專利名稱：提取用于轉(zhuǎn)基因植物成分檢測(cè)的飼料dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取用于轉(zhuǎn)基因植物成分檢測(cè)的詞料DNA的方法。
背景技術(shù)：
隨著我國人民生活水平的提高和全面進(jìn)入小康社會(huì)，人們對(duì)畜產(chǎn)品的安全、質(zhì)量 要求越來越高。所以，為獲得高質(zhì)量的畜產(chǎn)品，我們政府從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的飼料屆和養(yǎng) 殖屆中尋求可持續(xù)發(fā)展途徑。飼料安全是指飼料生產(chǎn)必須對(duì)動(dòng)物健康和生長、人類健 康和生活、生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展不會(huì)產(chǎn)生不良影響。飼料安全涉及到原料來源、生 產(chǎn)加工、儲(chǔ)存運(yùn)輸和飼喂等多個(gè)方面?，F(xiàn)在看來，原料來源在詞料安全中顯得尤為重 要，因?yàn)樵谏锛夹g(shù)的推動(dòng)下，轉(zhuǎn)基因作物的種植面積越來越大，用于生產(chǎn)飼料的轉(zhuǎn) 基因作物原料越來越多。
自1983年，世界上第一列轉(zhuǎn)基因作物問世以來，轉(zhuǎn)基因作物的種類和種植面積 正在擴(kuò)大。近些年來，轉(zhuǎn)基因作物遍及到了我國各地，截止到2001年底，經(jīng)過農(nóng)業(yè) 部安全評(píng)價(jià)批準(zhǔn)進(jìn)入田間環(huán)境釋放的轉(zhuǎn)基因植物有水稻、玉米、棉花、大豆、油菜等 10種。隨之一來，越來越多的轉(zhuǎn)基因作物作為飼料原料被動(dòng)物所食用，已知大部分 植物DNA比較穩(wěn)定，在加工過程后仍保持完整，這些DNA作為食物進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)。 至于隨著食物在動(dòng)物體內(nèi)消化過程的繼續(xù)，轉(zhuǎn)基因DNA成分的降解程度及其能否被 動(dòng)物吸收等問題備受人們的關(guān)注。Tony等人研究發(fā)現(xiàn)Btl76轉(zhuǎn)基因玉米的外源DNA 在雞肉的胃腸道中僅有部分被降解，仍有大部分DNA能夠抵抗消化道酶和微生物作 用而殘留。朱元招等人檢測(cè)了豬回腸末端食糜、糞便中轉(zhuǎn)基因DNA成分，發(fā)現(xiàn)有全 部或絕大部分DNA成分被降解，據(jù)推測(cè)這是由于豬對(duì)日糧消化時(shí)間比較長而日糧在 雞體內(nèi)通過速度較快的原因。雖然人們?cè)谛∈?、雞、豬和牛體內(nèi)研究了轉(zhuǎn)基因成分代 謝殘留狀況，結(jié)果均為陰性。但是我們一般認(rèn)為，高拷貝數(shù)DNA可在血液、脾臟和 骨骼肌等組織器官中檢出。
而且，目前的科學(xué)水平還不能精確地預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)基因成分所導(dǎo)致的遺傳變異效應(yīng)，所 以，對(duì)轉(zhuǎn)基因飼料可能存在的安全問題進(jìn)行全面的評(píng)價(jià)已迫在眉睫。國際上對(duì)轉(zhuǎn)基因 產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識(shí)的呼聲也不斷高漲，日本、韓國等國都通過立法建立飼料的限制法規(guī)和 標(biāo)識(shí)制度。我國對(duì)轉(zhuǎn)基因問題一貫持謹(jǐn)慎態(tài)度，于2002年頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物 標(biāo)示管理辦法》，規(guī)定作為飼料原料的轉(zhuǎn)基因豆粕、玉米、油菜籽粕必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)。
目前，我國還沒有對(duì)飼料中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行限量，但為了確保動(dòng)物產(chǎn)品對(duì)人類健康的安全性，有必要對(duì)飼料中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測(cè)。飼料中的轉(zhuǎn)基因成分分為植 物源和動(dòng)物源兩種，這里我們針對(duì)植物源成分，即轉(zhuǎn)基因作物?？捎糜谠~料的轉(zhuǎn)基因 作物包括轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、油菜籽、棉花籽和馬鈴薯等。
目前，可用于檢測(cè)飼料中轉(zhuǎn)基因作物成分的方法有多種，但按其原理大致可分為
兩類基于DNA的PCR檢測(cè)方法和基于蛋白質(zhì)的ELISA檢測(cè)方法。在PCR檢測(cè)的 過程中，對(duì)飼料中總DNA的提取純化的要求比較高。因?yàn)橹谱黠暳闲枰獙⒆魑锍煞?進(jìn)行加工、不同程度的配比以及添加輔助成分，這些因素都不同程度地增加了DNA 提取的難度。所以，從飼料中提取高質(zhì)量的DNA在飼料轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中顯得尤為 關(guān)鍵。
因?yàn)樵~料大多數(shù)成分均源于植物，所以，詞料DNA提取技術(shù)多借鑒與植物DNA 提取方法。目前，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室提取飼料DNA采用高鹽低pH值法、SDS法、CTAB 法或直接購買試劑盒。王培訓(xùn)、張英等分別與1999和2004年對(duì)這些方法進(jìn)行了總結(jié) 和評(píng)論，幾種DNA提取方法各自具有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)，下面分類作簡單介紹。
高鹽低pH值法先用含低劑量SDS的緩沖液裂解樣品，然后用高鹽低pH值的 溶液沉降雜質(zhì)萃取DNA，再經(jīng)反復(fù)洗滌后即可得到高純度的DNA產(chǎn)物。利用該方 法，Salah已經(jīng)提取了小麥、大麥、馬鈴薯、大豆、梨、杏等多種植物DNA。此方法 特點(diǎn)為所用試劑、價(jià)格低廉、容易配置和保存，產(chǎn)物純度高，A260/A280比值在 1.9 2.0之間。
SDS法利用含高劑量SDS的緩沖液裂解樣品，然后通過酚、仿混合液反復(fù)抽 提，最后利用TE溶液溶解即可得到目的DNA產(chǎn)物。目前，SDS法普遍應(yīng)用于植物、 動(dòng)物和微生物等樣品的DNA提取，王景雪應(yīng)用SDS法提取了玉米、蘋果、谷子、油 菜等多種植物DNA。此方法特點(diǎn)為應(yīng)用廣泛，針對(duì)大多動(dòng)植物原料均可適用，提 取的DNA產(chǎn)量大。但是，SDS作為一種陰離子去污劑，高劑量的SDS在裂解細(xì)胞 的同時(shí)也釋放出大量的糖類和蛋白質(zhì)，容易造成DNA產(chǎn)物污染，質(zhì)量下降，現(xiàn)在， 一些改良后的SDS方法針對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行了改善，提取的DNA產(chǎn)物質(zhì)量也逐漸提高。
CTAB法應(yīng)用含不同濃度CTAB的裂解液批次處理樣品，充分裂解樣品細(xì)胞， 然后經(jīng)酚、仿混合液反復(fù)抽提，再利用乙醇洗滌，最后用TE溶解DNA產(chǎn)物。CTAB 同樣作為一種陰離子去污劑，對(duì)植物細(xì)胞壁具備很強(qiáng)的裂解作為，可以大量的釋放細(xì) 胞內(nèi)DNA、糖類和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，不過CTAB與DNA形成可以溶于高鹽溶液的復(fù) 合物，當(dāng)降低溶液中鹽濃度時(shí)，DNA析出，從而可以有效去除產(chǎn)物中糖類和蛋白質(zhì) 等雜質(zhì)。目前，改良后的CTAB法種類較多、應(yīng)用較廣，在此不一一敘述。
本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了若干套改良CTAB法提取伺料總DNA的實(shí)驗(yàn)方案，經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷與分析，最后，我們優(yōu)化出一條成本低廉、耗時(shí)短、提
取DNA產(chǎn)物質(zhì)量高的改良CTAB法。
玉米是世界上重要的糧食作物之一，也是動(dòng)物飼料中植物源成分的重要組成部 分，其單位面積產(chǎn)量位居榜首。1999年世界上轉(zhuǎn)基因作物種植面積最大的是抗除草 劑大豆(占轉(zhuǎn)基因植物總面積的54%)，其次為轉(zhuǎn)基因玉米(占28%) 。 MON810 轉(zhuǎn)基因玉米是Monsanto公司運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)手段開發(fā)推廣的轉(zhuǎn)基因玉米，該玉米 中導(dǎo)入的Cry I A (b)基因可抗歐洲玉米螟，其商業(yè)化種植以來受到種植業(yè)主廣泛歡 迎。鑒于MON810轉(zhuǎn)基因玉米在飼料中應(yīng)用的廣泛性，檢測(cè)飼料中是否含有該玉米 成分的存在已成為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因飼料項(xiàng)目的重要組成部分。
我國對(duì)于轉(zhuǎn)基因玉米MON810的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)頒布，"玉米中轉(zhuǎn)基因成分定性 PCR檢測(cè)方法"SN/T 1196-2003文件為我們檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MON810提供了檢測(cè)方 法。但是，飼料組成成分更為復(fù)雜，在飼料中檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MON810的難度也加 大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提取用于轉(zhuǎn)基因植物成分檢測(cè)的詞料DNA的方法，以及 該方法的專用提取液。
本發(fā)明所提供的提取飼料DNA的專用提取液，是含有81.816g/L氯化鈉，121.1g/L 三羥甲基氨基甲垸，74.448g/L乙二胺四乙酸，20g/L十六烷基三甲基溴化胺，pH值 為8.0的溶液。
本發(fā)明所提供的提取飼料DNA的方法，包括下述步驟-
1) 將飼料加入到上述提取飼料DNA的專用提取液中混勻，使所述飼料與所述 提取液的比例為lg: 10ml，加入p-巰基乙醇至終濃度為0.2。/。(體積比)，于65。C溫 浴25-30min，離心得到上清液；
2) 將步驟l)得到的上清液加入是所述上清液l倍體積的異丙醇混勻，-2(TC靜 置15min，然后離心得到初步DNA沉淀；
3) 將步驟2)得到的DNA沉淀溶解后，加入TE緩沖液溶解，并加RNA酶至終 濃度10ug/ml， 37。C消化；所述TE緩沖液為含有12.11 g/L三羥甲基氨基甲垸，3.722g/ L乙二胺四乙酸pH值為8.0的溶液；
4)將步驟3)得到的RNA酶消化后的DNA溶液與是所述DNA溶液1倍體積 的Tris飽和酚混合，輕緩搖勻10min，離心收集上層液；
5)將步驟4)得到的上層液與是所述上層液l倍體積的氯仿和異戊醇體積比為 25: 24: 1的混合液混合，離心收集上層液；6)將步驟5)得到的上層液與是所述上層液l倍體積的氯仿與異戊醇的體積比 為24: l的混合液混合，離心收集上層液，即得到飼料DNA溶液。
所述方法中，還可包括沉淀所述飼料DNA的步驟，所述沉淀DNA的方法是所 述飼料DNA溶液中加入1倍體積冰乙醇和1/10體積的3mol/L NaAc溶液，輕緩顛倒 混勻，-20°(:放置10min，得到絲絮狀DNA沉淀。
所述方法中，還可包括對(duì)DNA沉淀的漂洗3次的步驟，所述漂洗的方法為用75% 乙醇漂洗所述DNA沉淀3min。
所述方法中，所述步驟l)中，所述提取的過程中，每隔5分鐘對(duì)提取液輕緩顛 倒混勻。
所述方法中，所述步驟1)中，還包括將飼料在液氮中研磨至粒徑為100um以下 的粉末。
所述方法中還可包括將得到的DNA沉淀干燥后用TE緩沖液溶解；所述TE緩 沖液為含有12.11 g/L三羥甲基氨基甲烷，3.722g/L乙二胺四乙酸pH值為8.0的溶液。
所述方法中，所述離心的溫度均為4。C，離心力為18514g。
本發(fā)明的方法針對(duì)伺料中含有大量的淀粉和飼料添加輔助成分等對(duì)DNA提取造 成很大障礙的物質(zhì)，為了消除這些物質(zhì)對(duì)DNA提取過程中造成的影響，本發(fā)明的方 法一方面在DNA提取流程起初階段將這些蛋白、淀粉等成分通過裂解后離心去除， 然后用異丙醇處理，留取含DNA的沉淀物，再開始后續(xù)的純化過程；另一方面通過 改進(jìn)提取液，用改進(jìn)提取液裂解釋放DNA，使裂解更充分，過程步驟簡化；這樣的措 施既減少原料DNA在裂解過程中的斷裂和損失，又大大的提高了DNA產(chǎn)物質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)證 明本發(fā)明的方法提取飼料DNA，能除去飼料中蛋白、酚和糖類雜質(zhì)的干擾，得到高 質(zhì)量的DNA產(chǎn)物，可直接用于PCR方法定性檢測(cè)伺料中的轉(zhuǎn)基因成分，是精度高、 耗時(shí)短、成本低、產(chǎn)物純度高的DNA提取與純化技術(shù)。


圖1為本發(fā)明關(guān)于飼料DNA提取流程圖。
圖2為本發(fā)明方法提取飼料DNA產(chǎn)物的電泳圖。
圖3為本發(fā)明方法提取的詞料DNA中玉米內(nèi)參基因IVR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。 圖4為本發(fā)明方法提取的飼料DNA中玉米內(nèi)參基因Zein擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。 圖5為本發(fā)明方法提取的飼料DNA中玉米MON810外源基因CaMV 35S擴(kuò)增 產(chǎn)物的電泳圖。
圖6為本發(fā)明方法提取的飼料DNA中玉米MON810基因組和外源基因CaMV35S連接位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。
圖7為本發(fā)明方法提取的詞料DNA中玉米MON810外源基因HSP70和CryIA(b) 連接位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。
具體實(shí)施例方式
卜述實(shí)施例所述的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。 下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。 實(shí)施例l、用本發(fā)明方法提取飼料DNA及其效果驗(yàn)證
1、 提取飼料DNA過程中使用的試劑的配制
1) 本發(fā)明的提取飼料DNA的專用提取液的配制
在800mL去離子水中加入81.816 g氯化鈉(NaCl) ， 121.1g三羥甲基氨基甲烷 (Tris) ， 74.448g乙二胺四乙酸(EDTA) ， 20g十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)，用 玻璃棒攪拌，待溶液冷卻至室溫，調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，則固體物質(zhì)慢慢溶解， 定容1L，分裝后高壓(121°C， 20min)滅菌即得到提取飼料DNA的專用提取液， 將其于室溫保存。
2) TE緩沖液(10xTris-EDTA)
在800mL水中溶解12.11 g三羥甲基氨基甲烷(Tris) ， 3.722g乙二胺四乙酸 (EDTA)，玻璃棒攪拌，冷卻至室溫后調(diào)pH值至8.0，定容1L，分裝后高壓(12rC， 20min)滅菌，室溫保存。
2、 提取飼料DNA 1)配制實(shí)驗(yàn)用飼料
實(shí)驗(yàn)用飼料分對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組兩種，對(duì)照組飼料玉米成分為非轉(zhuǎn)基因玉米，實(shí)驗(yàn) 組詞料玉米成分為轉(zhuǎn)基因玉米MON810，飼料配方如表1所示。其中，石粉10kg (寧 ?？h嘉和化工有限公司，飼料級(jí)沸石粉)；磷鈣9.4kg (上海彩鳳詞料磷鈣有限公司， 飼料級(jí)磷酸二氫鈣)；微量元素為1.5kg (北京邦士富生物科技有限公司，豬微量元 素復(fù)合預(yù)混料)；維生素為0.3g (北京邦士富生物科技有限公司，豬專用BSF復(fù)合 維生素)；菜粕50kg (錫林郭勒盟紅井源油脂有限責(zé)任公司)；魚粉(無棣順通生 物開發(fā)有限公司，脫脂魚粉)。對(duì)照組飼料和實(shí)驗(yàn)組飼料均按照表1所示飼料配方配 制而成，實(shí)驗(yàn)組飼料將轉(zhuǎn)基因玉米MON810代替非轉(zhuǎn)基因玉米。
表1.對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組飼料配比方案玉米豆粕麥麩石粉食鹽魚粉磷鈣微量維生菜粕總量(kg)
(kg)(kg)(kg)(kg)(kg)(kg)(kg)元素 (kg)素 (g)(kg)
對(duì)照組719143.242.8103.8209.41.50.3501000
實(shí)驗(yàn)組719143.242.8103.8209.41.50.3501000
2)提取飼料DNA
飼料中以大量的淀粉和飼料添加輔助成分稱為飼料中DNA提取的最大障礙，為 消除其對(duì)DNA提取過程中造成的影響，在DNA提取流程起初階段將這些成分去除。 即收集伺料經(jīng)裂解后的上清液，首先用異丙醇處理，留取含DNA的沉淀物，用TE 溶解，然后開始后續(xù)的純化過程。本發(fā)明的提取飼料DNA的基本流程如圖l所示， 具體方法如下所述
(1) CTAB液裂解飼料分別取步驟l)中配制的對(duì)照組(玉米成分為非轉(zhuǎn)基因玉 米)或?qū)嶒?yàn)組(玉米成分為轉(zhuǎn)基因玉米MON810)飼料樣品3g于液氮中研磨至粒徑 為lOOum以下的粉末，置于50mL試管中，加入65'C預(yù)熱的30mL步驟1制備的提 取飼料DNA的專用提取液中，補(bǔ)加60nLP-巰基乙醇，混勻，65X:水浴30min，期間 每隔5min輕緩顛倒混勻。然后置于4r， 12000ipm (離心力為18514g) ， 10min， 取上清，得到25ml上清液。
(2) 異丙醇處理將步驟(1)離心得到的上清液里加入25mL異丙醇，混勻，-20 。C靜置15min。然后置于4。C， 12000rpm (離心力為18514g)離心10min。得到初步 DNA沉淀，將其自然晾干。
(3) RNA酶消化RNA:加入10mlTE溶解，并滴加RNase (RNA酶，加入終濃度 10ug/ml)，混勻，37'C靜置10min，消化提取的DNA中的RNA，得到去除RNA的 DNA溶液。然后在4。C， 12000rpm (離心力為18514g)離心10min。取上清。
(4) Tris飽和酚抽提在步驟(3)得到的DNA溶液中加入等體積的Tris飽和酚，輕 緩顛倒混勻10min，然后在4。C， 12000rpm (離心力為18514g)離心10min。取上清。
(5) Tris飽和酚/氯仿/異戊醇混合液抽提在步驟(4)得到的上清液中，加入等體積 的Tris飽和酚/氯仿/異戊醇(Tris飽和酚、氯仿和異戊醇的體積比為25: 24: 1)混 合液，輕緩顛倒混勻5min。然后置于4。C， 12000rpm/min (離心力為18514g)離心 10min。收集上清液。
(6) 氯仿/異戊醇混合液抽提在步驟(5)得到的上清液中，加入等體積的氯仿/異戊 醇(氯仿與異戊醇的體積比為24: 1)混合液，輕緩顛倒混勻10min。然后置于4。C， 12000rpm/min (離心力為18514g)離心10min，收集上清液。
(7) 沉淀DNA:在步驟(6)得到的上清液中，加入等體積冰乙醇和1/10體積的3mol/LNaAc，輕緩顛倒混勻，-20°。放置10min，挑取管中絲絮狀DNA于1.5mL離心管中。
(8) 漂洗DNA:以75%乙醇漂洗DNA產(chǎn)物，然后用75%乙醇浸泡所述DNA沉淀 室溫靜置30min，小心棄上清液，繼續(xù)重復(fù)該步驟兩次。
(9) TE溶解DNA產(chǎn)物將步驟(8)得到的DNA產(chǎn)物于60"C，干燥5min，然后加 入100-300uLTE緩沖液溶解即得到步驟l)中配制的對(duì)照組(玉米成分為非轉(zhuǎn)基因 玉米)或?qū)嶒?yàn)組(玉米成分為轉(zhuǎn)基因玉米MON810)飼料DNA溶液，-20°(3保存?zhèn)?用。
3、 檢測(cè)DNA產(chǎn)物質(zhì)量
將步驟2得到的玉米成分為轉(zhuǎn)基因玉米MON810的詞料DNA產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂 糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，按照本發(fā)明的方法從飼料 中提取的DNA產(chǎn)物中無淀粉、蛋白和多酚類等雜質(zhì)的摻入，減少了大分子物質(zhì)的干 擾。雖出現(xiàn)部分DNA的降解現(xiàn)象，但這對(duì)于后續(xù)PCR反應(yīng)影響不大，可以用于PCR 法檢測(cè)外源DNA。圖2中，泳道"1" 、 "2" 、 "3" 、 "4"分別是指玉米成分為 轉(zhuǎn)基因玉米MON810的飼料DNA樣品的4個(gè)重復(fù)；泳道"M"指DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) (1000-畫00bp ladder)。
4、 轉(zhuǎn)基因飼料中玉米MON810內(nèi)源DNA檢測(cè)
以步驟2得到的玉米成分為轉(zhuǎn)基因玉米MON810的飼料DNA產(chǎn)物為模板，用引 物ZeinF/ ZeinR擴(kuò)增玉米內(nèi)參基因Zein，用IVRF/IVRR擴(kuò)增玉米內(nèi)參基因IVR，分 別檢測(cè)檢測(cè)玉米DNA引物信息如表2所示，PCR擴(kuò)增體系如表3所示。實(shí)驗(yàn)均設(shè)兩 個(gè)重復(fù)，同時(shí)以轉(zhuǎn)基因玉米MON810DNA為模板的進(jìn)行同樣的PCR擴(kuò)增作為陽性 對(duì)照，以去離子水為模板進(jìn)行同樣的PCR擴(kuò)增作為空白對(duì)照。
PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)如下95i:預(yù)變性5min， 94"C變性30s， Tm(如表2所示)退 火30s， 72。C延伸30s， 35個(gè)循環(huán);72。C延伸5min，最終PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂 糖凝膠檢測(cè)。
玉米內(nèi)參基因IVR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖如圖3所示，玉米內(nèi)參基因Zein擴(kuò)增產(chǎn)物 的電泳圖如圖4所示，結(jié)果表明本發(fā)明的方法提取的飼料DNA產(chǎn)物PCR產(chǎn)物條帶 清晰、單一無雜帶，充分說明了本發(fā)明提取到的飼料DNA產(chǎn)物足夠滿足PCR法檢 測(cè)外源DNA要求的。圖3中，泳道"1" 、 "2"指步驟2得到的玉米成分為轉(zhuǎn)基因 玉米MON810的飼料DNA的兩個(gè)重復(fù)，即以步驟2得到的玉米成分為轉(zhuǎn)基因玉米 MON810的飼料DNA為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；泳道"+ "指陽性對(duì)照，即以轉(zhuǎn)基 因玉米MON810DNA為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；泳道"0"指空白對(duì)照，即以去離 子水為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；泳道"M"指DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100-1500bp ladder)。圖4中，泳道"1"、 "2"指實(shí)驗(yàn)組的兩個(gè)重復(fù)，即以飼料DNA為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的 電泳圖；泳道"+"指陽性對(duì)照，即以轉(zhuǎn)基因玉米MON810DNA為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的 電泳圖；泳道"0"指空白對(duì)照，即以去離子水為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；泳道M指 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100-1500bp ladder)。
表2檢測(cè)轉(zhuǎn)基因飼料中玉米MON810內(nèi)、外源基因的引物信息
基 因 來 源檢測(cè)基因引物名稱引物序列(上游/下游)擴(kuò) 增 長 度 bp退 火 溫 度 。C
內(nèi) 源ZeinZeinF5'-TGAACCCATGCATGCAGT-3' 5'國GGCAAGACCATTGGTGA-3'l卯58
ZeinRIVRIVRF5'-CCGCTGTATC ACAAGGGCTGGTAC-3' 5'-GGAGCCCGTGTAGAGCATGACGAT-3'22658
IVRR外 源CaMV 35SCaMVF5'- GCTCCTACAAATGCCATCA -3' 5'- GATAGTGGGATTGTGCGTCA -3'19555
CaMVRMaize genome/CaMV35SMCaMW5 '-TCGAAGGACGAAGGACTCTAACGT-3' 5'- TCCATCTTTGGGACCACTGTCG -3'17055
MCaMVRHSP70/CrylA(b)HCryF5'-AGTTTCCTTTTTGTTGCTCTCCT-3' 5'-GATGTTTGGGTTGTTGTCCAT-3'19355
HCryR表3.轉(zhuǎn)基因飼料中玉米MON810檢測(cè)的PCR反應(yīng)體系
試劑名稱貯備液濃度20pL反應(yīng)體系加樣體 積各成分終濃度
PCR緩沖液10xPCR Buffer2攀
dNTP2.5mmol/L0單各75(imol/L
Taq酶5U批0.05 U/|aL
引物(正向)10pmol/|oLl攀0.5pmol/|jL
引物(反向)10pmol/(jLl攀0.5pmol/)jL
模板DNA30 ng/jxLl.OuL1.5 ng/|iL
雙蒸水補(bǔ)至20nL
5、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分外源DNA
設(shè)定轉(zhuǎn)基因玉米MON810DNA樣品作為陽性對(duì)照組(+ )，步驟2得到的玉米 成分為轉(zhuǎn)基因玉米MON810的詞料DNA產(chǎn)物作為實(shí)驗(yàn)組(設(shè)兩個(gè)重復(fù)分別為1 ， 2)， 步驟2得到的玉米成分為非轉(zhuǎn)基因玉米的飼料DNA樣品為對(duì)照組(一)，以滅菌雙蒸水代替模板DNA作為空白對(duì)照組(0)。為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分外源DNA，分別以 CaMVF/CaMVR、 MCaMVF/MCaMVR或HCryF/ HcryR為弓I物對(duì)，對(duì)上述各組DNA 樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)各組DNA中的外源基因CaMV35S、外源基因CaMV35S 連接位點(diǎn)或外源基因HSP70和CryIA(b)連接位點(diǎn)。
各外源基因檢測(cè)PCR反應(yīng)體系如表3所示，PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)如下95"C預(yù)變 性5min， 94。C變性30s， Tm(如表1所示)退火30s， 72。C延伸30s， 35個(gè)循環(huán)；72°C 延伸5min，將最終PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用1.2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。
對(duì)本發(fā)明方法提取的伺料DNA中玉米MON810外源基因CaMV 35S擴(kuò)增產(chǎn)物 的電泳圖如圖5所示，對(duì)發(fā)明方法提取的飼料玉米MON810基因組和外源基因CaMV 35S連接位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖如圖6所示、對(duì)發(fā)明方法提取的飼料玉米MON810 外源基因HSP70和CryIA(b)連接位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖如圖7所示。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn) 組與陽性對(duì)照組結(jié)果一致，目的PCR產(chǎn)物條帶清晰、單一無雜帶；陰性對(duì)照組無目 的條帶出現(xiàn)；空白對(duì)照組無任何PCR產(chǎn)物。充分說明了本發(fā)明提取到的飼料DNA 產(chǎn)物足夠滿足PCR法檢測(cè)外源DNA要求的。圖5中，泳道"1"、 "2"指實(shí)驗(yàn)組 的兩個(gè)重復(fù)，即以含轉(zhuǎn)基因玉米MON810的詞料DNA為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳" 一 "指陰性對(duì)照，即以不含轉(zhuǎn)基因玉米MON810的飼料DNA為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的電 泳圖；"+ "指陽性對(duì)照，即以轉(zhuǎn)基因玉米MON810DNA為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳"0"指空白對(duì)照，即以去離子水為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；M指DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)
U00-1500bpladder)。圖6中，泳道"1" 、 "2"指實(shí)驗(yàn)組的兩個(gè)重復(fù)，即以含轉(zhuǎn) 基因玉米MON810的詞料DNA為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；泳道"_"指陰性對(duì)照， 即以不含轉(zhuǎn)基因玉米MON810的飼料DNA為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；泳道"+"指 陽性對(duì)照，即以轉(zhuǎn)基因玉米MON810DNA為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；泳道"0"指 空白對(duì)照，即以去離子水為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；泳道M指DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)
(100-1500bp ladder)。圖7中，泳道"1" 、 "2"指實(shí)驗(yàn)組的兩個(gè)重復(fù)，即以含轉(zhuǎn) 基因玉米MON810的飼料DNA為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；泳道"一"指陰性對(duì)照， 即以不含轉(zhuǎn)基因玉米MON810的飼料DNA為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；泳道"+ "指 陽性對(duì)照，即以轉(zhuǎn)基因玉米MON810DNA為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；泳道"0"指 空白對(duì)照，即以去離子水為模板擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；泳道M指DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)
(100-1500bp ladder)。
權(quán)利要求
1、一種提取飼料DNA的專用提取液，是含有81.816g/L氯化鈉，121.1g/L三羥甲基氨基甲烷，74.448g/L乙二胺四乙酸，20g/L十六烷基三甲基溴化胺，pH值為8.0的溶液。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取液，其特征在于所述提取飼料DNA的專用提 取液經(jīng)過滅菌得到滅菌的提取液。
3、 一種提取飼料DNA的方法，包括下述步驟1) 將飼料加入到權(quán)利要求1或2所述提取飼料DNA的專用提取液中混勻，使 所述飼料與所述提取液的比例為lg: 10ml，加入P-巰基乙醇使其體積百分含量為 0.2%，于65。C溫浴25-35min，離心得到上清液；2) 將步驟l)得到的上清液加入是所述上清液l倍體積的異丙醇混勻，-2(TC靜 置15min，然后離心得到初步DNA沉淀；3 )將步驟2 )得到的DNA沉淀，加入TE緩沖液溶解，并加RNA酶至終濃度1 Oug/ml， 37。C消化；所述TE緩沖液為含有12.11 g/L三羥甲基氨基甲烷，3.722g/L乙二胺四 乙酸pH值為8.0的溶液；4) 將步驟3)得到的RNA酶消化后的DNA溶液與是所述DNA溶液1倍體積 的Tris飽和酚混合，輕緩搖勻10min，離心收集上層液；5) 將步驟4)得到的上層液與是所述上層液l倍體積的Tris飽和酚、氯仿和異 戊醇的體積比25: 24: l的混合液混合，離心收集上層液；6) 將步驟5)得到的上層液與是所述上層液l倍體積的氯仿與異戊醇的體積比 為24: l的混合液混合，離心收集上層液，即得到飼料DNA溶液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法中，還包括沉淀所述飼 料DNA的步驟，所述沉淀DNA的方法是所述飼料DNA溶液中加入等體積冰乙醇和 1/10體積的3mol/LNaAc溶液，輕緩顛倒混勻，-20°。放置10min，得到絲絮狀DNA 沉淀。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中，還包括對(duì)DNA沉 淀的漂洗3次的步驟，所述漂洗的方法為用75%乙醇漂洗所述DNA沉淀3min。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟l)中，所述提取的過 程中，每隔5分鐘對(duì)提取液輕緩顛倒混勻。
7、 根據(jù)權(quán)利要求4或5或6所述的方法，其特征在于所述步驟l)中，還包 括將詞料在液氮中研磨至粒徑為100um以下的粉末。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中還包括將得到的DNA 沉淀干燥后用TE緩沖液溶解；所述TE緩沖液為含有12.11 g/L三羥甲基氨基甲垸， 3.722g/ L乙二胺四乙酸pH值為8.0的溶液。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述方法中，所述離心的溫度均 為4'C，離心力為18514g。
10、 權(quán)利要求3-9中任意一項(xiàng)所述的提取飼料DNA的方法在檢測(cè)詞料中轉(zhuǎn)基因植 物成分中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提取用于轉(zhuǎn)基因植物成分檢測(cè)的飼料DNA的方法。該方法，包括1)將飼料加入提取液中混勻，加入β-巰基乙醇至終濃度為0.2％，于65℃提取，離心得到上清液；2)將上清液加入是所述上清液1倍體積的異丙醇混勻，-20℃靜置15min，然后離心得到初步DNA沉淀；3)將DNA沉淀后，用RNA酶消化；4)將步驟3)得到的RNA酶消化后的DNA溶液依次用Tris飽和酚，Tris飽和酚、氯仿和異戊醇的體積比25∶24∶1的混合液，氯仿與異戊醇的體積比為24∶1的混合液抽提得到飼料DNA溶液。該方法提取飼料DNA，能除去飼料中蛋白、酚和糖類雜質(zhì)的干擾，得到高質(zhì)量的DNA產(chǎn)物，可直接用于PCR方法定性檢測(cè)飼料中的轉(zhuǎn)基因成分。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101289662SQ200810114959
公開日2008年10月22日 申請(qǐng)日期2008年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月13日
發(fā)明者張興舉, 奎 李, 王志偉, 王趁芳 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所