專利名稱：一種脂肪酶的固定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂肪酶的固定化方法，具體涉及一種將脂肪酶采用物理 或化學(xué)的方法固定在不溶于水的載體上，形成一種可以重復(fù)使用的固定 化脂肪酶的方法。
背景技術(shù)：
隨著脂肪酶研究的深入和脂肪酶工程的發(fā)展，脂肪酶的應(yīng)用越來(lái)越 廣泛。將脂肪酶用物理或化學(xué)的方法固定在不溶于水的載體上，形成一 種可以重復(fù)使用的脂肪酶，叫固定化脂肪酶。固定化脂肪酶既保持了脂 肪酶的催化特性，又克服了游離脂肪酶的不穩(wěn)定性，具有可反復(fù)或連續(xù) 使用、易與反應(yīng)產(chǎn)物分離等顯著優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、輕工、食品等 行業(yè)。
固定化脂肪酶使工業(yè)用脂肪酶的穩(wěn)定性提高并延長(zhǎng)了脂肪酶的使用 壽命，因此脂肪酶的固定化受到了較為廣泛的關(guān)注。脂肪酶通常是被固 定于不溶性的固體載體上，這有利于提高脂肪酶的熱穩(wěn)定性、使用穩(wěn)定 性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而降低其使用成本。另一方面，固定化載體也是影 響固定化脂肪酶性能的一個(gè)重要的因素。生物相容性不好的載體會(huì)引起 脂肪酶的變性和活力的下降，具有良好生物相容性的載體能夠?yàn)橹久?創(chuàng)造適宜的微環(huán)境，減少非生物特異性的"脂肪酶一載體"相互作用， 有效降低無(wú)機(jī)物及雜質(zhì)的吸附。因此，選取合適的載體和恰當(dāng)?shù)墓潭ɑ?方法顯得尤為重要。
選用不同的材料為載體、特別是在固體粉體材料上固定化脂肪酶已有大量的報(bào)道，但載體成本高又無(wú)法回收成為一個(gè)重要的制約。以膜狀 物為載體有一定的報(bào)道，但這些膜，如靜電紡絲膜、中空纖維膜等，雖 然功能性較強(qiáng)，但也普遍存在成本偏高，尚不能規(guī);漠化生產(chǎn)等限制。近 年來(lái)，隨著納米技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，也設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了不少微觀結(jié)構(gòu)規(guī)整的
納米多孔材料，研究得較多的如二氧化硅、碳酸鈣、碳納米管、氧化
鋁等。但這類無(wú)機(jī)材料本身生物相容性較差，固定化的過(guò)程易引起蛋白 構(gòu)象的改變，在對(duì)其的修飾改性中又容易帶入新的影響脂肪酶構(gòu)象的因 素，而脂肪酶這類生物大分子的活性往往是基于其特定的三維結(jié)構(gòu)，因 此這類多孔納米材料也還有待進(jìn)一步改善。
在固定化方法上，常見(jiàn)的吸附法才乘作簡(jiǎn)單但作用力不強(qiáng)，負(fù)載量有
限并且吸附不牢固；共價(jià)法作用力強(qiáng)，但會(huì)導(dǎo)致脂肪酶部分位點(diǎn)的失活， 造成脂肪酶活的降低；交聯(lián)涉及多步化學(xué)反應(yīng)使得成本高昂。
雖然現(xiàn)有的固定化脂肪酶的方法很多，但由于均存在一定的缺點(diǎn)， 有的載體成本偏高，有的脂肪酶的負(fù)載量有限，有的脂肪酶與載體結(jié)合 不牢固，有的方法復(fù)雜等等，因此很難找到一種理想的固定化脂肪酶的 方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種脂肪酶的固定化方法，該方法具有基布的 選擇范圍更大、固定化脂肪酶的負(fù)載量大及催化反應(yīng)壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的脂肪酶的固定化方法的基本構(gòu)思是使用 一種紡織物或者無(wú) 紡布等薄膜狀材料為基布載體，通過(guò)涂層膠與脂肪酶的互混，形成可涂
層的漿狀物，于基布上實(shí)現(xiàn)脂肪酶的固定化。 實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案如下一種脂肪酶的固定化方法，包括如下步驟
a、 將脂肪酶的漿狀物或脂肪酶溶液與粘合劑互混，得到粘合劑與脂 肪酶的互混漿狀物；
b、 將步驟a得到的互混漿狀物在基布上涂層；
c、 將步驟b所述涂層干燥后即得。
其中步驟a所述脂肪酶可為提純干燥后的脂肪酶粉、胞外產(chǎn)脂肪酶 或細(xì)胞破壁后的發(fā)酵液。
步驟a所述粘合劑可為具有粘合功能的水溶性市售商品或自制劑方， 粘合劑與脂肪酶能夠?qū)崿F(xiàn)良好的互混并且不會(huì)對(duì)脂肪酶的生物活性造成
損害，如聚氨酯類、聚丙烯酸酯類或有機(jī)硅類粘合劑等等。
步驟b所述基布為紡織物、無(wú)紡布或其它的薄膜材料，所述紡織物 包括棉布或絲綢等，所述無(wú)紡布包括丙綸、氨綸、聚酯纖維、晴綸、滌 綸或尼龍等。 其中，步驟a中脂肪酶的漿狀物或脂肪酶溶液與粘合劑的體積比為 0.1:1-20:1。以脂肪酶的漿狀物或脂肪酶溶液的體積V計(jì)，粘合劑的用 量為dV(d: 0.1-20),緩慢攪動(dòng)將二者均勻混合，即得到粘合劑與脂肪 酶的互混漿狀物。
其中，步驟a中的脂肪酶是脂肪酶粉時(shí)，加適量水進(jìn)行溶解稀釋后 可形成脂肪酶的漿狀物或脂肪酶溶液。具體為將脂肪酶粉均勻分散溶 于1-10倍重量的水中形成脂肪酶的漿狀物或脂肪酶溶液，然后再與粘 合劑按體積比為0. 1: 1 - 20: 1互混。
其中，步驟c具體為將步驟b所述涂層晾干或冷凍干燥后即得。 其中，步驟c中的涂層晾干后可在60 - 150。C短時(shí)間烘焙1-15分鐘。 本發(fā)明以廉價(jià)的紡織物或者無(wú)紡布等薄膜狀材料為基布載體，直接將涂層粘合劑與脂肪酶混合后均勻涂布在基布上將脂肪酶固定。本發(fā)明
中所用的脂肪酶的固定化方法有如下優(yōu)點(diǎn)
1、 基布的選擇范圍更大對(duì)于基布的選擇可以根據(jù)應(yīng)用的需要和反 應(yīng)器的具體情況，選擇不同厚度、不同硬度等；
2、 固定化脂肪酶的負(fù)載量大可負(fù)載的脂肪酶量遠(yuǎn)大于吸附或共價(jià) 法的負(fù)載量；
3、 催化反應(yīng)的壽命長(zhǎng)涂層膠通常為單組分或多組分的聚合物單體， 固化的過(guò)程可聚合形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，更牢固地將脂肪酶分子附著在基布載 體上，同時(shí)涂層后的載體表面具備一定的疏水性質(zhì)，有利于脂肪酶在微 水相合成體系中高活性和穩(wěn)定性的保持；
4、 處理方法簡(jiǎn)單，條件要求溫和，易于實(shí)現(xiàn)；
5、 固定化脂肪酶形態(tài)多固定化脂肪酶可以膜狀、碎片狀、筒狀、 條狀等形態(tài)出現(xiàn)，適應(yīng)于更廣泛形式的反應(yīng)器，減少壓降和擴(kuò)散阻力。


圖1為本發(fā)明涂層法固定化脂肪酶與直接吸附法固定化脂肪酶在無(wú)溶 劑體系時(shí)酯化活性及穩(wěn)定性對(duì)比圖。圖中(□)表示直接吸附，(O )表 示脂肪酶粉經(jīng)聚氨酯涂層膠固定于無(wú)紡布。
圖2為本發(fā)明涂層法固定化脂肪酶與直接吸附法固定化脂肪酶在有溶 劑體系時(shí)酯化活性及穩(wěn)定性對(duì)比圖。圖中(□)表示直接吸附，(〇)表 示脂肪酶粉經(jīng)聚氨酯涂層膠固定于無(wú)紡布。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的脂肪酶的固定化方法及其帶來(lái)的 技術(shù)效果。本發(fā)明中所使用的原料或組分如無(wú)特別說(shuō)明均可以通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)得或采用本領(lǐng)域常規(guī)方法制得。
實(shí)施例1聚氨酯粘合劑與脂肪酶溶液共混涂層固定化脂肪酶
本實(shí)施例所用的聚氨酯粘合劑為單組分，牌號(hào)為R120，上海藍(lán)歐材 料有限公司。步驟如下
1) 取O. 25g脂肪酶粗酶粉，將其均勻分散溶解于lmL水中，攪拌至 均相。再向脂肪酶混合水溶液中加入lmL聚氨酯粘合劑R120,充分?jǐn)嚢?形成漿狀物；
2) 用排筆蘸取混合液，并將全部的混合漿狀物均勻的涂刷于10cm2 絲綢基布的上下兩個(gè)表面；
3) 固定基布的一個(gè)角，置于陰涼通風(fēng)處，室溫下晾干即可。
實(shí)施例2聚氨酯粘合劑與發(fā)酵液上清液共混涂層固定化脂肪酶 本實(shí)施例所用聚氨酯粘合劑為多組分，牌號(hào)為R113,上海藍(lán)歐材料 有限公司。步驟如下
1) 將發(fā)酵液3000rpm離心，取上清液lmL。依R113粘合劑與固化劑 的使用比例(R113占體積的75%,固化劑為體積的15%),調(diào)兌好多組分 粘合劑并攪拌均勻，向脂肪酶發(fā)酵液上清液中加入lmL調(diào)兌好的多組分 粘合劑，充分?jǐn)嚢栊纬蓾{狀物；
2) 用排筆蘸取混合液，并將全部的混合漿狀物均勻的涂刷于10cm2 聚酯無(wú)紡布基布的上下兩個(gè)表面；
3) 固定基布的一個(gè)角，置于陰涼通風(fēng)處，晾置3-4h, 70。C烘焙l分 4中，即可。
實(shí)施例3有機(jī)硅粘合劑與脂肪酶溶液共混涂層固定化脂肪酶本實(shí)施例所用有機(jī)硅粘合劑，牌號(hào)為CF-508E,北京度辰新材料有限 公司。步驟如下
1) 取0.25g脂肪酶粗酶粉，將其均勻分散溶解于lmL水中，攪拌至 均相。再向脂肪酶混合水溶液中加入lmL有機(jī)硅粘合劑CF-508E,充分?jǐn)?拌形成漿狀物；
2) 用排筆蘸取混合液，并將全部的混合漿狀物均勻的涂刷于10cm2 丙綸無(wú)紡布基布的上下兩個(gè)表面；
3) 固定基布的一個(gè)角，置于陰涼通風(fēng)處，室溫下晾干即可。
比較例1 本發(fā)明涂層法固定化脂肪酶與直接吸附法固定化脂肪酶 在無(wú)溶劑體系時(shí)酯化活性及穩(wěn)定性比較 具體方法如下
1 )按照實(shí)施例2操作實(shí)現(xiàn)脂肪酶借助涂層膠在基布(聚酯纖維無(wú)紡 布)的固定化；
2 )取和實(shí)施例2中同樣的一塊基布，取0. 25g脂肪酶粗酶粉，將其 均勻分散溶解于2mL水中，攪拌至均相。將基布浸漬在脂肪酶溶液中， 在1(TC固定化3h,固定基布的一個(gè)角，置于陰涼通風(fēng)處，晾置3-4h， 7(TC烘焙1分鐘，制得直接吸附法固定化脂肪酶；
3) 無(wú)溶劑體系油酸-乙醇酯化合成油酸乙酯2.82 g油酸(10mM)， 反應(yīng)時(shí)間24小時(shí)，分8次流加乙醇583jal (10mM)，每相鄰兩次間隔不 小于2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后將固定化脂肪酶投入新鮮的底物溶液中繼續(xù)下 一糸匕反應(yīng)；
4) 每次反應(yīng)殘余物用50mM/L的NaOH溶液滴定剩余的脂肪酸含量， 確定轉(zhuǎn)化率。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。從圖1可見(jiàn)本發(fā)明的涂層法固定化脂肪酶對(duì)于脂肪酶活的保持和使用壽命較直接吸附法都有明顯的改善。
比較例2本發(fā)明涂層法固定化脂肪酶與直接吸附法固定化脂肪酶在 有溶劑體系時(shí)酯化活性及穩(wěn)定性比較
1 )按照實(shí)施例1操作實(shí)現(xiàn)脂肪酶借助涂層膠在基布(絲綢布)的固 定化。
2 )取和實(shí)施例1中同樣的一塊基布，取0. 25g脂肪酶粗酶粉，將其 均勻分散溶解于2mL水中，攪拌至均相，將基布浸漬在脂肪酶溶液中， 在10°C固定化3h，固定基布的一個(gè)角，置于陰涼通風(fēng)處，室溫下晾干 即可制備直接吸附法固定化脂肪酶。
3) 有溶劑體系大豆油轉(zhuǎn)酯化合成生物柴油(脂肪酸甲酯)lg豆油， 200 ja 1水，3ml正己烷，分3次每8h流加曱醇46 n 1，反應(yīng)時(shí)間24小時(shí)。 反應(yīng)結(jié)束后將固定化脂肪酶投入新鮮的底物溶液中繼續(xù)下一批反應(yīng)。
4) 每次反應(yīng)后取樣反應(yīng)液用高效氣相色譜測(cè)定的脂肪酸甲酯 含量，確定轉(zhuǎn)化率。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。從圖2可見(jiàn)本發(fā)明的涂層法固定化脂肪酶對(duì)于脂肪 酶活的保持和使用壽命較直接吸附法都有明顯的改善。
以上實(shí)施例只是用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而不是用來(lái)限制本發(fā)明的 保護(hù)范圍。凡是在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)所做出的具體實(shí)施方式
及應(yīng)用范圍 上的些許變動(dòng)，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、一種脂肪酶的固定化方法，其特征在于包括如下步驟a、將脂肪酶的漿狀物或脂肪酶溶液與粘合劑互混，得到粘合劑與脂肪酶的互混漿狀物；b、將步驟a得到的互混漿狀物在基布上涂層；c、將步驟b所述涂層干燥后即得。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步驟a 所述脂肪酶包括提純干燥后的脂肪酶粉、胞外產(chǎn)脂肪酶或細(xì)胞破壁后的 發(fā)酵液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步驟a 所述粘合劑包括聚氨酯類、聚丙烯酸酯類或有機(jī)硅類粘合劑。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步驟b 所述基布為紡織物或無(wú)紡布。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述紡 織物包括棉布或絲綢。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述無(wú) 紡布包括丙綸、氨綸、聚酯纖維、晴綸、滌綸或尼龍。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步驟a 所述脂肪酶的漿狀物或脂肪酶溶液與粘合劑具體按體積比為Q. 1: 1 -20: 1互混。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步驟a 具體為將脂肪酶粉均勻*溶于1-10倍重量的水中形成脂肪酶的漿 狀物或脂肪酶溶液，然后再與粘合劑按體積比為0. 1: 1 - 20: 1互混。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步驟c具體為將步驟b所述涂層晾干或冷凍干燥后即得。
10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步驟c 具體為將步驟b所述涂層晾干，晾干后在60 - 150。C短時(shí)間烘焙1-15 分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種脂肪酶的固定化方法，是將脂肪酶的漿狀物或脂肪酶溶液與粘合劑互混，得到粘合劑與脂肪酶的互混漿狀物，將上述互混漿狀物在基布上涂層，干燥后得到固定化脂肪酶。本發(fā)明具有基布的選擇范圍更大、固定化脂肪酶的負(fù)載量大、催化反應(yīng)的壽命長(zhǎng)、方法簡(jiǎn)單、條件要求溫和及易于實(shí)現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N11/00GK101613690SQ20081011573
公開(kāi)日2009年12月30日 申請(qǐng)日期2008年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月27日
發(fā)明者程媛媛, 譚天偉, 陳必強(qiáng) 申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)