一種古代羊毛織品間接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)試紙的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及文物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種古代羊毛織品間接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)試紙的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]羊毛是一種天然動(dòng)物毛纖維。具有角質(zhì)組織，呈現(xiàn)光澤，堅(jiān)韌并有彈性。因其產(chǎn)量高、種類多，可生產(chǎn)多種毛織品，是主要的毛紡工業(yè)原料。中國(guó)歷史悠久，從中國(guó)早期的墓葬中出土有大量的羊毛制品文物，出土的大量羊毛制品文物對(duì)研究古代社會(huì)環(huán)境和人文活動(dòng)具有重要參考價(jià)值。
[0003]羊毛的主要成分是角蛋白，在酸、堿、鹽、氧化劑、還原劑、鹵素等中羊毛都具有一定的不穩(wěn)定性。此外羊毛還容易受到多種環(huán)境因素，如光照、射線和微生物等的影響，造成角蛋白發(fā)生變性和分子鏈的斷裂，從而使其降解破壞，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法對(duì)文物樣品要求較高，而出土的羊毛制品文物一般都有不同程度的破損，對(duì)于破損文物尤其是腐朽文物的檢測(cè)存在一定難度。常用的酶聯(lián)免疫的方法，實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，需要在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，且檢測(cè)結(jié)果不夠直觀，不適合于考古現(xiàn)場(chǎng)分析，而取而代之的間接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)用的膠體金試紙?jiān)诙糠治錾嫌腥毕?，相?duì)靈敏度低，也亟需完善。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種古代羊毛織品間接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)試紙的制備方法。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，制備的古代羊毛織品間接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)試紙成本低，用于檢測(cè)時(shí)定量分析準(zhǔn)確性高，反應(yīng)時(shí)間短，靈敏度高，更加直觀，適合于考古現(xiàn)場(chǎng)的檢測(cè)。
[0005]本發(fā)明的具體技術(shù)方案為:一種古代羊毛織品間接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)試紙的制備方法，其特征在于步驟如下:
A)熒光標(biāo)記兔抗角蛋白抗體的制備:向每2.5-3.5mL的PBS緩沖液中依次加入0.14-
0.16mg的熒光微球、2.6-2.8yL的現(xiàn)配的濃度為4_6mg/mL的1_( 3-二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺溶液和8-12yL的濃度為0.4-0.6mg/mL的兔抗角蛋白抗體溶液，得到A混合液，將所述A混合液在室溫下攪拌1.5-2.5h，用0.5-1.5被％的牛血清蛋白溶液封閉25-35min后在8000-10000 r/min、4°C條件下離心處理8-12min，移除上清液，將沉淀加入到體積為兔抗角蛋白抗體溶液30倍的PBS緩沖液中復(fù)溶、混勻，制得熒光標(biāo)記兔抗角蛋白抗體溶液，將所述熒光標(biāo)記兔抗角蛋白抗體溶液保存?zhèn)溆谩?br>[0006]B)試紙條的組裝:用噴膜機(jī)將5-20體積份的羊毛角蛋白稀釋液和5-20體積份的山羊抗兔抗體稀釋液分別噴在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線和質(zhì)控線上，在36-38°C下烘干備用;將5-20體積份的熒光標(biāo)記兔抗角蛋白抗體溶液稀釋10-20倍后包被在熒光結(jié)合墊上，在36-38°C下烘干備用;將樣品墊、熒光結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次組裝在PVC底板上，并切割成條狀，制得檢測(cè)試紙，將所述檢測(cè)試紙放入帶干燥劑的鋁箔袋中密封儲(chǔ)存。
[0007]本發(fā)明利用免疫熒光層析技術(shù)的原理來(lái)檢測(cè)古代墓葬中羊毛織品的痕跡，即將兔抗羊毛角蛋白抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后將熒光標(biāo)記的兔抗羊毛角蛋白抗體溶解在熒光結(jié)合墊上，將羊毛角蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和山羊抗兔IgG(H+L)抗體分別噴在硝酸纖維素薄膜上形成檢測(cè)線和質(zhì)控線。樣品加入樣品吸收墊，樣品中的液體首先溶解結(jié)合墊中含有的熒光標(biāo)記的兔抗羊毛角蛋白抗體，同時(shí)，樣品中待測(cè)抗原與熒光標(biāo)記的兔抗羊毛角蛋白抗體結(jié)合，形成抗原-兔抗羊毛角蛋白抗體熒光復(fù)合物，并靠毛細(xì)作用向檢測(cè)線移動(dòng)。樣品經(jīng)過(guò)檢測(cè)線時(shí)，樣品中的抗原與硝酸纖維素膜上的抗原進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)兔抗羊毛角蛋白抗體。若樣品中含有抗原，聚集在硝酸纖維素膜上的熒光標(biāo)記的兔抗羊毛角蛋白抗體就會(huì)減少，檢測(cè)線不顯熒光?？乖?熒光標(biāo)記的兔抗羊毛角蛋白抗體或者熒光標(biāo)記的兔抗羊毛角蛋白抗體(樣品中不含有抗原)經(jīng)過(guò)質(zhì)控線，與山羊抗兔IgG(H+L)抗體反應(yīng)，熒光標(biāo)記的兔抗羊毛角蛋白抗體聚集在質(zhì)控線上，在紫外照射下顯出明顯的熒光，且熒光強(qiáng)度可通過(guò)熒光定量?jī)x測(cè)定。即若T/C(陽(yáng)性K T/C(陰性)證明樣品中含有羊毛角蛋白；若T/C(陽(yáng)性)> T/C(陰性)，證明樣品中未含有羊毛角蛋白或者羊毛角蛋白的濃度低于試紙條的檢出限。
[0008]作為優(yōu)選，步驟A)中所述熒光微球?yàn)榫郾揭蚁晒馕⑶颍綖?00-11nm，激發(fā)波長(zhǎng)為365nm，發(fā)射波長(zhǎng)為610nmo
[0009]作為優(yōu)選，所述PBS緩沖液的濃度為0.02mol/L，pH為5.5。
[0010]作為優(yōu)選，步驟A)中所述牛血清蛋白溶液的用量為A混合液體積的1-1.2倍。
[0011]作為優(yōu)選，步驟B)中所述硝酸纖維素膜的規(guī)格為長(zhǎng)2.5cm，寬4mm。
[0012]作為優(yōu)選，所述檢測(cè)試紙的寬度為4mm。
[0013]作為優(yōu)選，所述羊毛角蛋白稀釋液的制備方法為:將羊毛角蛋白用Tris-HCl溶液稀釋至濃度為0.5-4mg/mLo
[0014]作為優(yōu)選，所述山羊抗兔抗體稀釋液的制備方法為:將濃度為lmg/mL的山羊抗兔抗體溶液用Tr i s-HCl溶液稀釋至100-400倍。
[0015]作為優(yōu)選，所述熒光標(biāo)記兔抗角蛋白抗體溶液稀釋所用的稀釋溶液包括0.15wt%的吐溫-20，1%的牛血清蛋白、5%的蔗糖和余量的Tris-HCl溶液。
[0016]作為優(yōu)選，步驟B)中所述Tri s-HCl溶液的pH為8.2。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，制備的古代羊毛織品間接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)試紙成本低，用于檢測(cè)時(shí)定量分析準(zhǔn)確性高，反應(yīng)時(shí)間短，靈敏度高，顯示更加直觀，適合于考古現(xiàn)場(chǎng)的檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0019]實(shí)施例1
一種古代羊毛織品間接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)試紙的制備方法，其特征在于步驟如下:
A)熒光標(biāo)記兔抗角蛋白抗體的制備:向3mL的濃度為0.02mol/L(pH為5.5)的PBS緩沖液中依次加入0.15mg的聚苯乙稀焚光微球(粒徑為105nm，激發(fā)波長(zhǎng)為365nm，發(fā)射波長(zhǎng)為610nm)、2.7yL的現(xiàn)配的濃度為5mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺溶液和1yL的濃度為0.5mg/mL的兔抗角蛋白抗體溶液，得到A混合液，將所述A混合液在室溫下攪拌2h，用體積為A混合液體積1.1倍的lwt%的牛血清蛋白溶液封閉30min后在9000 r/min、4°C條件下離心處理1min，移除上清液，將沉淀加入到體積為兔抗角蛋白抗體溶液30倍的PBS緩沖液中復(fù)溶、混勻，制得熒光標(biāo)記兔抗角蛋白抗體溶液，將所述熒光標(biāo)記兔抗角蛋白抗體溶液在4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0020]B)試紙條的組裝:用噴膜機(jī)將12.5yL羊毛角蛋白稀釋液和12.5yL山羊抗兔抗體稀釋液分別噴在硝酸纖維素膜(長(zhǎng)2.5cm，寬4mm)的檢測(cè)線和質(zhì)控線上，在37°C下烘干備用;將12.5yL熒光標(biāo)記兔抗角蛋白抗體溶液稀釋15倍后包被在熒光結(jié)合墊上，在37°C下烘干備用;將樣品墊、熒光結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次組裝在PVC底板上，并切割成4_寬的條狀，制得檢測(cè)試紙，將所述檢測(cè)試紙放入帶干燥劑的鋁箔袋中密封儲(chǔ)存。
[0021]其中，所述羊毛角蛋白稀釋液的制備方法為:將羊毛角蛋白用pH為8.2的Tris-HCl溶液稀釋至濃度為0.2mg/mL。所述山羊抗兔抗體稀釋液的制備方法為:將濃度為lmg/mL的山羊抗兔抗體溶液用PH為8.2的Tris-HCl溶液稀釋至250倍。所述熒光標(biāo)記兔抗角蛋白抗體溶液稀釋所用的稀釋溶液包括0.15wt%的吐溫-20，1%的牛血清蛋白、5%的蔗糖和余量的pH為8.2的Tris-HCl溶液。
[0022]C)取Ig紡織品痕跡樣，溶解于75ml、pH為8.2的Tris-HCl溶液中，攪拌均勻，2h后取一滴上清液滴在組裝好的試紙條的樣品墊上，設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照;取PBS7.4緩沖溶液一滴滴在試紙條的樣品墊上，設(shè)為陰性對(duì)照；20min后，在波長(zhǎng)為365nm的三用紫外分析儀照射下，用紫外定量?jī)x測(cè)得檢測(cè)線(T)和質(zhì)控線(C)的熒光強(qiáng)度，結(jié)果為陽(yáng)性對(duì)照的T/C=0.63〈陰性對(duì)照的T/C=0.80，說(shuō)明樣品中含有羊毛角蛋白，該紡織品痕跡為羊毛織品的痕跡。
[0023]實(shí)施例2
一種古代羊毛織品間接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)試紙的制備方法，其特征在于步驟如下:
A)熒光標(biāo)記兔抗角蛋白抗體的制備:向2.5mL的濃度為0.02mOl/L(pHS5.5)的I3BS緩沖液中依次加入0.14mg的聚苯乙稀焚光微球(粒徑為100]11]1，激發(fā)波長(zhǎng)為365111]1，發(fā)射波長(zhǎng)為610nm)、2.6yL的現(xiàn)配的濃度為4mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺溶液和8yL的濃度為0.4mg/mL的兔抗角蛋白抗體溶液，得到A混合液，將所述A混合液在室溫下攪拌
1.5h，用體積為A混合液體積I倍的0.5的％的牛血清蛋白溶液封閉25min后在8000 r/min、4°(:條件下離心處理8min，移除上清液，將沉淀加入到體積為兔抗角蛋白抗體溶液30倍的PBS緩沖液中復(fù)溶、混勻，制得熒光標(biāo)記兔抗角蛋白抗體溶液，將所述熒光標(biāo)記兔抗角蛋白抗體溶液在4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0024]B)試紙條的組裝:用噴膜機(jī)將5yL羊毛角蛋白稀釋液和5yL山羊抗兔抗體稀釋液分別噴在硝酸纖維素膜(長(zhǎng)2.5cm，寬4mm)的檢測(cè)線和質(zhì)控線上，在36°C下烘干備用；將5yL熒光標(biāo)記兔抗角蛋白抗體溶液稀釋20倍后包被在熒光結(jié)合墊上，在36°C下烘干備用；將樣品墊、熒光結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次組裝在PVC底板上，并切割成4_寬的條狀，制得檢測(cè)試紙，將所述檢測(cè)試紙放入帶干燥劑的鋁箔袋中密封儲(chǔ)存。
[0025]其中，所述羊毛角蛋白稀釋液的制備方法