一種表面修飾的磁性納米顆粒及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及納米材料領(lǐng)域，尤其涉及一種表面修飾的磁性納米顆粒及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)是指自發(fā)或因診療操作脫落進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，通過(guò)采集外周血觀察循環(huán)腫瘤細(xì)胞在血液中的存在或含量的高低，可用于診斷腫瘤的存在、發(fā)病過(guò)程、評(píng)估患者的預(yù)后、識(shí)別患者接受治療后臨床狀況的改善情況等，同時(shí)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分子分析還可以反映患者腫瘤的基因信息，指導(dǎo)個(gè)體化用藥。
[0003]對(duì)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞來(lái)說(shuō)，目前針對(duì)其的主要分析方法是蛋白分析方法(免疫熒光染色等)和基因分析方法(例如熒光原位雜交和定量RT-PCR等)，主要是進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的蛋白組學(xué)和基因組學(xué)的研究。而對(duì)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的代謝研究，目前仍缺少耦合的平臺(tái)與技術(shù)來(lái)進(jìn)行較好的分析。但是循環(huán)腫瘤細(xì)胞的代謝研究將為癌癥轉(zhuǎn)移和耐藥機(jī)制提供新的見(jiàn)解，提出新的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的代謝分子研究方法將具有很大的應(yīng)用潛力，也將在腫瘤研究中起到非常重要的作用。
[0004]細(xì)胞的代謝是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，它能夠揭示細(xì)胞內(nèi)在和外在的特性，并且能在生理和病理方面來(lái)研究細(xì)胞表現(xiàn)。此外，細(xì)胞的代謝，尤其是小分子的代謝，是其表型的多樣性以及細(xì)胞應(yīng)對(duì)不同環(huán)境的直接表現(xiàn)。然而由于低檢測(cè)靈敏度、高樣品復(fù)雜度和復(fù)雜的樣品預(yù)處理過(guò)程使得細(xì)胞代謝的研究仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)，對(duì)于少量細(xì)胞例如循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究更是如此。
[0005]由于磁性微納顆粒的物理性質(zhì)、表面化學(xué)和磁性，其在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用越來(lái)越普遍。在磁性分離方面，通過(guò)對(duì)顆粒材料表面化學(xué)進(jìn)行調(diào)控，偶聯(lián)多種靶標(biāo)進(jìn)行特異性的捕獲來(lái)進(jìn)行診斷和治療的研究。此外，磁性微納顆粒材料還能進(jìn)行表面的功能化修飾，用其來(lái)特異性捕獲細(xì)胞和進(jìn)行分子分析和檢測(cè)。同時(shí)，激光解析電離質(zhì)譜技術(shù)(LDI MS)作為最基本的分子分析工具，它具有樣品處理簡(jiǎn)單、分析速度快和能進(jìn)行精準(zhǔn)結(jié)構(gòu)鑒定的特點(diǎn)。在LDI MS中，磁性顆粒材料不僅可以用來(lái)在樣品預(yù)處理中特異性的富集蛋白和肽段還能夠作為基質(zhì)材料輔助電離過(guò)程。目前基于磁性微納顆粒的LDI MS過(guò)程主要是用來(lái)檢測(cè)諸如蛋白和肽段的生物大分子，在細(xì)胞代謝分析領(lǐng)域的小分子檢測(cè)仍有待進(jìn)一步拓展。對(duì)于耦合循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲及其下游的代謝小分子分析則是一片空白，此類技術(shù)亟待開(kāi)發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種表面修飾的磁性納米顆粒及其制備方法，并提供了該磁性納米顆粒在捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞以及在循環(huán)腫瘤細(xì)胞的代謝分子分析中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0008]本發(fā)明提供了一種表面修飾的磁性納米顆粒的制備方法，包括以下步驟:
[0009]步驟I:制備磁性納米顆粒；
[0010]其具體步驟還包括:
[0011 ]步驟1.1:將三氯化鐵和檸檬酸三鈉溶解在乙二醇溶液中；
[0012]步驟1.2:在步驟1.1的混合溶液中加入乙酸鈉，并超聲直到溶液變成均相體系；
[0013]步驟1.3:反應(yīng)在聚四氟乙烯襯底的高壓反應(yīng)釜中進(jìn)行，150?195攝氏度條件下反應(yīng)10小時(shí)以上，制得含鐵氧化物的磁性納米顆粒；
[0014]步驟2:使用抗體對(duì)步驟I中得到的磁性納米顆粒進(jìn)行表面修飾；
[0015]步驟3:加入過(guò)量的BSA溶液封閉磁性納米顆粒表面修飾物的多余位點(diǎn)；
[0016]步驟4:清洗步驟3中得到的經(jīng)表面修飾的磁性納米顆粒。
[0017]進(jìn)一步地，上述步驟2中的抗體能夠特異性識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
[0018]本發(fā)明還提供了另一種表面修飾的磁性納米顆粒的制備方法，包括以下步驟:
[0019]步驟1:制備磁性納米顆粒；
[0020]其具體步驟還包括:
[0021 ]步驟1.1:將三氯化鐵和檸檬酸三鈉溶解在乙二醇溶液中；
[0022]步驟1.2:在步驟1.1的混合溶液中加入乙酸鈉，并超聲直到溶液變成均相體系；
[0023]步驟1.3:反應(yīng)在聚四氟乙烯襯底的高壓反應(yīng)釜中進(jìn)行，150?195攝氏度條件下反應(yīng)10小時(shí)以上，制得含鐵氧化物的磁性納米顆粒；
[0024]步驟2:在步驟I中得到的磁性納米顆粒表面修飾鏈霉親和素；
[0025]步驟3:使用生物素偶聯(lián)的抗體或者適配體對(duì)步驟2中得到的磁性納米顆粒進(jìn)行表面修飾；
[0026]步驟4:加入過(guò)量的BSA溶液封閉磁性納米顆粒表面修飾物的多余位點(diǎn)；
[0027]步驟5:清洗步驟4中得到的經(jīng)表面修飾的磁性納米顆粒。
[0028]進(jìn)一步地，上述步驟3中的抗體或者適配體能夠特異性識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
[0029]本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述制備方法制備得到的表面修飾的磁性納米顆粒。
[0030]本發(fā)明還提供了上述表面修飾的磁性納米顆粒在捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用，包括以下步驟:
[0031]步驟1:將表面修飾的磁性納米顆粒加入到含有循環(huán)腫瘤細(xì)胞的血液或者緩沖液中，充分混合；
[0032]步驟2:利用磁鐵分離捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表面修飾的磁性納米顆粒；
[0033]步驟3:清洗步驟2中捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表面修飾的磁性納米顆粒。
[0034]本發(fā)明還提供了上述表面修飾的磁性納米顆粒在循環(huán)腫瘤細(xì)胞的代謝分子分析中的應(yīng)用，包括以下步驟:
[0035]步驟1:將表面修飾的磁性納米顆粒加入到含有循環(huán)腫瘤細(xì)胞的血液或者緩沖液中，充分混合；
[0036]步驟2:利用磁鐵分離捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表面修飾的磁性納米顆粒；
[0037]步驟3:清洗步驟2中捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表面修飾的磁性納米顆粒；
[0038]步驟4:將步驟3中得到的捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表面修飾的磁性納米顆粒加入到代謝分子溶液中處理0-24小時(shí)；
[0039]步驟5:將步驟4中得到的捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表面修飾的磁性納米顆粒在質(zhì)譜靶板上制樣，并在室溫下干燥；
[0040]步驟6:利用激光解析電離質(zhì)譜，對(duì)步驟5中制備的樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析；
[0041 ]步驟7:對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行分析，得出結(jié)論。
[0042]進(jìn)一步地，捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表面修飾的磁性納米顆?？芍苯佑米餮h(huán)腫瘤細(xì)胞代謝分子質(zhì)譜分析的基質(zhì)。
[0043]進(jìn)一步地，可利用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行代謝分子的定量檢測(cè)與分析。
[0044]進(jìn)一步地，上述步驟4中的代謝分子包括糖類小分子和氨基酸小分子。
[0045]更進(jìn)一步地，上述糖類小分子包括葡萄糖和蔗糖，氨基酸小分子包括苯丙氨酸和谷氨酸。
[0046]本發(fā)明通過(guò)采用磁性顆粒材料作為基質(zhì)，將循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲和下游分析有機(jī)耦合，彌補(bǔ)了目前循環(huán)腫瘤細(xì)胞基于蛋白和基因分析方法的不足，并且克能夠?qū)ρh(huán)腫瘤細(xì)胞中的代謝分子的代謝情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0047](I)磁性納米顆粒制備成本低，可以大批量制作，合成步驟簡(jiǎn)單；
[0048](2)磁性納米顆粒能夠高效地捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并且具有快速磁響應(yīng)和紫外吸收；
[0049](3)對(duì)于微量細(xì)胞也能獲得高的捕獲效率；
[0050](4)可直接耦合下游的代謝分析；
[0051](5)磁性納米顆粒既可以作為捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的材料，又可以作為質(zhì)譜分子分析的基質(zhì)；
[0052](6)能夠檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞對(duì)于代謝小分子的代謝速度。
[0053]以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以充分說(shuō)明本發(fā)明的