專利名稱：利用分/離子譜實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，提供了一種利用分/離子譜實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥的方法，可用于多種藥物 種類、劑量和組合的選擇，輔助醫(yī)生預(yù)測藥物對(duì)患者的療效，針對(duì)具體患者找到適宜的藥物、 藥物用量和藥物組合。
背景技術(shù)：
藥物是臨床治療的重要手段之一，但當(dāng)前藥物治療過程當(dāng)中普遍存在藥物的療效和不良 反應(yīng)具有個(gè)體差異的現(xiàn)象。在臨床治療中，患者經(jīng)相同途徑接受相同劑量的藥物后，治療反
應(yīng)往往差異很大。有的患者療效顯著，有的患者沒有療效或療效甚微，而另一些患者卻已出 現(xiàn)了明顯的毒性反應(yīng)。療效好又沒有毒性反應(yīng)的患者只占接受治療患者的一部分。從給藥到 產(chǎn)生藥效是一個(gè)復(fù)雜的過程，年齡、體重、疾病狀態(tài)、遺傳因素、飲食及合并用藥等個(gè)體的 生理差異和病理特點(diǎn)都會(huì)影響藥物的體內(nèi)的代謝分解過程，以致相同用藥方案產(chǎn)生的臨床反 應(yīng)不盡相同。因此，實(shí)現(xiàn)藥物治療個(gè)體化不僅是當(dāng)今藥理學(xué)和臨床藥物治療學(xué)的發(fā)展方向， 而且具有十分重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
藥物劑量和所產(chǎn)生的藥理強(qiáng)度受很多因素影響，存在很大的個(gè)體差異，因此理想的用藥 方案應(yīng)當(dāng)是根據(jù)每例病人的具體情況訂制實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥。在醫(yī)藥臨床工作中，用藥個(gè)體化 主要通過憑借臨床醫(yī)藥人員的多年工作經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)臨床癥狀，盡可能使用藥適合每例病人的 需要。如苯妥英鈉常用劑量為每日300 mg，對(duì)一部分病人尚不能預(yù)防癲癇發(fā)作，但對(duì)另一部 分病人卻已引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)。這就要求醫(yī)藥人員掌握藥物的藥理作用和藥理反 應(yīng)指標(biāo)，每例病人的藥動(dòng)學(xué)情況，而且要求醫(yī)藥人員要有豐富的科學(xué)知識(shí)和臨床經(jīng)驗(yàn)。這種 憑經(jīng)驗(yàn)調(diào)整用藥方案的方法具有一定的不科學(xué)性、盲目性和冒險(xiǎn)性，準(zhǔn)確性不高，容易延誤 治療時(shí)機(jī)，影響患者的健康并導(dǎo)致醫(yī)療資源的浪費(fèi)。對(duì)那些治療指數(shù)低，安全范圍窄，不良 反應(yīng)大，還有一些非線性藥物動(dòng)力學(xué)特征的藥物依靠這種用藥方式則更加危險(xiǎn)。
目前所廣泛應(yīng)用的科學(xué)手段是以測定藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，血藥濃度指標(biāo)，控制癥狀、計(jì)算 出病人體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，然后再根據(jù)這些參數(shù)計(jì)算出用藥的個(gè)體化方案。根據(jù)腎功能 (腎清除率)調(diào)整用藥劑量和給藥間隔時(shí)間也有報(bào)道。國內(nèi)外用于實(shí)驗(yàn)室的基因分析技術(shù)， 包括測序、基因芯片、熒光PCR等手段均是通過檢測患者的基因型來實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥。這些 檢測方法分別有價(jià)格昂貴，檢測速度慢，技術(shù)穩(wěn)定性和結(jié)果可靠性較差，操作復(fù)雜等缺點(diǎn)， 不易推廣到臨床應(yīng)用。
3本發(fā)明針對(duì)目前治療過程中用藥種類和劑量難以確定的情況，提供了一種方便、快捷的 輔助臨床醫(yī)生制定個(gè)體化用藥方案的利用分/離子譜體外預(yù)測患者對(duì)藥物反應(yīng)的方法。具體說 來是通過選擇或特異性識(shí)別分Z離子信息手段，以活體或體外培養(yǎng)材料為樣品，獲得進(jìn)出樣品 的各種分/離子絕對(duì)濃度及其變化、分/離子流動(dòng)速率及其變化、分/離子流動(dòng)方向及其變化等 樣本所有的分/離子時(shí)空特征的信息，建立各種分/離子信息的關(guān)系數(shù)據(jù)庫，通過對(duì)比分析判 斷患者對(duì)某種藥物、藥物劑量和藥物組合的敏感性。

發(fā)明內(nèi)容
一種利用分/離子譜實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥的方法，該方法以患者活體采集或體外培養(yǎng)的細(xì)胞或 組織為樣本，測定施加藥前后樣本的分/離子信息，包括多種分/離子絕對(duì)濃度及其變化、分/ 離子流動(dòng)速率及其變化、分/離子流動(dòng)方向及其變化等樣本所有的分/離子時(shí)空特征的信息， 對(duì)各種分/離子信息進(jìn)行分析歸納，通過與具體患者使用不同種類、不同劑量和不同組合藥物 的療效信息進(jìn)一步整合及進(jìn)行相關(guān)性分析，得出某種藥物、某種劑量和某種藥物組合對(duì)該患 者具有最佳療效的信息，直接個(gè)體化指導(dǎo)該患者的臨床用藥。
現(xiàn)有的個(gè)體化判斷患者對(duì)藥物反應(yīng)的方法，無論是憑借醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)還是測定患者的 血藥濃度和腎清除率，都需先對(duì)患者施藥，待患者自身產(chǎn)生了療效、無效或毒副作用后作出 相應(yīng)判斷，而本發(fā)明則是在對(duì)患者施藥前僅僅依靠其少量組織或細(xì)胞體外預(yù)測該患者對(duì)某種 藥物、藥物劑量和藥物組合的反應(yīng)，避免了對(duì)患者試探施藥的健康風(fēng)險(xiǎn)，做到有的放矢，同 時(shí)減少了患者的醫(yī)療支出。本發(fā)明基于分子、離子水平判斷患者對(duì)藥物的敏感性，較比上述 方法不僅準(zhǔn)確性高，而且更快捷、有效；所需樣本材料僅為患者的少量組歡或細(xì)胞，取材方 便，易于實(shí)施。
通過對(duì)患者基因型的分析確立個(gè)體化用藥方案必須建立在已知某具體病癥由某一特定基 因控制的前提下，但多數(shù)疾病并非由一個(gè)基因控制而是受多個(gè)基因共同影響，況且目前大多 數(shù)疾病所對(duì)應(yīng)的基因并未完全被了解，所以該法實(shí)施起來具有很大的局限性。從基因到人體 細(xì)胞的生理功能和表現(xiàn)過程是一個(gè)極為復(fù)雜的表達(dá)和修飾過程，即使掌握了病人的基因型， 病人對(duì)于藥物的反應(yīng)還受到其年齡、體重和飲食狀況等諸多因素的影響，如何用藥還具有很
大的不確定性。判斷患者的基因型需經(jīng)由DNA到PCR到對(duì)比分析等一系列繁雜程序，而本 發(fā)明所采用的方法通過測定反映患者細(xì)胞的生理功能的分/離子譜，更加直接、簡便、快捷， 通過計(jì)算機(jī)直接輸出結(jié)果，有效節(jié)約了醫(yī)務(wù)工作者的人力資源，并為患者節(jié)約了寶貴的治療 時(shí)間。本發(fā)明可滿足多種藥物、不同藥物劑量、不同藥物組合的多重對(duì)比同時(shí)進(jìn)行，應(yīng)用范 圍廣，個(gè)體化水平高。


圖1為乳腺癌細(xì)胞耐藥株MCF-7/R和敏感株MCF-7/S加藥GOpg/ml ADR)前后pHe 的變化圖。圖中結(jié)果來自5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的代表性數(shù)據(jù)。
圖2為乳腺癌細(xì)胞耐藥株MCF-7/R和敏感株MCF-7/S加藥(10嗎/ml ADR)前后H+流 的變化圖。圖中結(jié)果來自5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的代表性數(shù)據(jù)。
圖3為MCF7細(xì)胞外H+活性加藥UO嗎/ml ADR)前后的變化圖。圖中箭頭所示為H+ 選擇性微電極在MCF7細(xì)胞附近外環(huán)境的監(jiān)測點(diǎn)。每個(gè)柱形的數(shù)據(jù)為5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值。
圖4為不同患者對(duì)解熱止痛藥泰諾(Tylenol)的離子流動(dòng)速度差異圖。
圖5為不同濃度化療藥物紫杉醇(PTX)對(duì)同一患者腫瘤組織Hn普影響的變化曲線。樣 品編號(hào)為007。 A中紫杉醇的濃度為lOpg/ml, B中為100嗎/ml， C中為100fig/ml。
圖6為不同化療藥物對(duì)同一患者腫瘤組織H+影響的變化曲線。樣品編號(hào)為009。 A為施 加濃度為10ng/ml的阿霉素EPI， B為施加8pg/ml的吡柔比星THP， C為施加100嗎/ml的紫 杉醇PTX。上述濃度均為廠家建議使用濃度。
圖7為不同患者對(duì)相同濃度紫杉醇H+不同反應(yīng)的變化曲線。A為樣品為007， B為樣品 008， C為樣品009。濃度為廠家建議使用濃度。
具體實(shí)施例方式
取患者的少量組織、細(xì)胞直接為樣本材料或通過體外培養(yǎng)手段獲得樣本材料。將待測樣 本置于樣本檢測池中，施加藥物于檢測液中，使用選擇或特異性檢測分子/離子信息的微電極， 于分/離子譜檢測平臺(tái)上檢測和記錄樣本的分/離子信息的變化，獲得分/離子譜。對(duì)各分/離子 譜進(jìn)行關(guān)聯(lián)比較分析，獲得該患者對(duì)不同藥物種類、藥物劑量、藥物組合的敏感性數(shù)據(jù)，從 而實(shí)現(xiàn)體外預(yù)測患者對(duì)藥物的反應(yīng)。
實(shí)施例
實(shí)施例1
不同人乳腺癌細(xì)胞在化療藥物阿霉素處理下H+流動(dòng)方向和速率的變化 細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞阿霉素(ADR)敏感株MCF-7/S及耐藥株MCF-7/R由首都醫(yī) 科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。ADR對(duì)MCF-7敏感細(xì)胞系的IC50 (半數(shù)生長抑 制濃度)為0.12262 g/ml,對(duì)MCF-7/ADR耐藥細(xì)胞系的IC50為36.55036 g/ml。使用高糖DMEM 培養(yǎng)基，含10%小牛血清和雙抗(青霉素100嗎/ml、鏈霉素10(Hig/ml)，置于37°C、 5% C02 的恒溫箱中傳代培養(yǎng)。檢測時(shí)，通過顯微形態(tài)觀察，選擇貼壁良好的健康細(xì)胞進(jìn)行H+活性檢 測。氫離子譜的獲得使用非損傷微測系統(tǒng)(BIO-001A， Younger USA Sci.&Tech. Corp., USA) 以靜態(tài)和動(dòng)態(tài)的方式選擇性地測定H+譜。H+選擇性微電極(XY-H-01型)在預(yù)先確定距離(5 30pm)的兩點(diǎn)間重復(fù)運(yùn)動(dòng)，從而測得特定離子的絕對(duì)濃度或濃度梯度，微電極的運(yùn)動(dòng)頻率設(shè) 定在0.01 10.00 Hz范圍內(nèi)。接地參比電極(DRIREF-2; World Precision Instruments)為固
體電極。
H+選擇性微電極在使用前必須經(jīng)過校JE，只有能斯特斜率(Nernstian slopes) >56 mv/decade的電極才可使用。檢測時(shí)將MCF-7及MCF-7/R細(xì)胞的DEME培養(yǎng)液換為專用測 試液，在三維運(yùn)動(dòng)控制子系統(tǒng)的控制下，電極在距離細(xì)胞表面2nm左右的位置以dFl(Him的 移動(dòng)距離，在垂直于培養(yǎng)皿底的方向上對(duì)細(xì)胞的H+流進(jìn)行檢測，將測試液更換為含lOpg/ml ADR的專用測試液后，檢測相同的細(xì)胞，對(duì)比加藥前后MCF7細(xì)胞外H+活性的變化。
通過上述措施，在獲得乳腺癌細(xì)胞(MCF-7/S及MCF-7/R) pHe (附圖l)的同時(shí)，獲得 跨膜H+流的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)信息(附圖2)。加藥前，耐藥株的pHe值持續(xù)穩(wěn)定的高于敏感株；而加 藥后，二者的pHe值出現(xiàn)巨大反差。敏感株和耐藥株的pHe值均下降，但敏感株的pHe值明顯 高于耐藥株，且二者的pHe值差也顯著增大(附圖l)。附圖2中H+流速為正值時(shí)表示H+外流， 即流出細(xì)胞；為負(fù)值表示H+內(nèi)流，即流入細(xì)胞。耐藥株和敏感株加藥前后H+的內(nèi)流或外流均 呈現(xiàn)振蕩的特征，振蕩幅度的變化不盡相同。加藥前，耐藥株的IT流速基本穩(wěn)定，內(nèi)流與外 流夂替；敏感株的H"大多數(shù)時(shí)間成內(nèi)流趨勢，流速不斷發(fā)生變化。在加藥后，由于弱堿性藥 物的作用，耐藥株的H+全部外流，且流速增大；敏感株的H+出現(xiàn)內(nèi)流與外流交替，外流速率 較內(nèi)流速率明顯增大。加藥后IT流振蕩的幅度耐藥株明顯比敏感株大，且耐藥株IT流加藥后 振蕩幅度明顯比加藥前增強(qiáng)，而敏感株加藥前后振蕩幅度變化不明顯。加藥后，耐藥株的lf 外流速率明顯高于敏感株，而兩者的pHe也相應(yīng)降低，且耐藥株降低幅度明顯大于敏感株。 分別對(duì)耐藥株及敏感株5個(gè)細(xì)胞所測得的lT流變化進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)(附圖3)。耐藥株加藥前凈 H+流接近零，加藥后H+強(qiáng)烈外流，均值為34.7picomoles/cm々s;敏感株加藥前凈H+流呈明顯 內(nèi)流(-17.4picomoles/cm2/s)，加藥后H+轉(zhuǎn)為外流(7.5 pico moles/cm2/s)。
人乳腺癌細(xì)胞耐藥株和敏感株分別代表不同的典型患者即耐藥患者和敏感患者的細(xì)胞， 二者對(duì)化療藥物ADR的敏感程度明顯不同。該實(shí)施例有效證明了根據(jù)分/離子譜來判斷患者 腫瘤細(xì)胞對(duì)某種化療藥物是否敏感是有效且可行的。 實(shí)施例2
不同患者對(duì)解熱止痛藥泰諾的差異性反應(yīng)
解熱止痛藥泰諾(Tylenol),又稱撲熱息痛、泰諾止痛片等，適用于感冒發(fā)燒、關(guān)節(jié)痛、 神經(jīng)痛及偏頭痛、癌性痛及術(shù)后止痛。該藥抑制外周前列腺素合成作用弱，對(duì)血小板凝血機(jī)制無影響，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)前列腺素合成的作用與阿司匹林相似，因此對(duì)阿司匹林不耐受 或過敏者不適用。口服吸收迅速，完全，在體液內(nèi)分布均勻，大邰分在肝臟代謝，中間代謝 產(chǎn)物對(duì)肝臟有毒，以葡萄糖醛酸結(jié)合物形式或從腎臟排泄，半衰期一般為1 4h。常規(guī)的用 量為每次口服0.25~0.56， l日3 4次，l日量不宜超過2g,療程不宜超過10日。
患者M(jìn)arkHallen和YueXu同一時(shí)間分別服用相同劑量的泰諾，同時(shí)取二者的口腔上皮細(xì) 胞為樣本，氫離子、鈣離子和鉀離子信息的獲得同實(shí)施例1中氫離子的獲得。
兩患者用藥后，Ca2+、 K+和H+的平均流動(dòng)速度具有明顯差異(附圖4)。 二者的(^2+和1^ 均呈現(xiàn)內(nèi)流，IT呈現(xiàn)外流?；颊進(jìn)arkHallen的cV+流動(dòng)的平均速率是患者YueXu的二倍以上。 與此同時(shí)，患者M(jìn)axkHAllen的K+流動(dòng)的平均速率略高于患者YueXu。 二者H+流動(dòng)的平均速率 較大，均超過了50 pico moles/cm2/s?；颊遈ueXu的H+流動(dòng)的平均速率更高，達(dá)到65 pico moles/cm2/s，而患者M(jìn)arkHallen的H+流動(dòng)的平均速率較低，為55 picomoles/cm々s左右。
上述實(shí)施例說明不同的患者對(duì)解熱止痛藥泰諾的敏感程度差異很大，應(yīng)針對(duì)患者個(gè)體化 用藥。 實(shí)施例3
以三名患者的乳腺癌穿刺組織為待測材料，編號(hào)分別為007、 008和009，組織取出后于 美國揚(yáng)格科技公司提供的專用溶液中進(jìn)行檢測，采集加藥前后H+譜信息(此處為H+速率和 方向)。H+流速為正值時(shí)表示H+外流，即流出樣品；負(fù)值表示H+內(nèi)流，即流入樣品。
樣品編號(hào)姓名性別年齡病歷號(hào)取樣日期取樣時(shí)間取樣位置
007吳某某女性43歲200803119:30 AM右乳腫物
008彭某某女性55歲2008031210:15 AM右乳腫物
009白某女性70歲2008031911:00 AM左乳腫物
比較同一患者的乳腺癌穿刺組織對(duì)施加不同濃度化療藥物紫杉醇的IT譜的變化。編號(hào)為
007的患者的乳腺癌腫瘤組織的H+譜在紫杉醇為10 pg/ml時(shí)基本穩(wěn)定的在0上下略微浮動(dòng)，加 藥對(duì)其未造成顯著影響，沒有明顯的H+流速變化(附圖4 A)。當(dāng)紫杉醇的加藥量提高到IOO 嗎/ml時(shí)，加藥后，H+迅速以高速率內(nèi)流，而后逐漸恢復(fù)，最終趨于平緩直到穩(wěn)定在O周圍(附 圖4B)。當(dāng)紫杉醇的量提高到IOOO ng/ml時(shí)，H+全部呈現(xiàn)內(nèi)流，內(nèi)流幅度為IOO pg/ml時(shí)的數(shù) 百倍，并持續(xù)2000秒仍未結(jié)束且保持穩(wěn)定的內(nèi)流狀態(tài)，隨時(shí)間的延長速率逐漸降低(附圖4 C)。 由此可判斷，患者007的腫瘤組織對(duì)1000 tig/ml的紫杉醇最為敏感。
比較同一患者的乳腺癌穿刺組織施加不同化療藥物的H+譜變化，藥物濃度均為廠家建議體外實(shí)驗(yàn)用藥濃度。樣品編號(hào)為009的患者對(duì)不同化療藥物的H+響應(yīng)明顯不同，施加濃度為IO 嗎/ml的表阿霉素EPI和8嗎/ml的吡柔比星THP對(duì)該患者的乳腺癌組織的H+信息未造成顯著影 響(附圖5 A、 B)，而施加IOO pg/ml的紫杉醇PTX則使該患者的腫瘤組織的H+表現(xiàn)出敏感特 征(附圖5C)。由此可判斷，患者009的腫瘤組織對(duì)紫杉醇較比另外兩種化療藥物敏感。
分別對(duì)三位患者的樣品007、 008和009施加100pg/ml的紫杉醇，比較不同患者乳腺癌穿刺 組織外Hn普加藥前后的變化。加藥后，樣品007和008均出現(xiàn)H+的吸收，但強(qiáng)度不同，樣品007 的H+迅速呈現(xiàn)大幅度內(nèi)流，而后隨時(shí)間逐漸恢復(fù)(附圖6A);樣品008在加藥后的H+也出現(xiàn)了 內(nèi)流反應(yīng)，但速率不及樣品007的二分之一，且速率迅速恢復(fù)到O左右(附圖6 B)。與上述二 者不同，樣品009在加藥后，H+顯著迅速外流，出現(xiàn)較強(qiáng)的H+外排，速度是樣品007內(nèi)流速率 的4倍，是樣品008內(nèi)流速率的8倍左右，此后迅速恢復(fù)到加藥前的水平(附圖6C)。該結(jié)果說 明不同患者的乳腺癌組織對(duì)相同濃度化療藥物的敏感程度顯著不同。
上述實(shí)施例證明，利用分/離子譜可有效判斷不同乳腺癌患者對(duì)不同藥物和藥物劑量的敏 感性。1000 tig/ml的紫杉醇對(duì)患者007最為有效，紫杉醇對(duì)患者009較比另外兩種化療藥物更為 有效，100pg/ml的紫杉醇對(duì)患者007、 008和009的療效不同。
權(quán)利要求
1、一種利用分/離子譜實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥的方法，其特征是通過對(duì)患者活體或體外培養(yǎng)材料施加不同種類、劑量和組合的藥物，測得的施加藥物前后靜態(tài)和動(dòng)態(tài)分/離子譜；將該分/離子譜與不同種類、劑量和組合的藥物的療效數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，獲得個(gè)體化指導(dǎo)患者用藥的方案。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用分/離子譜實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥的方法，其特征在于靜態(tài)和動(dòng)態(tài) 分/離子譜包括分/離子種類、分/離子絕對(duì)濃度及其變化、分/離子流動(dòng)速率及其變化、分/ 離子流動(dòng)方向及其變化等樣本所有的分/離子時(shí)空特征的信息。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用分/離子譜實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥的方法，屬醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。該方法以患者活體采集或體外培養(yǎng)材料為樣本，測定施加藥物前后樣本的各種分/離子譜，通過分析歸納該分/離子譜與患者使用藥物療效的相關(guān)性，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化指導(dǎo)患者用藥的目的。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101608207SQ20081011529
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2008年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月20日
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