專利名稱：一種屎腸球菌微膠囊制劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種屎腸球菌微膠囊制劑及其制備方法，更具體地說一種高活性的屎 腸球菌(^/m coccMFaec/"w)及其微膠囊新劑型，屬于微生物領域。
背景技術：
屎腸球菌作為畜禽腸道土著菌群，對提高畜禽生長性能有顯著效果。 屎腸球菌在生長過程中，不形成芽胞，抗逆性較差，在液體條件下難以長期保存。 實際應用中，在添加使用于配合顆粒飼料時，往往要經(jīng)過高溫加熱制粒處理，導
致產(chǎn)品的有效成分損失較大，產(chǎn)品的保質(zhì)期也較短，限制了其大規(guī)模應用。而益生菌
只有具備穩(wěn)定的生理活性，才能發(fā)揮其益生作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一株高活性的屎腸球菌。 本發(fā)明要解決的另一個技術問題是提供一種屎腸球菌微膠囊制劑。 本發(fā)明要解決的第三個技術問題是提供這種微膠囊制劑的制備方法。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案
一株高活性的屎腸球菌(E"&racocc^Faec/ww)，其保藏編號為CGMCC No.2516。
所述的高活性的屎腸球菌用于制備飼料添加劑的用途。由于其活性較高，在加工 過程中不易變質(zhì)，生理活性穩(wěn)定。
一種微膠囊別劑，以海藻酸鈉為囊材溶液、以CaCl2溶液為固化劑，含有屎腸球 菌(&^rococc^Faec/ww)，膠囊中活菌數(shù)為109-101Q個/ml濕膠囊。
所述屎腸球菌的保藏編號為CGMCC No. 2516。
一種屎腸球菌微膠囊制劑的制備方法，包括下述步驟
(1) 囊材溶液的配制及滅菌在攪拌下分批將海藻酸鈉加入蒸餾水，制成透明膠 液，滅菌，備用；海藻酸鈉溶液的濃度為l-2%vv/v，優(yōu)選1.5。/。w/v。
(2) 固化劑的配置及滅菌用蒸餾水配成0.1-0.3mol/lCaCl2溶液，滅菌，備用；
(3) 屎腸球菌種子液培養(yǎng)采用數(shù)生長期菌體作為包被用種子液；(4) 微膠囊制備無菌條件下，將種子液加入到海藻酸鈉溶液中，按1-3><106個 屎腸球菌/ml海藻酸鈉的密度調(diào)配，充分攪勻后，吸取海藻酸鈉的含菌混合膠液，用 高壓無菌氣體經(jīng)噴頭噴入CaCl2溶液中，均勻緩慢攪拌，固化15-25分鐘，即得待培 養(yǎng)微膠囊，膠囊直徑為0.3-0.7mm;
(5) 包被后發(fā)酵將含有屎腸球菌的微膠囊入發(fā)酵液中，37°C， 150rpm恒溫培 養(yǎng)，14-18小時，即得含高密度和高活性屎腸球菌的微膠囊產(chǎn)品。
所述滅菌是在115'C下滅菌20分鐘。
所述屎腸球菌種子液培養(yǎng)的培養(yǎng)基為葡萄糖10g/1，大豆蛋白胨5g/1，酵母浸膏 2g/1，檸檬酸銨2g/1，乙酸鈉5g/1， K2HP04 2g/l，吐溫80 1ml, MgS04 7H20 0.5g/l， MnS04'4H20: 0.2g/l。最佳培養(yǎng)條件為37°C， 150rpm轉(zhuǎn)速，恒溫培養(yǎng)。接種量為2.0 X 106cfu/mL。
所述包被后發(fā)酵的活菌數(shù)可達2.0-3.5 X 101Qcfu/mL濕膠囊。
本發(fā)明采用微膠囊包被益生菌能夠很好保護其生理活性，發(fā)揮其益生功效。其優(yōu) 勢表現(xiàn)在①將益生菌通過微囊化轉(zhuǎn)變成一種穩(wěn)定的細粉顆粒(濕顆粒，可直接作為 添加劑，隨飲用水添加，也可根據(jù)需要制成干粉粒)，改變微生態(tài)制劑產(chǎn)品的形態(tài)， 這種微膠囊產(chǎn)品具有良好的流動性和分散性，很容易與其它飼料混合均勻，便于運輸、 貯存和添加使用；②微生態(tài)制劑產(chǎn)品的耐酸性和熱穩(wěn)定性較差，但將其制成微膠囊產(chǎn) 品后，由于微膠囊的保護，能夠有效地防止菌體失活，提高微生態(tài)制劑產(chǎn)品的穩(wěn)定性。 采用腸溶性壁材后，還能防止胃液的破壞，從而使盡可能多的菌體到達腸道，真正起 到保健和治療的作用；③可將配伍禁忌的各種成分在同一產(chǎn)品中隔開。④使不溶于水 的物質(zhì)能均勻地分散在水溶性介質(zhì)中。
本發(fā)明的創(chuàng)新點在于采用前包被后發(fā)酵的方法，使菌體可繼續(xù)在微膠囊微環(huán)境下 增殖，細胞密度大小可控，并可達到比后包埋更高的微囊化菌體密度；前包埋方法大 大減少了微囊化過程細胞的利用量，避免了后包埋過程由于受細胞密度影響而造成的 微囊化效率和產(chǎn)率較低的不利因素，更易于得到形態(tài)和穩(wěn)定性更好的微囊化產(chǎn)品。
本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明篩選得到的屎腸球菌來源安全，生長速度快，在培養(yǎng)12 小時處即達到平臺期，菌體密度高可達，2.0Xl(TCFU/mL的高密度，能夠代謝分泌對 宿主健康有益的L-乳酸，且對常見的病原菌大腸桿菌K88、 K99及金黃色葡萄球菌等 具有抑制作用。適宜作為益生菌種繼續(xù)開發(fā)。經(jīng)過篩選得到高活性的屎腸球菌菌株， 并采用微膠囊技術，將低密度屎腸球菌包裹在囊材中，繼續(xù)發(fā)酵獲得更高的菌體濃度，通過簡單的分離，直接得到含有高密度屎腸球菌的微膠囊。制備微膠囊所用材料對畜 禽均無毒副作用，且來源廣，價格便宜。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明，并非對發(fā)明的限定，依 照本領域公知的現(xiàn)有技術，本發(fā)明的實施方式并不限于此，因此凡依照本文公開內(nèi) 容所作出的本領域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。


圖1為菌體增殖情況比較圖。
圖2-1和圖2-2為代謝(葡萄糖消耗和乳酸生成)過程比較圖。 圖3為對典型病原菌的抑菌實驗比較圖。
圖4-1為三種狀態(tài)下生長曲線比較；圖中free是未包被，MC1是單層包被海藻酸 鈉，MC2是雙層包被殼聚糖膠囊。
圖4-2為包被甜后乳酸代謝曲線比較。
具體實施例方式
實施例l:屎腸球菌的篩選與種子液制備
一. 方法
無菌操作獲取出生嬰兒糞便，稀釋一定倍數(shù)，涂在特定培養(yǎng)基做成的平板上，培 養(yǎng)24小時，得一定數(shù)量菌落，每個菌落作為一個被選目的菌株。在經(jīng)生長曲線、代謝 過程測定及病原菌抑制實驗，選取生長活力及乳酸產(chǎn)量高，并抑菌效果顯著的菌株作 為最終目的菌株和用于包被的種子菌株。
二. 屎腸球菌培養(yǎng)及其培養(yǎng)條件
2單因素及正交實驗確定所篩得屎腸球菌最佳培養(yǎng)基為葡萄糖10g/1，大豆蛋白
胨5g/1，酵母浸膏2g/1，檸檬酸銨2g/1,乙酸鈉5g/l， K2HP04 2g/1，吐溫80 lml， MgS04 7H20 0.5g/l， MnS04'4H20: 0.2g/l。最佳培養(yǎng)條件為37°C， 150rpm轉(zhuǎn)速， 恒溫培養(yǎng)，接種量為1% (約2X106cfu/mL)。
三. 結果
經(jīng)BIOLOG鑒定，獲得屎腸球菌一株。 實施例2:生物活性實驗一.方法
本實驗室分離所得屎腸球菌與市售進口同類腸球菌及糞腸球菌生長、代謝及抑菌 情況比較。 其中
MLK: Enterococcos from improt probiotics，參比菌株，篩選自美國味可樂乳膏劑。 Baby-l: Enterococcos faecalis (Obtaied by our lab)，屎腸球菌Baby-1 。 Baby-2: Enterococcos faecium， 糞腸球菌Baby-2。
1. 生長、代謝及抑菌情況比較
將活化兩代的待測菌株以1%的接種量(約2Xl()Scfu/mL)接種于裝有l(wèi)OOmLMRS 培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，37°C， 150rpm培養(yǎng)，每2小時取樣，測定600nm處吸光 值。以培養(yǎng)時間為橫坐標，相應的吸光值為縱坐標，繪制生長曲線。
2. 代謝(葡萄糖消耗和乳酸生成)過程比較
生物傳感儀分別測定菌體培養(yǎng)液中葡萄糖消耗量及乳酸產(chǎn)量。以培養(yǎng)時間為橫坐 標，相應的消耗量或產(chǎn)量為縱坐標，繪制代謝曲線。
3. 對典型病原菌的抑菌實驗比較
制備厚度為4mm左右的MNA平板，并在平板上打孔(孔徑5mm左右)，封底。 將致病菌(血清型為k88、 k99的大腸桿菌及金黃色葡萄球菌)濃度為106的菌懸液 100u L涂布于該平板上，取實驗菌株CGMCCNo.2516的發(fā)酵液加滿于孔中，37'C培 養(yǎng)24h。測量抑菌圈直徑。每個實驗三個重復，取平均值。 二.結果
1. 生長、代謝及抑菌情況比較參閱圖1所示，由圖可見，本實驗室所篩得菌株 增殖速度、最大生物量(即菌體最終密度)都顯著高于市售進口同類菌株。
2. 代謝(葡萄糖消耗和乳酸生成)過程比較參與圖2所示，由圖可知實驗室所 篩得菌株乳酸產(chǎn)率和產(chǎn)量均為最大，葡萄糖消耗無顯著差別。
3. 對典型病原菌的抑菌實驗比較參閱圖3所示，由圖可見，本實驗室篩得菌株 對于大腸桿菌的抑制效果與進口產(chǎn)品相比差別不大，但沙門氏菌的抑菌效果顯著較高 于其他兩個菌株。
對菌種進行保藏，于2008年5月22日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，郵政編碼 100101)，建議的分類名為屎腸球菌五^eracoccw尸aec/ww ，保藏號為CGMCC No.2516 。實施例3:制備微膠囊制劑
一. 材料
囊材為海藻酸鈉溶液，濃度為1.5g/l (1.5%w/v)。 固化劑為氯化鈣(CaCl2)水溶液，濃度為0.1mo1/1。 屎腸球菌，保藏編號為CGMCCNo.2516。
二. 屎腸球菌微囊化工藝
1. 囊材溶液的配制及滅菌在不斷攪拌下分批將海藻酸鈉加入蒸餾水，攪拌制成
為透明膠液，115'C下滅菌20分鐘，備用。
2. 固化劑的配置及滅菌用蒸餾水配成O.lmol/l溶液，115'C下滅菌20分鐘，備用。
3. 屎腸球菌種子液培養(yǎng)采用實施例l所述培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，得對數(shù)生長期菌 體作為包被用種子液。
4. 微膠囊制備無菌條件下，將種子液加入到海藻酸鈉溶液中，按1-3><106個屎 腸球菌/ml海藻酸鈉的密度調(diào)配，充分攪勻后，用注射器吸取混合膠液，用高壓無菌 氣體經(jīng)噴頭噴入約300ml的CaCl2溶液中，均勻緩慢攪拌，固化20分鐘左右，即得 待培養(yǎng)微膠囊，膠囊直徑為0.3-0.7mm。
5. 包被后發(fā)酵將含有屎腸球菌的微膠囊入發(fā)酵液中，37'C， 150rpm恒溫培養(yǎng)， 16小時左右，即得含高密度和高活性屎腸球菌的微膠囊產(chǎn)品，活菌數(shù)可達10"個/ml 濕膠囊。
實施例4:微膠囊的測試 一.測定方法
1. 包被甜后^:長曲線比較
將未包被和微膠囊包被的樣品，每個做三個平行在37'C150rpm培養(yǎng)，每2小時 取一次樣品，成膜微膠囊和成膜微膠囊包被取樣后，以體積比l: 10的比例放入破囊 液中，震蕩破囊，以空囊破囊后的溶液為參比，測定OD600 ，以時間為橫坐標，OD600 值為縱坐標，繪制生長曲線。16h處取樣涂抹平板計數(shù)。
2. 微囊化屎腸球菌代謝曲線
用SBA-40C型生物傳感儀酶法測定乳酸產(chǎn)量及葡萄糖消耗量。 3.耐膽汁能力監(jiān)測在MRS液體培養(yǎng)基添加0.4%( w/v)的豬膽鹽，接種1 %已活化的CGMCC No.2516, 包被后微膠囊Bmc-l, 37。C下培養(yǎng)，0h、 lh、 2h、 3h取樣，用無菌生理鹽水按十倍系 列稀釋，平板菌落計數(shù)。
4. 胃轉(zhuǎn)運耐受能力監(jiān)測
向裝有己滅菌的MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中加入1% (w/v)的胃蛋白酶，混勻。 以不添加胃蛋白酶的MRS培養(yǎng)基為對照，分別接種1%已活化的屎腸球菌CGMCC No.2516及微囊化Bmc-1.37。C下培養(yǎng)，0h、 lh、 2h、 3h取樣，用無菌生理鹽水按十倍 系列稀釋，平板菌落計數(shù)。
5. 小腸轉(zhuǎn)運耐受能力監(jiān)測
向裝有己滅菌的MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中加入1% (w/v)的胰蛋白酶，混勻。 以不添加胰蛋白酶的MRS培養(yǎng)基為對照，分別接種1%已活化的屎腸球菌CGMCC No.2516及微囊化膠囊mc. 37'C下培養(yǎng)，0h、 lh、 2h、 3h、 4h取樣，用無菌生理鹽水 按十倍系列稀釋，平板菌落計數(shù)。 二.結果
1. 微囊化包被下的菌株CGMCCNo.2516在短暫的延遲期后，迅速進入對數(shù)生長 期，與未包被的生長曲線相比較，對數(shù)生長期，菌體比生長速率明顯高于未包被的菌 體生長。具備較大的最終生物量和較快的最大比生長速率。在16小時處平板計數(shù)，不 包被的屎腸球菌CGMCC No.2516最終濃度可達2.0X 101DCFU/mL。微膠囊的最終濃 度可達3.65X101QCFU/mL。如圖4-l。
2. 包被后的菌體代謝乳酸的最終產(chǎn)量要稍高于未包被的游離細胞代謝乳酸的產(chǎn) 量。微膠囊提供了較高的細胞密度，實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，從而提高產(chǎn)物濃度，如圖4-2。 但葡萄糖消耗過程并無明顯差別。
3. 未包被的細胞在進入有膽鹽的MRS培養(yǎng)基后，活^數(shù)量在1小時內(nèi)有大幅的 下降，此后的兩個小時內(nèi)，菌數(shù)雖沒有繼續(xù)下降，但僅保持在一個較低水平的濃度， 說明膽鹽對屎腸球菌CGMCC No.2516的活性起到了一定的抑制作用。而微膠囊包被 后的菌體本身就具備較高的菌體密度，在含膽汁的MRS培養(yǎng)基中，活菌數(shù)量幾乎沒 有下降，整個過程保持了較好的活性。說明微膠囊包被菌體對膽汁具有良好的耐受能 力。
4. 研究了模擬胃蛋白酶和胰蛋白酶對菌體的轉(zhuǎn)運耐受能力的影響。在低pH情況 下，未包被的活菌數(shù)目有大幅下降，此后(2H)基本上維持在一個較低的水平。包被后細胞在低pH下活菌數(shù)目下降趨勢相對緩慢，整體活菌數(shù)目要遠高于未保護下的細 胞。兩種條件下活菌數(shù)分別下降了 7.1乂109和1.32X101G。因此，微膠囊包被菌體對 模擬胃液具有良好的耐受能力。綜合模擬胃腸液實驗結果可見，胃環(huán)境對菌體活性的 影響較大，而腸部環(huán)境對菌體活性影響不大。因此，與普通游離條件相比，屎腸球菌 在微膠囊包被后，可更大量通過胃部環(huán)境，進入腸部，從而更好的發(fā)揮其益生作用。
權利要求
1.一株高活性的屎腸球菌，其保藏編號為CGMCC No.2516。
2. 權利要求1所述的高活性的屎腸球菌用于制備飼料添加劑的用途。
3. —種微膠囊制劑，其特征在于以海藻酸鈉為囊材溶液、以CaCl2溶液為固化 齊IJ，含有屎腸球菌(EnterococcusFaecium)，膠囊中活菌數(shù)為10、10"個/ml濕膠囊。
4. 根據(jù)權利要求3所述的一種微膠囊制劑，其特征在于所述屎腸球菌的保藏編 號為CGMCC No.2516。
5. —種屎腸球菌微膠囊制劑的制備方法，其特征在于包括下述歩驟(1) 囊材溶液的配制及滅菌在攪拌下分批將海藻酸鈉加入蒸餾水，制成透明膠 液，滅菌，備用；海藻酸鈉溶液的濃度為l-2%w/v。(2) 固化劑的配置及滅菌用蒸餾水配成0.1-0.3mol/lCaCl2溶液，滅菌，備用；(3) 屎腸球菌種子液培養(yǎng)采用數(shù)生長期菌體作為包被用種子液；(4) 微膠囊制備無菌條件下，將種子液加入到海藻酸鈉溶液中，按1-3"06個 屎腸球菌/ml海藻酸鈉的密度調(diào)配，充分攪勻后，吸取海藻酸鈉的含菌混合膠液，用 高壓無菌氣體經(jīng)噴頭噴入CaCl2溶液中，均勻緩慢攪拌，固化15-25分鐘，即得待培 養(yǎng)微膠囊，膠囊直徑為0.3-0.7mm;(5) 包被后發(fā)酵將含有屎腸球菌的微膠囊入發(fā)酵液中，37°C， 150rpm恒溫培 養(yǎng)，14-18小時，即得含高密度和高活性屎腸球菌的微膠囊產(chǎn)品。
6. 根據(jù)權利要求5所述的一種屎腸球菌微膠囊制劑的制備方法，其特征在于 所述滅菌是在115'C下滅菌20分鐘。
7. 根據(jù)權利要求5所述的一種屎腸球菌微膠囊制劑的制備方法，其特征在于 所述屎腸球菌種子液培養(yǎng)的培養(yǎng)基為葡萄糖10gA，大豆蛋白胨5g/1，酵母浸膏2g/1， 檸檬酸銨2g/1，乙酸鈉5g/l， K2HP04 2g/l，吐溫80 lml， MgS04 7H20 0.5g/l， MnS04'4H20: 0.2g/l。最佳培養(yǎng)條件為37°C, 150rpm轉(zhuǎn)速，恒溫培養(yǎng)。接種量為2.0 X106 cfu/mL。
8. 根據(jù)權利要求5所述的一種屎腸球菌微膠囊制劑的制備方法，其特征在于所述包被后發(fā)酵的活菌數(shù)可達2.0-3.5X10^cfu/mL濕膠囊。
9. 根據(jù)權利要求5所述的一種屎腸球菌微膠囊制劑的制備方法，其特征在于 所述海藻酸鈉溶液的濃度為1.5%w/v。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微膠囊制劑及其制備方法，屬于微生物領域和制劑領域。一種微膠囊制劑，以海藻酸鈉為囊材溶液、以CaCl₂溶液為固化劑，含有屎腸球菌(Enterococcus Faecium)，屎腸球菌的保藏編號為CGMCC No.2516。本發(fā)明的優(yōu)點在于采用前包被后發(fā)酵的方法，使菌體可繼續(xù)在微膠囊微環(huán)境下增殖，細胞密度大小可控，并可達到比后包埋更高的微囊化菌體密度；前包埋方法大大減少了微囊化過程細胞的利用量，避免了后包埋過程由于受細胞密度影響而造成的微囊化效率和產(chǎn)率較低的不利因素，更易于得到形態(tài)和穩(wěn)定性更好的微囊化產(chǎn)品。
文檔編號C12N1/20GK101289648SQ20081011491
公開日2008年10月22日 申請日期2008年6月13日 優(yōu)先權日2008年6月13日
發(fā)明者淵 宋, 張曉琳, 綦文濤, 郝淑紅, 郭偉群, 郭蘊劼 申請人:國家糧食局科學研究院