使用PCR反應(yīng)系統(tǒng)(KT221-01，北京天根生化科技)進(jìn)行擴(kuò)增，體系如下TaqMix(2x)5.0uLgDNA(100ng/uL)1.0uLPF(5pmol/uL)0.8uLPR(5pmol/uL)0.8uLddH，O2.4uLtotal10.0uLPCR反應(yīng)條件(退火溫度具體見表l)step1=94.(TCstep2=94.0°Cstep3=退火step4=72.0°Cstep5=72.0°Cstep6=04.0°CB.酶切5分鐘30秒30秒30秒—7分鐘重復(fù)35個循環(huán)將PCR產(chǎn)物酶切12小時，其反應(yīng)體系如下(內(nèi)切酶具體見表1)PCR產(chǎn)物10xBuffer內(nèi)切酶ddH7010.0uL1.5uL2.5unit補(bǔ)齊到15uL總體積15.0uLC.電泳鑒定見圖1.①-786C/T:PCR產(chǎn)物長178bp，Mspl酶切后，4%瓊脂糖膠電泳檢測，C等位基因產(chǎn)生137bp和41bp兩條片段，T等位基因只有一條178bp片段；②eNOS4a/b:PCR反應(yīng)后，4%瓊脂糖膠電泳檢測，a等位基因產(chǎn)生一條393bp片段，b等位基因有一條420bp片段；③+894G/T:PCR產(chǎn)物長171bp，BanII酶切后，4%瓊脂糖膠電泳檢測，G等位基因產(chǎn)生118bp和53bp兩條片段，T等位基因只有171bp的片段。三.統(tǒng)計學(xué)分析采用x2檢驗比較計數(shù)資料、基因型和等位基因頻率差異以及SNP的Hardy-Weinberg平衡。采用非配對t檢驗或者單因素方差分析比較兩組或多組間計量資料。SNP和計量型超聲指標(biāo)的關(guān)聯(lián)采用多元回歸分析，即將每個超聲指標(biāo)對影響心臟大小的傳統(tǒng)因素(包括年齡、性別、體表面積、收縮壓、舒張壓、曾經(jīng)飲酒、曾經(jīng)吸煙、高血壓治療、糖尿病等)進(jìn)行校正后再進(jìn)行分析。使用多元線性回歸分析檢測SNP是否為心臟大小和重量的獨(dú)立預(yù)測因子。雙側(cè)尾P0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。所有的分析均在SPSS11.5統(tǒng)計軟件中進(jìn)行。四.結(jié)果1.研究人群的臨床特點(diǎn)本研究入選高血壓人群的臨床特點(diǎn)如表2所示。男性和女性在年齡構(gòu)成、血脂水平、血糖等方面均有極顯著差異(PO.01)。2.eNOS基因多態(tài)性位點(diǎn)與臨床和生化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)eNOS基因的三個SNP的等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg。我們用單因素方差分析分別對三個SNP的基因型對研究人群臨床和生化指標(biāo)的影響進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三個SNP位點(diǎn)對上述指標(biāo)沒有任何影響(P>0.05)。3.eNOS基因多態(tài)性位點(diǎn)與高血壓繼發(fā)心肌肥厚相關(guān)eNOS基因多態(tài)性位點(diǎn)在健康人及高血壓繼發(fā)肥厚和不肥厚亞組中的基因型和等位基因分布如表3所示。從中可見，三個SNP中只有+894T/G與左室肥厚的發(fā)生顯著相關(guān)。其中，T等位基因在肥厚亞組中頻率更高(P<0.01)，提示+894T/G可能為危險性等位基因。為了進(jìn)一步分析eNOS基因多態(tài)性位點(diǎn)在高血壓繼發(fā)心肌肥厚中的作用，我們用單因素方差分析分別檢驗了所有的超聲指標(biāo)在三個SNP基因型之間的差別。結(jié)果表明，只有+894G/T對超聲指標(biāo)有影響，隨著+894T的增加，左室重量指數(shù)、左室后壁厚度、相對室壁厚度和室間隔厚度均逐漸增加。即便在校正了各種可能影響心臟大小的因素(包括年齡、性別、體表面積、收縮壓、舒張壓、曾經(jīng)飲酒、曾經(jīng)吸煙、高血壓治療、糖尿病等)之后，這一作用依然存在，然且差異極其顯著(表4)。進(jìn)一步的多元線性回歸分析表明，+894T是左室重量指數(shù)、左室后壁厚度、相對室壁厚度和室間隔厚度最強(qiáng)的獨(dú)立預(yù)測因子之一(OR,1.673[95%CI:1.19-2.36];P<0.01)。五.結(jié)論eNOS基因的+894T等位基因?qū)Ω哐獕豪^發(fā)左室肥厚具有危害作用。這是世界上首次將eNOS的基因多態(tài)性與中國人的高血壓繼發(fā)左室肥厚聯(lián)系起來，為高血壓繼發(fā)左心室肥厚的治療提供了可能的藥物靶位點(diǎn)，也為個性化診斷和預(yù)后提供了重要的提示。表2:研究人群的臨床特征臨床特征健康人高血壓組(n=812)無左室肥厚(n=:1118)左室肥厚(『1061)年齡，y52.3±9.257.6±9.lf59.1±8.7卞男性，％38.9%37.9%32.4%體重指數(shù)，kg/m224.0±3.625.5±3.5卞27.1±6.5卞收縮壓，mmHg118.8±11.5160.0±22.6，164.1±28.6f舒張壓，mmHg78.1士6.996.6±11.f96.5±14.4f高密度脂蛋白，mmol/L1.55±0.321.56±0.341.52±0.33低密度脂蛋白，mmol/L2,72±0.843.14±0.85，3.11±0.88'總膽固醇，mmol/L5.ll士l.115.54±1.1"5.48±1.10十甘油三酯，咖ol/L1.44±0.951.66±1.27，1.72±1.25f血糖，鵬ol/L4.84±1.725.58±1.77f5.53±1.64f吸煙，％24.2%19.4%16.1%飲酒，％24.6%22.3%19.0%計量資料表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差，計數(shù)資料表示為事件比例。t:高血壓病人與對照健康人相比，P<0.01。表3:eNOS基因多態(tài)性位點(diǎn)在各組中的基因型頻率分布<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>所有的超聲指標(biāo)均為校正值，校正的協(xié)變量包括年齡、性別、體表面積、收縮壓、舒張壓、曾經(jīng)飲酒、曾經(jīng)吸煙、高血壓治療、糖尿病等。*:TTvsGTP<0.05;TTvsGTP<0.01.卞TTvsGGP<0.05;卞卞TTvsGGP<0.01.實(shí)施例2:預(yù)測高血壓繼發(fā)左心室肥厚的試劑盒一.組成成分和含量如下(50人份)，于一2(TC保存50pL10xPCR緩沖液(TaKaRa)，50nLlOmmol/LdNTP混合液(TaKaRa)，12pL(5U/uL)TaqDNA聚合酶(TaKaRa)，各20nL(10umoI/L)SEQIDNO.l和SEQIDN0.2引物(北京奧科生物公司)5ml去離子雙蒸水(ddH20)，lOOpLlOxBanll限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液(美國NewEnglandBiolabs公司)20pL(10U/pL)限制性內(nèi)切酶BanII(美國NewEnglandBiolabs公司)使用方法1.常規(guī)方法提取受試者基因組DNA;2.PCR反應(yīng)表5:PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>反應(yīng)條件step1=94.0°C5分鐘step2=94.0°C30秒step3=66.0°C30秒step4=72.0°C30秒step5=72.0°C7分鐘step6=04.0°C3.酶切將PCR產(chǎn)物酶切12小時，其反應(yīng)體系如下PCR產(chǎn)物10.0uL10xBuffer1.5內(nèi)切酶BanII(lOU/uL)0,3uL重復(fù)35個循環(huán)ddH20_3.2uL總體積15.0uL4.電泳鑒定PCR產(chǎn)物長171bp，BanII酶切后，4%瓊脂糖膠電泳檢測，G等位基因產(chǎn)生118bp和53bp兩條片段，T等位基因只有一條171bp片段。實(shí)施例3:另一個獨(dú)立樣本驗證內(nèi)皮型一氧化氮合酶預(yù)測高血壓繼發(fā)左心室肥厚試劑盒本研究人群病例來源于山東日照社區(qū)人群，共入選高血壓病人343例。高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)美國預(yù)防、檢測、評估與治療高血壓全國聯(lián)合委員會第七次報告(JNC-7):收縮壓^140mmHg和/或舒張壓^卯mmHg，或服用抗高血壓藥物。各組患者經(jīng)詳細(xì)詢問病史、體檢及實(shí)驗室檢查排除繼發(fā)性高血壓、冠心病、糖尿病、心臟瓣膜病、原發(fā)性肺動脈高壓心力衰竭、嚴(yán)重心腦血管疾病、肝腎功能不全、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病及代謝性疾病。一.臨床指標(biāo)測定血壓測量、超聲檢査、生化指標(biāo)的測定與實(shí)施例1中的操作完全一致。二.患者分組根據(jù)臨床診斷分為高血壓繼發(fā)左室肥厚和非肥厚組，其中左室肥厚的高血壓患者有120名，不存在左室肥厚的高血壓患者有223名。三.使用實(shí)施例1和2的試劑盒對患者進(jìn)行基因分型按實(shí)施例1和2的試劑盒中的操作步驟對兩組高血壓病人進(jìn)行實(shí)驗。四.統(tǒng)計學(xué)分析統(tǒng)計學(xué)分析如實(shí)施例1進(jìn)行。五.結(jié)果1.研究人群的臨床特點(diǎn)本研究入選高血壓人群的臨床特點(diǎn)如表6所示。男性和女性在年齡構(gòu)成、血脂水平、血糖等方面均無極顯著差異(P>0.05)。2.eNOS基因多態(tài)性位點(diǎn)與高血壓繼發(fā)心肌肥厚相關(guān)與預(yù)期相符，+8940^與左室肥厚的發(fā)生顯著相關(guān)，其中，T等位基因在肥厚亞組中頻率更高(PO.01)。單因素方差分析檢驗表明，+8940/1對超聲指標(biāo)有影響，隨著+894T的增加，左室重量指數(shù)、左室后壁厚度、相對室壁厚度和室間隔厚度均逐漸增加。在校正了各種可能影響心臟大小的因素(包括年齡、性別、體表面積、收縮壓、舒張壓、曾經(jīng)飲酒、曾經(jīng)吸煙、高血壓治療、糖尿病等)之后，這一作用依然存在，且差異極其顯著(表7)。進(jìn)一步的多元線性回歸分析表明，十894T是左室重量指數(shù)、左室后壁厚度、相對室壁厚度和室間隔厚度最強(qiáng)的獨(dú)立預(yù)測因子之一(OR,1.41[95%CI:(1.01-2.28)];P<0.05)。六.結(jié)論我室所開發(fā)的內(nèi)皮型一氧化氮合酶預(yù)測高血壓繼發(fā)左心室肥厚的試劑盒對高血壓左室肥厚的預(yù)測和診斷有非常重要的臨床意義。eNOS基因的+894T等位基因?qū)Ω哐獕豪^發(fā)左室肥厚的危害作用在此實(shí)驗中也得到進(jìn)一步證實(shí)。表6:日照高血壓患者的臨床特征<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表7eNOS基因多態(tài)性位點(diǎn)在各組中的基因型頻率分布Population-T786C,n(%)4<}894T,n(%)eNOS4a/b,n(%)TCCCTTGTGG4a4a/b4bHypertensionwilhoutLVH(n=223)189(84.8)31(13.9)(1.3)21(9.4)79(35.4)123(55.2)0(o)30(13.5)193(86.5)Hypertensionwi1hLVH(ff=120)105(87.5)13(10.8)2(1.7)16(13.3)卞431(35.8)61(50.8)0(o)19(15.8)101(84.2)*:左室肥厚的高血壓病人與不肥厚的高血壓病人相比，P<0.05.卞:左室肥厚的高血壓病人與不肥厚的高血壓病人相比，P<0.01.表8.*eNOS基因+894T/G位點(diǎn)與高血壓繼發(fā)左心室肥厚的關(guān)聯(lián)VariablesTT(n=16)GT(n=43)GG(n=61)IVS(mm)12.4±1.5ii.i士iy11.0±1.7tLVPW(mm)12,1±1.011,2±1.4'11.3±1.3TEDD(mm)48.3±4.847.5±2.845.7±3.1ESD(mm)29.0±3.131,2±5.729.3±2.5RWT(%)50.9±8.147.7±8.6*48.9±8.1卞10LVMICg/m2.7)70.8±10.957.6±7.4"56.0±9.3"所有的超聲指標(biāo)均為校正值，校正的協(xié)變量包括年齡、性別、體表面積、收縮壓、舒張壓、曾經(jīng)飲酒、曾經(jīng)吸煙、高血壓治療、糖尿病等。*:TTvsGTP<0.05;":TTvsGTP<0.01.卞TTvsGGP<0.05;卞卞TTvsGGP<0.01.序列表〈110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院〈120〉一種預(yù)測高血壓繼發(fā)左心室肥厚的方法及檢測試劑盒〈130〉〈160〉6〈170>Patentlnversion3.5<210〉1〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉1gctcagccccagaaccccct20〈210〉2<211>20〈212〉DNA〈213〉人工合成<400>2gctccaggggcacctcaagg20<210〉3<211〉20〈212>腿〈213〉人工合成〈400〉3aggccctatggtagtgcctt20〈210〉4<211〉20<212>DNA<213>人工合成〈400〉4tctcttagtgctgtggtcac20<210>5〈211〉20〈212>DNA〈213〉人工合成〈400〉5gacacagaactacaaacccc20〈210〉6<211〉20〈212>腿〈213〉人工合成<400〉6gcaggtcagcagagagacta20權(quán)利要求1.內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因多態(tài)位點(diǎn)在預(yù)測高血壓繼發(fā)左心室肥厚中的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因多態(tài)位點(diǎn)在預(yù)測高血壓繼發(fā)左心室肥厚中的用途，其特征在于所述應(yīng)用為提供高血壓繼發(fā)左心室肥厚的治療藥物耙位點(diǎn)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因多態(tài)位點(diǎn)在預(yù)測高血壓繼發(fā)左心室肥厚中的用途，其特征在于所述應(yīng)用為提供個性化診斷。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因多態(tài)位點(diǎn)在預(yù)測高血壓繼發(fā)左心室肥厚中的用途，其特征在于所述應(yīng)用為提供預(yù)后的指導(dǎo)性方針。5.預(yù)測高血壓繼發(fā)左心室肥厚的引物序列，其特征在于具有序列表SEQIDNO.l和SEQIDN0.2所示的核苷酸序列。6.預(yù)測高血壓繼發(fā)左心室肥厚的試劑盒，其特征在于由下列試劑組成，成分和含量如下(50人份)，于一20'C保存50^L10xPCR緩沖液，50pLlOmmol/LdNTP混合液，12pL(5U/uL)TaqDNA聚合酶，各20pL(10umol/L)序列表SEQIDNO.l和SEQIDNO,2所示的引物，5ml去離子雙蒸水(ddH20)，lOOpL10xBanl1限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，35ixL(10U/nL)限制性內(nèi)切酶BanII。全文摘要本發(fā)明公開了一種預(yù)測高血壓繼發(fā)左心室肥厚的方法及檢測試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域。內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因多態(tài)位點(diǎn)在預(yù)測高血壓繼發(fā)左心室肥厚中的用途。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是確定了內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因基因多態(tài)在高血壓繼發(fā)左心室肥厚中的作用，利用相關(guān)SNP為高血壓繼發(fā)左心室肥厚治療提供了藥物靶位點(diǎn)，為個性化診斷和預(yù)后提供指導(dǎo)性方針。文檔編號C12N15/11GK101302566SQ200810116060公開日2008年11月12日申請日期2008年7月2日優(yōu)先權(quán)日2008年7月2日發(fā)明者哲劉,宋曉東,惠汝太,王曉建,白永懌,穎辛申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院