專利名稱：一種提高博寧霉素產(chǎn)率的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種博寧霉素(Z-893 )的制備方法，屬于抗生素微 生物發(fā)酵培養(yǎng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
博寧霉素是屬于博萊霉素族的一個(gè)新成員，博萊霉素是一類具有 獨(dú)特結(jié)構(gòu)和獨(dú)特生物活性作用的抗生素，它們的分子結(jié)構(gòu)如下
0々CzNH2 NH2
博萊霉素A2 R= -NH(CH2)S(CH3)
NH
博萊霉素B2 R= -NH-(CH2)4-NH-C-NH 2 博萊霉素A5 R= -NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH2 博萊霉素A6 R= -NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2 博寧霉素 R=-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NHCOCH3 其中，博寧霉素(Boningmydn)是由輪技鏈霉菌平陽變種產(chǎn)生 的，屬于博萊霉素族的一個(gè)新化合物(專利號(hào)為98101253.1,發(fā)明名 稱為 一種抗腫瘤抗生素和其微生物發(fā)酵生產(chǎn)法)。博寧霉素不但具有 抗胂瘤作用，而且對(duì)銀屑病、脂溢性皮炎和乳頭瘤病毒所致的疾病如
3尖銳濕疣、扁平疣等有良好的作用，毒性低，外用無刺激性，具有良 好的應(yīng)用前景。但其通過發(fā)酵培養(yǎng)所產(chǎn)生的活性產(chǎn)物中博寧霉素僅占 約5%以下，甚至只有痕跡量。
因此，為了適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)，并能有效降低成本，本發(fā)明的技術(shù) 人員通過研究，發(fā)現(xiàn)了一種高產(chǎn)率的博寧霉素生產(chǎn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種博寧霉素(Z-893 )的制備方法，釆用 該方法發(fā)酵產(chǎn)生的活性產(chǎn)物中的博寧霉素含量高，具有良好的工業(yè)化 生產(chǎn)前景。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明所述的一種提高博寧霉素(Z-893) 產(chǎn)率的制備方法，包括如下步驟
向博寧霉素的產(chǎn)生菌輪枝鏈霉菌平陽變種(Streptomyces verticillus Var. Pingyangensis n. var)的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加前體物精胺， 然后發(fā)酵培養(yǎng)，并從培養(yǎng)液中回收博寧霉素。
本發(fā)明所述的提高博寧霉素產(chǎn)率的制備方法，其包括如下步驟
1) 將產(chǎn)生博寧霉素的輪枝鏈霉菌平陽變種(5^印tom;;c"
Var. /V"gy""gmy/j ". var)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)得培養(yǎng)液，1升發(fā) 酵培養(yǎng)基中含有0.3 ~ 0.6克的精胺；
2) 然后對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行提取、分離、精制而得博寧霉素。
其中，本發(fā)明釆用了經(jīng)過選育優(yōu)化的輪枝鏈霉菌平陽變種，其為 已知菌種，有關(guān)其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理特征、碳源利用及其產(chǎn) 物的抗菌譜等已有文獻(xiàn)記載(微生物學(xué)報(bào)V19(4)，361-364.1979)。優(yōu) 選為輪技鏈霉菌平陽變種Q835 ( Streptomyces verticillus var PingyangeSisn.spQ835 )及其變株。當(dāng)然，所有能夠產(chǎn)生博寧霉素的 菌種也都應(yīng)屬于本發(fā)明之列。
本發(fā)明采用的用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基中應(yīng)加入可被其利用的 碳源、氮源、無機(jī)鹽、有機(jī)鹽和能被其利用的痕跡量營養(yǎng)物，這些成 份可預(yù)先一次性地加入培養(yǎng)基中或者間歇或連續(xù)地加入培養(yǎng)基中，實(shí)現(xiàn)博寧霉素的高產(chǎn)率。
在發(fā)酵培養(yǎng)基中需要加入博寧霉素前體物精胺，其加入量為
0.03 ~ 0.06%，所加前體物可以是單體游離堿，也可以是它的各種無 機(jī)酸鹽，如鹽酸鹽或硫酸鹽等，還可以是能與之成鹽的有機(jī)酸鹽?？?以是有機(jī)合成品，也可以是天然來源的提取品或粗提品，其加入培養(yǎng) 基的方式可以是預(yù)先一次性地加入，也可以釆用間歇地或連續(xù)地加 入。
具體地說，本發(fā)明所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成按重量比計(jì)為葡萄糖 0.2 ~ 0,8%，淀粉0.5~5.0%,豆餅粉0.5~6.0%,玉米粉0.5~5.0%, 玉米漿0.1~2.0%，氯化鈉0.1 ~0.5%，磷酸二氫鉀0.01 ~ 0.03%，硫 酸鋅0.01 ~ 0.08%,硫酸銅0.001 ~ 0.020%，玉米油0.1~0.5%,精胺 0.03%-0.06%,其余為水，pH6.0~6.5。
培養(yǎng)方式可釆用振蕩培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)或其它方式，但對(duì)大量生產(chǎn) 來說，優(yōu)選的方式為浸沒攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)條件(時(shí)間、濕度、pH等) 隨菌種不同而變化，也隨培養(yǎng)基成分的變化有所不同，本領(lǐng)域技術(shù)人 員能夠根據(jù)具體情況進(jìn)行選擇，當(dāng)發(fā)酵液的生物活性達(dá)到峰值時(shí)終止 培養(yǎng)，根據(jù)其性質(zhì)進(jìn)行分離純化，所得活性復(fù)合物中博寧霉素的含量 比可以達(dá)到25~35%,經(jīng)分離、純化得到的含銅博寧霉素，通過紫外 光譜、質(zhì)譜分析表明所得化合物確為博寧霉素。
具體地說，本發(fā)明所述的發(fā)酵培養(yǎng)過程為將產(chǎn)生博寧霉素的輪 枝鏈霉菌平陽變種菌種接種于斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，在27~29°C 培養(yǎng)6 8天；然后將菌種斜面接種于種子培養(yǎng)基中，在27-29'C旋 轉(zhuǎn)培養(yǎng)30 ~ 60小時(shí)后，再經(jīng)28 ~ 3(TC發(fā)酵培養(yǎng)6 ~ 9天后收獲培養(yǎng) 液。
本發(fā)明所用的斜面培養(yǎng)基組成按重量比計(jì)為葡萄糖0.5~2.0%, 蛋白胨0 ~ 1.0%,淀粉0.3 ~ 1.5%，氯化鈉0.3 ~ 0.7%,瓊脂1.5 ~ 2.5%， 其余為水，調(diào)pH7.2 7.5。
所述的種子培養(yǎng)基的組成為葡萄糖0.2 ~ 0.8%，淀粉1.5 ~ 3.5%, 豆餅粉1.5~4.5%，玉米粉0.5~3.0%,玉米漿0.1 ~0.7%,氯化鈉0.1 ~0.5%,磷酸二氫鉀0.01 ~ 0.02%，硫酸鋅0,01 ~ 0.08%，硫酸銅0.001 ~ 0.020%,玉米油0.1-0.5%,其余為水，自然pH。
本發(fā)明所述的發(fā)酵培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基的成分基本相同，所不同 的是另加了前體物精胺。
所用培養(yǎng)基都需要進(jìn)行滅菌， 一般于12(TC滅菌30分鐘即可。
本發(fā)明所述培養(yǎng)液的提取、分離、精制過程為發(fā)酵培養(yǎng)液用酸 調(diào)pH2.0 3.0，再用堿調(diào)pH5.0 6.5，離心上清液并過濾，濾液通過 離子交換樹脂柱，無鹽水洗后，以0.3 0.5NHC1洗脫，收集活性洗 脫液，調(diào)pH6.2 6.5，再經(jīng)大孔吸附樹脂柱脫鹽，以5-30%丙酮(含 0.01NHC1)溶液洗脫，收集含銅復(fù)合物，進(jìn)行離子交換凝膠柱層析， 并以0.1 1NNH4C1梯度洗脫，按峰位收集含銅活性色帶，大孔吸附 樹脂柱脫鹽后，經(jīng)脫銅處理得博寧霉素。
本發(fā)明所述的博寧霉素的制備方法，以輪枝鏈霉菌為產(chǎn)生菌，通 過向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入前體物精胺，使發(fā)酵產(chǎn)生的有效復(fù)合物中博寧 霉素的含量比大幅度提高至25~35%，具有良好的工業(yè)化生產(chǎn)前景。


圖l為本發(fā)明所述發(fā)酵培養(yǎng)液提取、分離、精制流程圖。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例l
本實(shí)施例所用的產(chǎn)生博寧霉素的菌種為輪技鏈霉菌平陽變種 Q835 ( Streptomyces verticillus var Pingyangesis n. sp Q835 )，其殺牛面培 養(yǎng)基組成為葡萄糖1.0%,蛋白胨0.5%，淀粉1.0%,氯化鈉0.5% 和瓊脂2.0%，其余為水。調(diào)pH7.2,于120 。C滅菌30分鐘，將菌種 接種于此斜面培養(yǎng)基上，在28"C培養(yǎng)8天，將生長良好的菌種斜面 接種于經(jīng)過120 r滅菌30分鐘的種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基的組成 為葡萄糖0.5%,淀粉2.5%,豆餅粉3.2%，玉米粉2.0%,玉米漿 0.5%,氯化鈉0.3%,磷酸二氫鉀0.015%,硫酸鋅0.05%,硫酸銅0.01%,玉米油0.3%,其余為水，自然pH，接種后在28 。C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)48小時(shí) 后，做為種子，用于發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基相同，另加精胺 鹽酸鹽0.05%，調(diào)pH6.0后，同樣于120 。C滅菌30分鐘，將培養(yǎng)好 的種子轉(zhuǎn)種于此發(fā)酵培養(yǎng)基中，29°。培養(yǎng)8天后收獲培養(yǎng)液。
采用本實(shí)施例的高產(chǎn)率發(fā)酵法所得主要組份博寧霉素的產(chǎn)率，在 復(fù)合物中所占比例可達(dá)35%。
如圖l所示，將100升培養(yǎng)液用草酸調(diào)pH至3.0,再用氫氧化鈉 調(diào)pH至6.5過濾，濾液通過離子交換樹脂D151(H+型)，無鹽水洗后， 以0.3NHC1洗脫，收集活性部分調(diào)pH至6.5，再經(jīng)大孔吸附樹脂4006 脫鹽，以10%丙酮(含0.01NHC1)洗脫，收集活性部分，減壓濃縮 至小體積，濃縮液用氨水調(diào)pH至6.5，進(jìn)行CM-Sephadex-C-25(NH4+ 型)柱層析，無鹽水洗柱后，以0.1-1.0N氯化銨梯度洗脫，按峰位 收集，合并，所得博寧霉素部分經(jīng)大孔吸附樹脂4006脫鹽后，冷凍 干燥，可得到5.25克藍(lán)色的博寧霉素含銅品。用含5。/。NaCl和5。/。 EDTA二鈉鹽的水溶液洗脫，去除產(chǎn)物鰲合的銅。
經(jīng)HPLC檢測，產(chǎn)物峰保留時(shí)間與博寧霉素相同，F(xiàn)AB-MS測定， 分子離子峰為1601.6與博寧霉素相同，表明該產(chǎn)物即為博寧霉素。 實(shí)施例2
本實(shí)施例所用的產(chǎn)生博寧霉素的菌種為輪枝鏈霉菌平陽變種 Q835 ( Streptomyces verticillus var Pingyangesis n. sp Q835 ),其殺牛面培 養(yǎng)基組成為葡萄糖2.0%,淀粉0.3%,氯化鈉0.7%和瓊脂2.5%, 其余為水。調(diào)pH7.4，于120 'C滅菌30分鐘，將菌種接種于此斜面 培養(yǎng)基上，在27 。C培養(yǎng)6天，將生長良好的菌種斜面接種于經(jīng)過 12(TC滅菌30分鐘的種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基的組成為葡萄糖 0.8%,淀粉1.5%，豆餅粉4.5°/0,玉米粉3.0%，玉米漿0.1%,氯化 鈉0.5%,磷酸二氫鉀0.01%，硫酸鋅0.08%,硫酸銅0.02%，玉米油 0.1%,其余為水，自然pH，接種后在29 'C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)30小時(shí)后，做 為種子，用于發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基相同，另加精胺0.03%， 調(diào)pH6.0后，同樣于120 t:滅菌30分鐘，將培養(yǎng)好的種子轉(zhuǎn)種于此發(fā)酵培養(yǎng)基中，28'C培養(yǎng)9天后收獲培養(yǎng)液。
采用本實(shí)施例的高產(chǎn)率發(fā)酵法所得主要組份博寧霉素的產(chǎn)率，在 復(fù)合物中所占比例可達(dá)25%。
將100升培養(yǎng)液用草酸調(diào)pH至2.0，再用氫氧化鈉調(diào)pH至6.0 過濾，濾液通過離子交換樹脂D151(lT型)，無鹽水洗后，以0.5N鹽 酸洗脫，收集活性部分調(diào)pH至6.2,再經(jīng)大孔吸附樹脂4006脫鹽， 以5%丙酮(含0.01N HC1)洗脫，收集活性部分，減壓濃縮至小體 積，濃縮液用氨水調(diào)pH至6.5，進(jìn)行CM-Sephadex-C-25 ( NH/型) 柱層析，無鹽水洗柱后，以0.1 1.0N氯化銨梯度洗脫，按峰位收集， 合并，所得博寧霉素部分經(jīng)大孔吸附樹脂4006脫鹽后，冷凍干燥， 可得到3.75克藍(lán)色的博寧霉素含銅品。用含5% NaCl和5% EDTA 二 鈉鹽的水溶液洗脫，去除產(chǎn)物鰲合的銅。
經(jīng)HPLC檢測，產(chǎn)物峰保留時(shí)間與博寧霉素相同，F(xiàn)AB-MS測定， 分子離子峰為1601.6與博寧霉素相同，表明該產(chǎn)物即為博寧霉素。
、本實(shí)施例所用的產(chǎn)生博寧霉素的菌種為輪枝鏈霉菌平陽變種 Q835 ( Streptomyces verticillus var Pingyangesis n. sp Q835 ),其斜面培 養(yǎng)基組成為葡萄糖0.5%，蛋白胨1.0%,淀粉1.5%,氯化鈉0.3% 和瓊脂1.5%,其余為水。調(diào)pH7.5，于120 。C滅菌30分鐘，將菌種 接種于此斜面培養(yǎng)基上，在29。C培養(yǎng)8天，將生長良好的菌種斜面 接種于經(jīng)過120 。C滅菌30分鐘的種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基的組成 為葡萄糖0.2%，淀粉3.5%,豆餅粉1.5%,玉米粉5.0%,玉米漿 0.7%,氯化鈉0.1%,磷酸二氫鉀0.03%,硫酸鋅0.01%,硫酸銅0.01%, 玉米油0.5%，其余為水，自然pH,接種后在27。C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)60小時(shí)
后，做為種子，用于發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基相同，另加精胺 硫酸鹽0.06%,調(diào)pH6.0后，同樣于120 。C滅菌30分鐘，將培養(yǎng)好 的種子轉(zhuǎn)種于此發(fā)酵培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)6天后收獲培養(yǎng)液。
采用本實(shí)施例的高產(chǎn)率發(fā)酵法所得主要組份博寧霉素的產(chǎn)率，在 復(fù)合物中所占比例可達(dá)30%。將100升培養(yǎng)液用草酸調(diào)pH至2.0，再用氫氧化鈉調(diào)pH至5.0 過濾，濾液通過離子交換樹脂D151(I^型)，無鹽水洗后，以0.4N鹽 酸洗脫，收集活性部分調(diào)pH至6.5，再經(jīng)大孔吸附樹脂4006脫鹽， 以30%丙酮(含0.01NHC1)洗脫，收集活性部分，減壓濃縮至小體 積，濃縮液用氨水調(diào)pH至6.5,進(jìn)行CM-Sephadex-C國25 (NH/型) 柱層析，無鹽水洗柱后，以0.1 1.0N氯化銨梯度洗脫，按峰位收集， 合并，所得博寧霉素部分經(jīng)大孔吸附樹脂4006脫鹽后，冷凍干燥， 可得到4.5克藍(lán)色的博寧霉素含銅品。用含5% NaCl和5% EDTA 二 鈉鹽的水溶液洗脫，去除產(chǎn)物鰲合的銅。
經(jīng)HPLC檢測，產(chǎn)物峰保留時(shí)間與博寧霉素相同，F(xiàn)AB-MS測定， 分子離子峰為1601.6與博寧霉素相同，表明該產(chǎn)物即為博寧霉素。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳 盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本 領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ) 上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1、一種提高博寧霉素產(chǎn)率的制備方法，該方法包括如下步驟先將產(chǎn)生博寧霉素的輪枝鏈霉菌平陽變種(Streptomyces verticillus Var.Pingyangensis n.var)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)得培養(yǎng)液；然后對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行提取、分離、精制；其特征在于，發(fā)酵過程中1升發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.3～0.6克的精胺。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的菌種 為輪枝鏈霉菌平陽變種Q835( ^epto附y(tǒng)cas veWds var/^Mgy朋g&s7》 ".^Q835 )及其變株。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的制備方法，其特征在于，所述的 精胺為單體游離堿、精胺鹽酸鹽、精胺硫酸鹽、精胺其它無機(jī)酸鹽或 能與之成鹽的有機(jī)酸鹽中的一種。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1~3任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于， 所述發(fā)酵培養(yǎng)為將產(chǎn)生博寧霉素的輪枝鏈霉菌平陽變種菌種接種于 斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，在27 29。C培養(yǎng)6-8天；然后將菌種斜面 接種于種子培養(yǎng)基中，在27-29'C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)30 60小時(shí)后，再用于 發(fā)酵，28 3(TC培養(yǎng)6 9天后收獲培養(yǎng)液。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l-4任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于， 所述培養(yǎng)液的提取、分離、精制過程為發(fā)酵培養(yǎng)液通過離子交換樹 脂交換，大孔吸附樹脂脫鹽，離子交換凝膠柱層析，再經(jīng)脫銅處理得 博寧霉素。
全文摘要
本發(fā)明提供一種提高博寧霉素(Z-893)產(chǎn)率的制備方法，該方法采用向博寧霉素的產(chǎn)生菌輪枝鏈霉菌平陽變種(Streptomycesverticillus Var.Pingyangensis n.var)的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加前體物精胺，然后發(fā)酵培養(yǎng)，并從培養(yǎng)液中回收博寧霉素。該方法使發(fā)酵產(chǎn)生的有效復(fù)合物中博寧霉素的含量比大幅度提高至25～35％。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101608200SQ20081011536
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2008年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月20日
發(fā)明者瑞 張, 石蓮英, 許鴻章, 陳汝賢, 敏 魯 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所