專利名稱:用于篩選和鑒定低豐度小rna表達譜的新型小rna芯片的制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領域:
本發(fā)明屬于基因芯片技術(shù)領域,更具體地涉及一種新型的小RNA的寡核苷酸探針和使用所述寡核苷酸探針制備的小RNA芯片,并且涉及一種能夠富集低豐度、低分子量(<40nt)的小RNA的方法。本發(fā)明可以顯著提高基因芯片檢測細胞/組織中低豐度的小RNA的靈敏度和特異性。本發(fā)明的小RNA芯片可用于制備鑒定和比較細胞分化前后小RNA的變化,通過檢測小RNA表達譜而鑒定細胞/組織的特異性,以及診斷和評價腫瘤細胞的來源和分化程度的試劑盒。
背景技術(shù):
小RNA,核酸的長度在21-35個核酸堿基之間的非蛋白質(zhì)編碼核酸序列,廣泛存在于各種生物體中。目前小RNA至少可以分為六類微核酸(miRNA),小的非編碼核酸(tncRNA),短的干擾核酸(siRNA),重復結(jié)合的小干擾核酸(rasiRNA),小的調(diào)節(jié)核酸(smRNA)以及與Piwi相互作用的核酸(piRNA)[1,2]。在上述六類核酸中miRNA被研究的最為廣泛[3]。這些miRNA是從蛋白編碼基因的內(nèi)含子或外顯子以及非蛋白編碼基因轉(zhuǎn)化而來。目前已有幾百個miRNA被克隆并被測序[4,5]。從小RNA發(fā)現(xiàn)的歷史來看,大多數(shù)小RNA是通過實驗方法鑒定的[6,7,8],而且通過使用焦磷酸測序(pyrosequence)技術(shù)越來越多的小RNA,包括miRNA,siRNA以及21U-RNA被鑒定出來。雖然克隆和測序是鑒定新的小RNA最常用的方法,但低豐度的小RNA卻常被漏掉[9]。經(jīng)典克隆測序的方法要求大量的總RNA,而在樣品數(shù)量有限的情況下得到相當量的總RNA會遇到困難。為了避免上述局限性,人們發(fā)展了許多預測小RNA的方法[10-13],這包括計算機篩選,芯片檢測,比較基因組分析以及從已經(jīng)存在的小RNA基因結(jié)構(gòu)預測它與啟動子,終止子結(jié)合的結(jié)構(gòu)。因為含高密度核苷酸的基因芯片已經(jīng)表現(xiàn)出檢測mRNA表達的強大威力,因而用基因芯片檢測并確證小RNA的表達有可能獲得成功。出于上述目的有些研究人員已經(jīng)發(fā)展出利用組合方法鑒定新的miRNA的方法,例如Bentwich[13]通過綜合運用計算機預測和芯片分析發(fā)現(xiàn)了一些新的miRNA。其它幾個獨立的研究組也報道微矩陣芯片是高通量探測miRNA表達譜的有效的,靈敏的,而且是專一的檢測方法[14-23]。但以往的芯片檢測探針為20個左右的寡核苷酸,與樣品中的小RNA相互作用的強度不夠高,對于低分子量和低豐度的小RNA的檢測中存在著漏檢的問題,同時目前采用的檢測探針容易受樣品中的小RNA前體的干擾。因而提高探針檢測小RNA的靈敏度和專一性以及提供高質(zhì)量的小RNA純化樣品,提高小RNA尤其是分子量低于40個堿基的實驗樣品是進一步發(fā)現(xiàn)新的具有重要生物功能的小RNA需要克服的主要技術(shù)瓶頸。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠通過綜合使用小RNA的結(jié)構(gòu)預測,小RNA的富集技術(shù)以及通過包括用特定方法制備的探針的小RNA芯片的高通量檢測,鑒定從人蛋白編碼基因的內(nèi)含子區(qū)生成的小RNA分子,提高檢測小RNA信號的靈敏度以及提高對樣本中低豐度小RNA的檢測能力。
在本發(fā)明的第一方面,提供了一種能高效結(jié)合成熟小RNA的新型寡核苷酸探針,如圖1所示,以及制備這種探針的方法。這種探針由三個部分組成共有序列1,與成熟小RNA雜交的序列專一性寡核苷酸部分2(即,雜交序列2)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)3,探針的總長度為40-70個堿基,其中能識別成熟小RNA的雜交序列2的長度為15-35個堿基,其特征在于,DNA探針部分2的5’端還連接著10-30個堿基的高GC含量的無義鏈DNA序列(發(fā)夾結(jié)構(gòu)3),例如,但不限于,CCGGCCTATTATGGCCGG(本領域的技術(shù)人員應該理解,本發(fā)明不限于所舉例中的序列,包括各種能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列),此序列能形成一種發(fā)夾結(jié)構(gòu);在探針部分2的3’端連有一段共同的核苷酸序列1,例如,但不限于,TTTTTTTTTT或AAAAAAAAAAA。當用于本文時,本領域的技術(shù)人員應該理解,所述“共有序列1”或“共同的核苷酸序列1”是指按照常規(guī)方法在大部分的寡核苷酸探針中都可以使用的寡核苷酸序列,也可以叫作“通用序列”。在每條寡核苷酸探針的與芯片基質(zhì)相連端(探針的3’端)帶有氨基連接基團,能夠和涂布在基因芯片的載體(例如,玻璃片)表面的有機硅聚合物通過Schiff堿反應固定在芯片表面,從而容易點樣到涂有有機硅的載體(例如,玻璃板)上而制成基因芯片。
另外,所述寡核苷酸探針中能夠與成熟小RNA形成互補結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸中的每一個核苷酸可以是自然無修飾的,也可以是經(jīng)不同化學方法修飾的,如肽核苷酸(PNA)、閉鎖核苷酸(LNA)、或甲氧-或乙氧修飾的核苷酸。
與現(xiàn)有技術(shù)的寡核苷酸探針(其不包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)3,為直鏈探針)相比較,本發(fā)明的寡核苷酸探針的優(yōu)點在于,除了共有序列1和專一性雜交序列2之外,在探針部分2的5’端還連接著發(fā)夾結(jié)構(gòu)3(即,10-30個堿基的高GC含量的能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的無義鏈DNA序列)。所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)3形成較大的發(fā)夾環(huán),其優(yōu)點在于,使得所述寡核苷酸探針提供了較大的空間阻抑作用,避免與小RNA的前體或更長的同源片段雜交,提高了探針針對小于40nt的小RNA的特異性。
在一個優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的寡核苷酸探針的方法,其包括在常規(guī)直鏈探針的5’端連接上發(fā)夾結(jié)構(gòu)3。
在檢測新的小RNA時,該探針制備方法的新穎性在于選擇了通過計算機設計獲得的或已鑒定的潛在小RNA的正義鏈和反義鏈DNA序列,該序列只能與成熟的小RNA片段雜交,形成互補的二聚體,而不能與小RNA的前體或更長的同源片段雜交形成互補的二聚體。這是因為較大的發(fā)夾環(huán)的阻抑作用。所以這種DNA探針可以提高探針與待檢測樣品中的互補小RNA的特異性結(jié)合,降低非特異性背景信號,提高檢測的靈敏度,更適合于檢測樣本中的低豐度的成熟的小RNA(圖5和6)。這樣成功地去除了小RNA前體的影響。
本發(fā)明的第二方面提供應用本發(fā)明第一方面的寡核苷酸探針而制備的小RNA芯片。本發(fā)明第一方面的寡核苷酸探針的3’端帶有氨基連接基團,能夠和涂布在基因芯片的載體(例如,玻璃片)表面的有機硅聚合物通過Schiff堿反應固定在芯片表面,從而容易點樣到涂有有機硅的載體(例如,玻璃板)上而制成基因芯片。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明的小RNA芯片可用于制備鑒定和比較不同細胞之間,正常細胞和腫瘤細胞之間或細胞分化前后小RNA的變化,通過檢測小RNA表達譜而鑒定細胞/組織的特異性,以及診斷和評價腫瘤細胞的來源和分化程度的試劑盒。
本發(fā)明的第三方面在于改良了小RNA樣品純化和富集方法。目前分離樣品中的總RNA以及mRNA的常規(guī)的標準操作程序[15-21]并不適合低豐度、低分子量的小RNA的純化與回收,其實驗成本高,純化的產(chǎn)量低,而每次芯片檢測需要至少1μg的小RNA,按照常規(guī)方法通常需要進行3-5次純化,才能滿足進行芯片雜交檢測的實際需要,增加了實驗的勞動和時間成本。然而,按照本發(fā)明的方法,采用兩步法可以獲得高純度、高回收率(至少1μg)的小RNA,尤其是低分子量,堿基數(shù)小于40的小RNA(本發(fā)明的兩步法在下文稱為“聯(lián)合方法”)。
然而,本領域的技術(shù)人員應該理解,本發(fā)明的小RNA分子的純化、富集方法還可以用來純化和富集長度為40-200nt的小RNA。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中,小RNA純化、回收的第一步可以采用商品化的miRNA提取試劑盒,如美國Ambion公司的mirVana(貨號為1560),先從樣品中富集堿基數(shù)為200以及更小的小RNA,將洗脫出來的小RNA組分用乙醇沉淀法回收,然后將該沉淀組分在直徑為4厘米,高度為4厘米的玻璃管電泳柱(見圖2)內(nèi)進行瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳的電流和電壓根據(jù)具體情況調(diào)節(jié),以達到能將小于40的小RNA與大于40的RNA片段完全分離的目的。電泳儀可為國產(chǎn)或進口的產(chǎn)品,例如,BioRed的PowerPac,以分離收集堿基數(shù)低于40的小RNA。但是,本發(fā)明不局限于直徑為4厘米和高度為4厘米的玻璃管電泳柱,其直徑和高度范圍為1cm到10cm,選擇的原則是一次性獲得1μg左右的小RNA分子。所獲得的小RNA用RNA定量試劑盒,如美國Invitrogen公司的RiboGreenTM試劑盒(貨號R-11490)進行定量。用該方法可一次性獲得足量的短的小RNA,以便用于進一步的RNA標記和雜交分析。
圖1.新型小RNA檢測探針的結(jié)構(gòu)示意圖。探針的藍色部分表示芯片上的每一條DNA探針中的相同的共有序列部分1,黑線部分表示每一條探針中的專一性雜交寡核苷酸序列2,綠色部分是每一條探針中相同的能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核苷酸序列3。該探針的3’端通過氨基與芯片載體的活性基團連接。
圖2.改進的小RNA柱狀電泳裝置的正視圖。圖2A,制膠裝置圖;圖2B,電泳裝置圖。
圖3.本發(fā)明實施例1中采用的實驗步驟、主要方法以及某些實驗參數(shù)的流程圖。實施例1中包括新的小RNA預測,樣品的富集和純化,小RNA標記,芯片雜交以及小RNA表達譜的分析。
圖4.用美國Ambion公司的mirVana miRNA分離試劑盒獲得的小RNA的電泳分析。用mirVana miRNA分離試劑盒將從細胞中分離純化的總RNA(TOT)進一步分離純化為堿基數(shù)高于200(HMW)以及低于200(LMW)的RNA組分。圖4A和4B給出了1微克RNA的各樣品經(jīng)1.2%的變性瓊脂糖凝膠(圖4A)和15%變性聚丙烯酰胺凝膠(圖4B)的電泳圖。
圖5.用改良的大直徑(4厘米)的玻璃管電泳,從低于200(LMW)的RNA組分中分離純化出低于40nt的RNA用于進一步的分子雜交試驗。圖5給出了分別來自A549和HLF細胞的10微克RNA的各樣品的RNA印跡(Northern Blot)雜交圖。圖中30nt大小的雜交帶顯示來自兩種不同富集方法(即,純化低于200nt的小RNA的常規(guī)方法和純化低于40nt的小RNA的本發(fā)明的聯(lián)合方法)的差異。
圖6.傳統(tǒng)的直鏈小RNA探針與新型小RNA檢測探針的特異性比較。其中,“傳統(tǒng)的”為傳統(tǒng)的直鏈探針(不包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)3),其不但能與成熟的(Mature)(<40nt)小RNA片段雜交,形成互補的二聚體,也能與小RNA的前體(Precursor)(>60nt)或更長的同源片段雜交形成互補的二聚體;“改進的”為本發(fā)明的探針,因為較大的發(fā)夾環(huán)的阻抑作用,其只能與成熟的(<40nt)小RNA片段雜交,形成互補的二聚體,而不能與小RNA的前體或更長的同源片段雜交形成互補的二聚體。所以這種DNA探針可以提高探針與待檢測樣品中的互補小RNA的特異性結(jié)合,降低非特異性背景信號,提高檢測的靈敏度,更適合于檢測樣本中的低豐度的成熟的小RNA。
圖7.單獨用mirVana miRNA試劑盒以及用本發(fā)明的聯(lián)合方法分離的小RNA進行基因芯片檢測小RNA表達譜的比較??俁NA用mirVanamiRNA試劑盒分為堿基數(shù)高于200的高分子量組分(HMW)和堿基數(shù)低于200的低分子量組分(LMW)。隨后低分子量組分進一步分為兩個組分,其中一個組分的RNA大于40個堿基,另一組分的RNA小于40個堿基(Enrich(富集))。為了評價這兩種操作在小RNA芯片分析上的差異,40-200nt的低分子量RNA(圖7A,LMW)和小于40nt-RNA(圖7B)經(jīng)熒光探針標記后在小RNA芯片上進行雜交。圖7A和圖7B的雜交掃描譜的前三行給出的某些強信號點代表實驗中的不同對照。圖7C給出了這兩張芯片中相應探針處信號強度的定量比較。
圖8.小RNA芯片技術(shù)能夠檢測骨髓干細胞分化前后小RNA的差異表達。骨髓干細胞分化前(BMSC)(圖8A)和分化后(HSC)(圖8B)的總RNA分為堿基數(shù)低于200的大分子量組分和堿基數(shù)低于40的低分子量組分。低分子量組分經(jīng)熒光探針標記后在小RNA芯片上進行雜交。圖8C給出了這兩張芯片中相應探針處信號強度的定量比較。
圖9.小RNA基因芯片技術(shù)可區(qū)分不同細胞類型的小RNA表達譜。從骨髓干細胞(BMSC)(藍色),人纖維母細胞(HLF)(黃色)和A549細胞(紅色)分離的總RNA純化成高分子量RNA和低分子量RNA(LWM)。低分子量RNA經(jīng)標記后雜交,并計算出三種不同細胞類型的雜交總熒光強度信號(圖9A)。圖9B給出了每一種細胞中可鑒定的小RNA的數(shù)目,并分解成在三種細胞中共同出現(xiàn)的,在每兩種細胞中共同出現(xiàn)的以及僅在某一種細胞中出現(xiàn)的小RNA的數(shù)目。圖9C給出了三種不同細胞中小RNA表達譜的熒光強度分布。
具體實施例方式 以下將通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。但是,本領域的普通技術(shù)人員應該理解,下述實施例僅是用于舉例說明的目的,并不限制本發(fā)明的保護范圍,本發(fā)明的精神和范圍由后附的權(quán)利要求所限定。本領域有關(guān)的技術(shù)人員完全可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思和所公開的技術(shù)方案,進行不背離本發(fā)明的精神和范圍的修改和變動,這也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
實施例1 用基因芯片檢測方法從人基因組中的內(nèi)含子以及蛋白編碼區(qū)鑒定小RNA 雖然本實施例僅限于小RNA基因芯片檢測的探針制備和用于低豐度小RNA的純化、富集的方法,為便于說明本發(fā)明的應用,本實施例介紹一個比較完整的小RNA的高通量測定來檢測經(jīng)計算機預測分析可能存在的小RNA。圖3給出了從人基因組中的內(nèi)含子以及蛋白編碼區(qū)鑒定小RNA的實驗流程圖。
1.芯片的制備 從人編碼基因的相關(guān)數(shù)據(jù)庫中下載了21000條內(nèi)含子序列(http://www.meduohio.edu/bioinfo/eid/index.html),通過計算機預測分析發(fā)現(xiàn)具有生成小RNA可能的內(nèi)含子序列有1256條,從中隨機選出536條序列,這些序列的宿主基因包括多種功能基因如與轉(zhuǎn)錄因子、細胞周期、細胞凋亡、信號通路、代謝調(diào)節(jié)等有關(guān)。采用美國應用生物系統(tǒng)公司3900型高通量DNA合成儀合成這些序列。利用上述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈做為小RNA俘獲探針的一部分(即,專一性寡核苷酸序列2),該部分的核苷酸的平均長度為25個堿基,它的3’端與共有序列1的5’端相接,在它的5’端接上15個堿基組成的無義鏈寡核苷酸(即,發(fā)夾結(jié)構(gòu)3),使得每一條核苷酸探針的總長度約為50個堿基。將每條探針的3’端進行氨基修飾,使之能夠和玻璃板上的聚合硅發(fā)生共價反應從而固定到芯片表面。然后將這些探針分別在用于制備芯片的玻璃板上平行點樣三次,每張芯片上共含4080個探針點樣點,其中的864個探針點為不同的對照探針。對照探針包括內(nèi)源性和外源性的陽性和陰性探針,其中tRNA,let-7,U6和U2 snRNA(序列見表1)作為內(nèi)源性陽性探針,另外還合成了多個外源性陰性探針(序列見表1)。
表1.實施例1中所用的一些探針(包括一些陽性探針和陰性探針)的序列。
芯片的制備采用涂有有機硅的Corning GAPS-2玻璃板(目錄號#40003,供應商Corning Inc.,美國)為支持材料,并用SmartArray點樣機(型號SmartArray-48,供應商CapitalBio Corp,中國)點樣,每個探針點的直徑為150μm,相鄰探針點中心間的距離為240μm,點完探針樣品后讓玻璃片在室溫下干燥24小時,然后按下述方法清洗掉未共價結(jié)合的DNA和點樣緩沖液把玻璃片放在一個燒杯中并在燒杯中放一個攪拌子,在25℃用0.2%的SDS洗滌兩次,每次5分鐘,然后在50℃用蒸餾水洗兩次,每次5分鐘,再在25℃用0.1M四氫硼二鈉溶液洗滌5分鐘,用0.2%SDS洗滌三次,每次1分鐘,用蒸餾水洗2次,每次1分鐘。將玻璃片室溫下于空氣中徹底晾干后用于雜交檢測。
本實施例中的小RNA芯片可以進一步制成試劑盒,所述試劑盒包括本發(fā)明的小RNA芯片,以及本領域的技術(shù)人員已知的檢測所需要的各種試劑。
2.低豐度小RNA的純化和標記 人的A549腫瘤細胞系(ATCC No.HTB-22,美國)作為純化低豐度小RNA材料的一個例子。按照美國Invitrogen公司提供的實驗操作說明書,收集2×105個細胞,經(jīng)生理鹽水洗滌后用Trizol試劑提取細胞中的總RNA,混合在其中的基因組DNA用美國Ambion公司的不含RNase的DNase I分解去除。RNA的純化量用紫外260nm的光吸收測量。RNA的純度通過測量樣品在260nm和280nm處的光吸收的比值來評價。260nm/280nm的比值在1.8-2.0之間表示RNA的純化質(zhì)量好。RNA的完整性通過瓊脂糖凝膠電泳檢測分子量分別為5000個堿基和1900個堿基的28S和18S的核糖體RNA而說明(圖4)。出現(xiàn)清晰的28S和18S核糖體核酸條帶表明所純化的RNA保持著高度的完整性,相反如果發(fā)現(xiàn)28S和18S條帶變得彌散,表明所制備的RNA發(fā)生了顯著的降解。為了避免mRNA降解的影響,可以用試劑盒如Sigma公司的CelLytic NuCLEARTM抽提試劑盒(目錄號N-XTRACT.46)先把細胞核從細胞中分離出來。總RNA可以分別從細胞核和細胞漿中提取。然后用美國Ambion公司的mirVana miRNA試劑盒(目錄號AM1560)從總RNA中富集大小為200nt及用改良的大直徑(直徑為4厘米)的玻璃管電泳,從低于200(LMW)的RNA組分中分離純化出低于40nt的RNA用于進一步的分子雜交試驗(圖7)。低分子量小RNA的量可以用美國Invitrogen公司的RiboGreenTM試劑盒(目錄號R-11490)進行定量。
純化的小RNA經(jīng)T4連接酶和過量的5’-磷酸-胞苷-尿苷-cy3(5′-phosphate-cytidyl-uridyl-Cy3-3′)供體與小RNA受體的3’-羥基定量連接[19,24],進行標記。15μl的核酸標記反應體系中含2μg的低分子量RNA(<200nt)或200ng的小RNA(<40nt),0.5mM ATP,50mM HEPES(pH7.8),5mM DTT,20mM MgCl2,150mg/ml PEG,10mg/ml BSA,10%DMSO,1000ng的5’-磷酸-胞苷-尿苷-Cy3和3個活力單位的T4連接酶,25℃反應2小時。
3.陣列雜交和檢測結(jié)果分析比較 3.1陽性對照探針的檢測結(jié)果 將標記的小RNA與芯片上的寡核苷酸探針用通用的雜交方法[15-21]雜交后,用LuxScan 10K-A芯片掃描儀(型號LuxScanTM 10K-A,供應商CapitalBio Corp,中國)記錄各寡核苷酸探針位置處被標記的小RNA熒光探針的熒光發(fā)射強度,并用計算機軟件,如Axon公司的GenePix Pro4.0進行分析。和小RNA let-7a(序列見表1)相比,小RNA let-7c(序列見表1)、let-7f(序列見表1)的序列只有一對堿基不能配對,而let-7a探針檢測到的信號明顯的比let-7c和let-7f探針檢測到的信號強2.1倍[25],并且用已被廣泛使用的小RNA探針檢測到的結(jié)果具有明顯的可重復性[26,27]。
3.2傳統(tǒng)的直鏈小RNA探針與新型小RNA檢測探針的特異性比較 參見圖6,比較了傳統(tǒng)的直鏈小RNA探針與新型小RNA檢測探針的特異性。本發(fā)明的探針只能與成熟的(<40nt)小RNA片段雜交,形成互補的二聚體,而不能與小RNA的前體(>60nt)或更長的同源片段雜交形成互補的二聚體(圖6“改進的”)。這是因為較大的發(fā)夾環(huán)的阻抑作用。所以,本發(fā)明的這種DNA探針可以提高探針與待檢測樣品中的互補小RNA的特異性結(jié)合,降低非特異性背景信號,提高檢測的靈敏度,更適合于檢測樣本中的低豐度的成熟的小RNA。相反,傳統(tǒng)的直鏈探針(不包含發(fā)夾結(jié)構(gòu))不但能與成熟的(<40nt)小RNA片段雜交,形成互補的二聚體,也能與小RNA的前體(>60nt)或更長的同源片段雜交形成互補的二聚體(圖6“傳統(tǒng)的”)。可見改進后的探針大大提高了小RNA芯片檢測成熟RNA片段的特異性。
3.3本發(fā)明的純化和富集小RNA的聯(lián)合方法的優(yōu)點 圖7比較了僅用mirVana miRNA試劑盒純化的大小在200nt及其以下的小RNA以及進一步用本發(fā)明的聯(lián)合方法純化的大小為40nt及其以下的小RNA與本發(fā)明所制備的寡核苷酸探針雜交的不同結(jié)果。以A549細胞為例,用mirVana miRNA試劑盒純化的小RNA通過用包括本發(fā)明的探針的小RNA基因芯片檢測可以獲得66種具有明顯信號的小RNA(圖7A),而用聯(lián)合方法純化的小RNA樣品經(jīng)與相同的芯片探針雜交后可以探測到203種具有顯著信號的小RNA(圖7B)。用本發(fā)明的聯(lián)合方法所給出的檢測信號強度也比用前一種方法高出幾倍至10多倍(圖7C)。利用本發(fā)明的寡核苷酸探針可以有效去除堿基數(shù)高于40的小RNA與檢測探針的雜交,正如用本發(fā)明的聯(lián)合方法所富集的小RNA樣品給出較前一種方法所富集的RNA樣品給出的顯著變強的檢測信號(圖7C)所表明的。
實施例2 檢測細胞分化前后基因表達的差異 人骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)(來源知情的病人)經(jīng)誘導處理后分化為造血干細胞(HSC細胞)[28]。收集分化前和分化后的細胞,并用實施例1所述的聯(lián)合方法提取小RNA(<40nt)后,用包括實施例1中的小RNA檢測芯片的試劑盒檢測分化前和分化后的小RNA表達譜的變化,如圖8A,圖8B所示。定量分析可以確定其中的13種小RNA(序列見表2,SEQ ID No.1-13)在細胞分化后被顯著下調(diào),另外4種小RNA(序列見表2,SEQ ID No.14-17)被顯著上調(diào),如圖8C所示。
實施例3 通過檢測小RNA表達譜鑒定細胞/組織的特異性 本實施例采用三種人源性細胞分化前的人骨髓干細胞(BMSC)(來源知情的病人),人纖維母細胞(HLF)(ATCC No.CCL-186,美國)和人A549細胞(ATCC No.HTB-22,美國)。從上述三種細胞中分離純化小RNA后,采用包括實施例1中的小RNA檢測芯片的試劑盒進行檢測并分析檢測信號的差異。圖9A顯示BMSC和HLF細胞中被檢測到的小RNA的總熒光信號沒有顯著的差別,而和A549細胞相比,A549中可被檢測到的小RNA熒光信號顯著降低,比較可檢測到的各小RNA的熒光強度差異可以發(fā)現(xiàn)有10種小RNA(序列見表3,SEQ ID No.36-45)是這三種細胞所共有的,而有5種小RNA(序列見表3,SEQ ID No.31-35)僅在BMSC細胞中表達,另外6種小RNA(序列見表3,SEQ ID No.25-30)僅在HLF細胞中表達,有7種小RNA(序列見表3,SEQ ID No.18-24)僅在A549細胞中表達,這種特異表達的小RNA譜可以成為鑒定細胞/組織特異性的一種實驗方法。
表3.小RNA在不同細胞中的表達。
注釋表3中提供的序列是人工合成的寡核苷酸序列,其與芯片上的探針序列互補,但是本領域的技術(shù)人員應該理解,在廣泛意義上,所述序列包括相應的sRNA序列。
參考文獻
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IB083242序列表.ST25
SEQUENCE LISTING
<110>中國科學院生物物理研究所
<120>用于篩選和鑒定低豐度小RNA表達譜的新型小RNA芯片的制備方法和應用
<130>IB083242
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<170>PatentIn version 3.1
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atcctcctgc ctcagcctcc 20
權(quán)利要求
1.一種檢測低豐度小RNA的寡核苷酸探針,其特征在于,從5’端到3’端依次由下述三部分組成第一部分為共同的無義寡聚核苷酸(1),第二部分為能與成熟小RNA雜交的序列專一性寡聚核苷酸(2),第三部分為發(fā)夾結(jié)構(gòu)(3),其是由高CG含量組成的可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的無義鏈核苷酸。
2.按照權(quán)利要求1所述的寡核苷酸探針,其中所述寡核苷酸探針具有下述特征之一所述寡核苷酸探針的總長度在40-70個堿基之間,所述寡核苷酸探針中能夠與成熟小RNA雜交的寡聚核苷酸(2)的長度在15-40堿基之間,或者發(fā)夾結(jié)構(gòu)(3)的長度在10-30堿基之間。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的寡核苷酸探針,其中所述第一部分的共同的無義寡核苷酸(1)為TTTTTTTTTT或AAAAAAAAAAA,所述第三部分的由高CG含量組成的可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的無義鏈核苷酸(3)為CCGGCCTATTATGGCCGG,或者所述第二部分的能夠與成熟小RNA形成互補結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸(2)中的每一個核苷酸是無修飾的,或者是經(jīng)不同化學方法修飾的,如肽核苷酸(PNA)、閉鎖核苷酸(LNA)、或甲氧-或乙氧-修飾的核苷酸。
4.一種制備權(quán)利要求1或2所述的寡核苷酸探針的方法,其包括在常規(guī)直鏈探針的5’端連接上發(fā)夾結(jié)構(gòu)(3)。
5.一種用于篩選和鑒定低豐度小RNA表達譜的小RNA芯片,其包括權(quán)利要求1所述的寡核苷酸探針。
6.一種試劑盒,其包括按照權(quán)利要求5所述的小RNA芯片。
7.按照權(quán)利要求6所述的試劑盒的應用,其用于檢測不同細胞之間、正常細胞和腫瘤細胞之間或細胞分化前后基因表達的差異,或者通過檢測小RNA表達譜而鑒定細胞/組織的特異性,或者診斷和評價腫瘤細胞的來源和分化程度。
8.按照權(quán)利要求7所述的應用,在人骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)分化前后,表達水平被顯著下調(diào)的小RNA包括SEQ ID No.1-13,表達水平被顯著上調(diào)的小RNA包括SEQ ID No.14-17。
9.按照權(quán)利要求7所述的應用,在分化前的人骨髓干細胞(BMSC)、人纖維母細胞(HLF)和A549細胞中都表達的小RNA包括SEQ ID No.36-45,僅在BMSC細胞中表達的小RNA包括SEQ ID No.31-35,僅在HLF細胞中表達的小RNA包括SEQ ID No.25-30,僅在A549細胞中表達的小RNA包括SEQ ID No.18-24。
10.一種適合于基因芯片檢測的小RNA分子的純化和富集方法,其特征在于聯(lián)合使用提取小RNA的分離柱和玻璃管電泳柱來富集長度<40nt的小RNA的實驗方法。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新型的小RNA芯片,用于篩選和檢測那些已被鑒定或預測的內(nèi)源性shRNA、miRNA和/或其它類型的小RNA,和介紹專用于小RNA的寡核苷酸探針的制備以及低豐度小RNA的純化和富集方法。該短小核苷酸捕獲探針由三部分組成;第一部分為共同序列(1),第二部分為能與成熟小RNA雜交的寡核苷酸(2),第三段為由高CG含量組成的可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的無義鏈核苷酸(3)。樣品中低豐度的小于40nt的小RNA可通過聯(lián)合使用小RNA分離柱和大管徑制備電泳來富集。該方法可靈敏地檢測到細胞/組織中低豐度表達的小RNA分子,可用于鑒定和比較細胞分化前后小RNA的變化,以及診斷和評價腫瘤細胞的來源和分化程度。
文檔編號C12N15/11GK101608232SQ20081011518
公開日2009年12月23日 申請日期2008年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月18日
發(fā)明者殷勤偉, 趙春華, 張洪杰 申請人:中國科學院生物物理研究所