專利名稱：一種水稻矮化相關蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種水稻矮化相關蛋白及其編碼基因與應用。

背景技術：
赤霉素(Gibberellin，GA)是人們發(fā)現(xiàn)的第一種植物激素類物質，它是一類四環(huán)二萜羧酸化合物。至今已在植物和真菌中發(fā)現(xiàn)了126種赤霉素類物質，但僅有少數(shù)幾種GAs(GA1，GA4，GA3和GA7)具有生理活性。GA是一類重要的植物激素，參與植物生長發(fā)育的各個過程如種子萌發(fā)，莖的伸長，葉片生長，花粉成熟和花的誘導和發(fā)育。植株的矮化是植物的重要特征，由于它抗倒伏性強，同時矮桿植物可以降低營養(yǎng)生長，將光合產物更多的運輸?shù)缴称鞴?，提高產量。因此，矮桿作物常被育種時選擇利用，通過將矮桿基因引入小麥和水稻作物，培育出了粗壯、矮桿、抗倒伏的新品種，這在上世紀60-70年代曾帶來了農業(yè)上的綠色革命。近年來，人們對植物矮化突變體研究時發(fā)現(xiàn)，植物的矮化多半是由于GA合成代謝途徑或信號轉導途徑相關的基因突變引起。引起水稻綠色革命的矮桿基因semi-dwarf1(sd1)，就是GA合成途徑中編碼GA2氧化酶的基因突變形成。
目前有關GA合成及信號轉導途徑的研究比較多，而相比較而言，GA分解(代謝)相關基因研究相對滯后，但近來的研究表明，GA分解相關酶對維持植物體內GAs動態(tài)平衡非常重要。目前研究比較多的是催化活性GA分子失活的酶GA 2β-羥化酶(GA 2β-hydroxylase，GA2ox)，它催化C-2的β位發(fā)生羥基化，從而使活性GA分子失活。GA2氧化酶基因在植物基因組中一般也是以小基因家族形式存在的，在擬南芥中已經分離到8個GA2氧化酶基因。豌豆的sln是一個PsGA2氧化酶1基因的突變體，它的表型與GA過量處理的莖桿細長表型相似(Martin et al，1999；Lester et al，1999)。在擬南芥中兩個GA2氧化酶基因(AtGA2ox7，AtGA2ox8)過量表達都引起植株矮化和晚花。Victor等(2003)報道，由于35S增強子的插入激活而導致楊樹中的GA2氧化酶基因的過量表達，進而引起楊樹矮化，且這一矮化效應表現(xiàn)為顯性。目前在水稻中已有4個GA2氧化酶基因被克隆(0sGA2ox1，0sGA2ox2，0sGA2ox3，0sGA2ox4)，且四個基因在水稻中的都有不同表達模式，0sGA2氧化酶1的過表達同樣引起水稻植株的矮稈和花器官發(fā)育遲緩。


發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種水稻矮化相關蛋白及其編碼基因與應用。
本發(fā)明所提供的水稻矮化相關蛋白，命名為0sGA20X5，來源于水稻，是如下a)或b)的蛋白 a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質； b)在序列表中序列3所示的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且與水稻矮化相關由a)衍生的蛋白質。
其中，序列表中序列3由358個氨基酸殘基組成。
為了使a)中的0sGA20X5便于純化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
表1.標簽的序列 上述b)中的0sGA20X5可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述b)中的0sGA20X5的編碼基因可通過將序列表中序列2的5′末端第137-1213位所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
編碼所述0sGA20X5的基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。
0sGA20X5編碼基因是如下1)至5)任一所述的基因 1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子； 2)其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子； 3)其編碼序列是序列表中序列2自5′末端第137-1213位所示的DNA分子； 4)在嚴格條件下可與序列表中序列1或2限定的DNA序列雜交且編碼上述與水稻矮化相關蛋白的DNA分子； 5)與1)或2)或3)的基因具有90％以上的同源性，且編碼上述與水稻矮化相關蛋白的DNA分子。
所述步驟5)中的基因，與1)或2)或3)的基因最好有95％以上的同源性。
序列表中的序列1由3301個堿基組成，包含三個外顯子，兩個內含子，其編碼序列為自5′端第1位至489位，第2535位至2877位，第3058位至3301位脫氧核苷酸，同源比對結果顯示該基因與擬南芥GA2氧化酶基因高度同源。0sGA20x5基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列表中序列2由1421個堿基組成，序列2自5′末端第137-1213位為編碼序列，編碼序列表中序列3所示的蛋白。
上述嚴格條件可為在6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt′s，100ug/ml鮭魚精DNA的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
擴增上述0sGA20x5基因全長或任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。
含有上述水稻株高相關蛋白編碼基因的重組載體、轉基因細胞系和重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。
可用現(xiàn)有的植物表達載體構建含有0sGA20x5基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達載體。攜帶有本發(fā)明的水稻株高相關蛋白編碼基因0sGA20x5的植物表達載體可通過Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉化到植物細胞或組織中。所述植物包括但不限于水稻、小麥、高梁、谷子、玉米、甘蔗、牧草、煙草、油菜、大白菜、小白菜、甘藍、番茄、黃瓜、甜瓜、西瓜、辣椒、棉花、苜蓿。被轉化的宿主植物優(yōu)選為水稻。
使用0sGA20x5基因構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、泛生素基因Ubiquitin啟動子(pUbi)等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發(fā)明的0sGA20x5基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉錄起始區(qū)域或結構基因。
為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達可產生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用0sGA20x5基因培育株高降低的水稻的方法。
本發(fā)明所提供的株高降低的水稻的方法，是將含有0sGA20x5基因的重組表達載體導入植物細胞中，獲得株高降低的轉基因水稻；也可利用轉0sGA20x5基因的株高降低的水稻，通過經典雜交優(yōu)化植株株高，即通過轉0sGA20x5基因的株高降低的水稻植株與需要改良的高桿品種雜交，然后再與親本回交的方法獲得株高降低的水稻。
本發(fā)明克隆了0sGA20x5基因，并且將構建的含有0sGA20x5基因的植物表達載體導入水稻中，獲得0sGA20x5基因過量表達的矮桿轉基因植株，且矮桿表型為顯性；而目前生產上所用的矮化基因都是隱性基因如sd1基因，獲得純合的矮桿品種需要較長的時間。0sGA20x5基因為育種工作提供新型矮源。本發(fā)明的與水稻矮化相關的蛋白及其編碼基因對縮短育種年限，提高育種效率、豐富水稻矮源具有極其重要的價值。



圖1為野生型武香粳9983和武香粳9983的顯性矮桿突變體DD1的表型 A左邊為野生型武香粳9983，右邊為矮桿突變體DD1；B野生型武香粳9983與矮桿突變體DD1各節(jié)間對比，左邊四個為野生型武香粳9983對應節(jié)間，右邊四個為矮桿突變體DD1對應節(jié)間； 圖2為矮桿突變體DD1和野生型武香粳9983中0sGA20x5基因的表達分析A半定量PCR；BReal-time PCR。
圖3為轉空載體pCAMBIA1300的武香粳9983植株和0sGA20X5基因過表達植株的表型 左邊為轉空載體pCAMBIA1300的武香粳9983植株，右邊為0sGA20X5基因過表達植株。
圖4為野生型武香粳9983，矮桿突變體DD1和0sGA20X5基因過表達植株中0sGA20x5基因的Real-time PCR表達分析。
圖5為0sGA20X5基因在水稻不同組織中的表達特性 1胚芽鞘；2根；3小苗；4葉片；5倒二莖；6穗下莖；7穗子。

具體實施例方式 以下實施例中的方法如無特殊說明均屬常規(guī)方法。
實施例1、水稻0sGA20X5基因的獲得 a)水稻顯性矮桿突變體DD1獲得及其遺傳分析 野生型武香粳9983由江蘇省明天種業(yè)有限公司提供。
在以粳稻品種武香粳9983為轉化親本的轉基因T0代植株中篩選到一株矮桿突變體，編號為GN42，收獲T0代種子，T0代種子種植后長成T1代植株，觀察并記錄T1代植株的表型及分離比。結果表明突變體T1代從分蘗期開始呈現(xiàn)1∶3的高矮分離，矮化性狀與轉基因抗性選擇標記基因潮霉素基因共分離，說明這一矮桿性狀是可遺傳的。對T2代植株進行進一步的遺傳分析，T2代植株中高桿植株與矮桿植株的比例仍為1∶3，符合一對單基因控制性狀的遺傳表現(xiàn)，且該突變?yōu)橐伙@性突變。選擇純合矮桿植株進行下一步的遺傳分析。
將GN42自交后代純合的矮稈突變體與龍?zhí)馗M行測交，所得F1表現(xiàn)為矮稈，初步說明矮稈突變性狀為顯性。其F2代群體在株高上出現(xiàn)明顯的分離，分離出矮稈和正常株高2種類型，在調查的522株中，有388株表現(xiàn)為矮桿，134株表現(xiàn)為正常株高，符合一對等位基因3∶1的分離比例(表1)，這一結果進一步表明該突變體的矮稈性狀受一對顯性基因控制，將該編號為GN42的水稻命名為水稻突變體DD1。
表1測交后代群體(F2)的分離
表1中P0.05，1＝3.84。
野生型水稻品種武香粳9983為江蘇武進農科所育成的優(yōu)質粳稻品種，株高90-95厘米，顯性矮桿突變體DD1是在以武香粳9983作為轉基因受體的轉基因后代中發(fā)現(xiàn)的，矮桿表型與轉基因抗性選擇標記基因潮霉素連鎖，矮桿突變體DD1植株株高45-50厘米。圖1A左邊為野生型水稻品種武香粳9983，右邊為顯性矮桿突變體DD1；圖1B為野生型與突變體DD1各莖節(jié)的對比圖，圖中可看出與對照相比，突變體DD1各個節(jié)間均明顯縮短。突變體DD1與野生型除了在株高上有顯著差別外，生育期，產量均無明顯差異。
b)水稻0sGA20X5編碼基因的獲得 矮桿表型與T-DNA共分離，因此，采用了Tail-PCR技術以獲得T-DNA插入位置的旁側序列。
TAIL-PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR)又叫熱不對稱交錯PCR，這一技術能有效地分離與已知DNA序列鄰近的未知序列，TAIL-PCR技術簡單易行，反應高效靈敏，產物的特異性高，重復性好，能夠在較短的時間內獲得目標片段，已經成為分子生物學研究中的一種實用技術。經改良過的TAIL-PCR能成功地從突變體中克隆到外源插入基因的旁側序列，從而為基因克隆提供了有效的新方法。
以水稻突變體DD1的基因組DNA為模板，根據(jù)已知插入序列設計巢式引物DDT-1、DDT-2和DDT-3進行PCR反應，DDT-1、DDT-2和DDT-3的引物序列如下 DDT-15′-TACACAAATCGCCCGCAGAA-3′， DDT-25′-CCGAGGGCAAAGAAATAGAG-3′， DDT-35′-TCCTATAGGGTTTCGCTCAT-3′。
另外設計三條隨機引物AD-1、AD-2和AD-3，AD-1、AD-2和AD-3的引物序列如下 AD-15′-AGTGNAGAANCAAAGG-3′， AD-25′-TCGTNCGNACNTAGGA-3′， AD-35′-NTCGASTWTSGWGTT-3′， 反應體系25μl，反應程序參照(Liu Y G等，Efficient isolation and mappingof Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetricinterlaced PCR.The plant journal 1995，3457-463)，三輪巢式PCR后，產物經1％瓊脂糖凝膠分離，采用OMEGA膠回收試劑盒回收特異條帶，按照TAKARAPMD18-T試劑盒推薦程序進行T-A克隆，反應體系如下 DNA片段4.6μl(20ng/ul)，T載體0.4μl，連接buffer 5μl，總體積10μl，16度水浴連接30分鐘，轉化DH5a感受態(tài)，于含有氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性克隆，挑取陽性克隆進行測序。測序結果表明T-DNA插入位置位于一個基因的啟動子上游，該基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，將其命名為0sGA20x5，0sGA20x5基因包含三個外顯子，兩個內含子，其編碼序列為自5′端第1位至489位，第2535位至2877位，第3058位至3301位脫氧核苷酸，同源比對結果顯示該基因與擬南芥GA2氧化酶基因高度同源。0sGA20x5基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列表中序列2由1421個堿基組成，序列2自5′末端第137-1213位為編碼序列，編碼序列表中序列3所示的蛋白。
由于T-DNA區(qū)含有一個35S的增強子，因此，矮化表型可能是由于0sGA20x5基因過量表達引起，因此對0sGA20x5基因進行表達分析。突變體DD1和野生型的葉片總RNA提取采用QIAGEN公司RNA提取試劑盒，以oligo dt為引物，按promega公司的反轉錄試劑盒所述方法反轉錄成cDNA，以0sGA20x5基因編碼區(qū)特異引物RTGA2-174-F和RTGA2-174-R進行半定量PCR和Real-time PCR，以ubiquitin作為內參。引物序列如下 RTGA2-174-F5′-GGGGCCTGCACCTGATGAAG-3′， RTGA2-174-R5′-AGGAAGTAGGCCACCGATAG-3′； UBIq-F5′-CAAGATGATCTGCCGCAAATGC-3′(內參引物)， UBIq-R5′-TTTAACCAGTCCATGAACCCG-3′(內參引物)。
結果如圖2所示，突變體DD1中0sGA20x5基因的表達量明顯高于野生型武香粳9983，Real-time PCR結果顯示在突變體DD1中0sGA20x5基因的表達量比野生型高出30多倍。因此，可以確定突變體DD1的顯性矮化表型是由于T-DNA插入?yún)^(qū)下游的0sGA20x5基因的過量表達造成的。
圖2中，“WT”代表野生型武香粳9983，“mutant”代表突變體DD1。
實施例2、過表達0sGA20X5基因的水稻的獲得 a)pCAMBIA-0sGA20X5表達載體的構建 以野生型武香粳9983的cDNA為模板，設計如下引物P1和P2，擴增0sGA20X5基因編碼區(qū)片段，引物P1和P2的序列如下 P1A GGATCC ATGCCGGCCTTCGCCGACAT； P2G GAGCTC TTATTGTACTGAAGAATGCT。
在引物P1和P2的兩端分別引入BamH I和Sac I酶的識別位點。
擴增產物用QIAquick膠回收試劑盒(Qiagen，28706)按產品說明書進行純化，然后與pGEM-T EASY載體(Promega，A1360)在16℃下連接8小時，構建重組載體pGEM-0sGA20X5。使用2mm電極杯，2500V將重組載體pGEM-0sGA20X5轉化大腸桿菌DH5α，轉化物在含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上生長，挑選克隆，提取質粒，對質粒進行測序，測序使用AbI PRISM 3700DNA分析儀(Perkin-Elmer/AppliedBiosystem)，測序結果表明，擴增到的片段的核苷酸序列如序列表中序列2所示，序列表中序列2由1421個堿基組成，序列2自5′末端第137-1213位為編碼序列，編碼序列表中序列3所示的蛋白。
將上述純化后的重組載體pGEM-0sGA20X5質粒用BamH I和Sac I酶切，回收酶切后的小片段，與經同樣雙酶切的含35S啟動子的植物表達載體pCAMBIA1300連接構建重組表達載體pCAMBIA-0sGA20X5。
b)過表達0sGA20X5基因的水稻植株的獲得 將pCAMBIA-0sGA20X5表達載體和pCAMBIA1300載體(空載體)通過電擊的方法分別轉入農桿菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105中，利用農桿菌介導法分別將pCAMBIA-0sGA20X5和空載體轉入野生型武香粳9983。水稻轉化的具體方法如下將野生型武香粳9983個體幼胚脫殼滅菌，接種到誘導愈傷組織的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1周后，挑選生長旺盛，顏色淺黃，比較松散的胚性愈傷組織，用作轉化的受體；用含有pCAMBIA-0sGA20X5質粒和pCAMBIA1300(空載體)的EHA105菌株分別侵染水稻愈傷組織，侵染后在黑暗處25℃培養(yǎng)3天；然后在含有50mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷組織，經三代篩選后，將抗性愈傷轉入分化培養(yǎng)基，待愈傷組織分化出小芽后，轉入含有50mg/L潮霉素的生根培養(yǎng)基中生根，獲得再生植株。參照Liu Q-Q，Chen X-H，Wang X-W，Peng L-T，Gu M-H.A rapid simple methed ofassaying hygromycin resistance in transgenic rice plants.Journal ofAgricultural Biotechnology(農業(yè)生物技術學報)，2001，9(3)264(in Chinese)所提供的方法對轉基因再生植株進行潮霉素抗性檢測。
抗性檢測結果表明共獲得了0sGA20X5基因過量表達的水稻12株，陽性的轉空載體的水稻18株。
將上述0sGA20X5基因過量表達的水稻12株和陽性的轉空載體的水稻18株在陰涼處練苗，7天后移栽到水田，觀察轉基因植株的表型情況。
在抽穗期統(tǒng)計0sGA20X5基因過量表達的水稻和轉空載體的水稻的株高。0sGA20X5基因過量表達的水稻和轉空載體的水稻的的株高的對比結果見表2。0sGA20X5基因過量表達的水稻和轉空載體的水稻的表型對比結果見圖3。
表2.0sGA20X5基因過量表達的水稻和轉空載體的水稻的株高的對比 表2中**表示極顯著差異。
采用QIAGEN公司RNA提取試劑盒分別提取野生型武香粳9983，突變體DD1和0sGA20x5基因過表達水稻植株的葉片總RNA，以oligo dt為引物，按promega公司的反轉錄試劑盒所述方法反轉錄成cDNA，以上述0sGA20x5基因編碼區(qū)特異引物RTGA2-174-F和RTGA2-174-R進行Real-time PCR，以ubiquitin作為內參，采用BioRed公司的Opticon Monitor軟件進行定量，excel軟件進行數(shù)據(jù)分析，sigmaplot軟件進行制圖。
Real-time PCR結果如圖4所示，0sGA20x5基因過表達水稻植株中0sGA20X5基因表達量明顯高于野生型武香粳9983和突變體DD1，圖4中，“WT”代表野生型武香粳9983，“DD1”代表突變體DD1，“WT-OVEX”代表0sGA20x5基因過表達水稻植株。
上述實驗結果表明，0sGA20X5基因過量表達的水稻的株高明顯低于轉空載體的水稻，利用本實施例的方法，能夠改變水稻的株高，培育矮桿的水稻品種。
實施例3水稻0sGA20x5基因的組織表達特性 采用RNA的Northern雜交方法檢測不同組織中0sGA20x5基因的表達特性。分別提取胚芽鞘、根、小苗、葉片、倒二莖、穗下莖及穗子的總RNA，參照《分子克隆》第三版所述方法進行Northern雜交分析。
實驗結果如圖3所示，除了根部不表達外，其它各個組織包括葉鞘、胚芽鞘、葉片、穗下莖、倒二莖及穗子中均有表達，穗中表達最強，莖中表達其次，葉片、鞘及胚芽鞘中的表達水平相似，表明0sGA20x5基因的表達情況與水稻生長發(fā)育密切相關。
序列表
<110>中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所
<120>一種水稻矮化相關蛋白及其編碼基因與應用
<130>CGGNARW81394
<160>3
<210>1
<211>3301
<212>DNA
<213>稻屬水稻(Oryza sativa var.nipponbare)
<400>1
atgccggcct tcgccgacat cgccatcgac ccgcctctgg ccgacagcta ccgcgcgctg60
gcgctgctcc gccgcgaccg cgacggtggc attgcgccgc cggctgtgca gatggtcggc120
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aacagtgaat aacatatata taaccggttt ccgttgtcct accggttagc cgagaggtta2400
ttaacctggc tgatcagtac ttttactgtt ttactgccgg ttggtgcaca tggactctag2460
tacggattat gatcgagtgg ttgtactcga ttactaacaa gcggaggttg ttgtggtggt2520
gacggcgtgc aggggcgtga tgcaggaggt ggccgaagcg atgtcgcggg tggcgaacac2580
ggtggcagcg gcgctggcgg aggagctgac cgggcgcgga ggcggcgggg catcggcggc2640
gccgtggttc cctgcggggt gcgacgagac gacgtgcttc ctgcggctca accggtaccc2700
ggcgtgccct ttcgcggcgg acacgttcgg gctggtgccg cacacggaca gcgacttcct2760
caccgtcctg tgccaggacc aggtcggggg cctgcacctg atgaaggact cccggtgggt2820
ggccgtcagg ccacgccccg acgccctcgt cgtcaacatc ggcgatctgt ttcaggtaac2880
agtccgccga ttagctcgct cgggcatcat tgtgtgtacc agctttgacc accaaggcgg2940
gagaaacaga gatgtcatca gatcgacgtg tctttgtgtg gatgcattga ttttaacttt3000
cgatgtccca tgaggccatg aatcattagc taattaattc tctgctctgc tataggcgtg3060
gagcaacaac aggtacaaga gcgtggagca taaagtggtg gccaacgcca agacggaccg3120
gctatcggtg gcctacttcc tgtgcccgtc ctacgactcg cttgtcggga catgcggcga3180
gccatcgcca tacagggcct tcaccttcgg ggagtacagg aagaaggtgc aggaagacgt3240
caggacaacc gggaaaaaga ttggcctccc aaactttttc aagcattctt cagtacaata3300
a3301
<210>2
<211>1421
<212>DNA
<213>稻屬水稻(Oryza sativa var.nipponbare)
<400>2
atcccagcag cattcgtcga cgcgcgctct gcggtagcca gaagctagct tagcatacgt60
gcaactgcgt gtgcgacgcg tacacggctg tacagacaca gataagcctc tcgcctacgt120
agacgtcttc ccgaccatgc cggccttcgc cgacatcgcc atcgacccgc ctctggccga180
cagctaccgc gcgctggcgc tgctccgccg cgaccgcgac ggtggcattg cgccgccggc240
tgtgcagatg gtcggctcgg gcggcgccgt gctggagcgc gacctgccga tggtggacct300
ggagcggctg acgaggggcg gcgcggggga gaggaaggcg tgcgcgggcg ccatggcgag360
ggcggcgtcg gagtgggggt tcttccagct gaccaaccac ggcgtgggcc gggagctgat420
ggaggagatg aggcgggagc aggcaaggct gttccgtctg ccgttcgaaa ccaaggagaa480
ggccggcctg ctcaacggct cgtaccggtg gggcaacccc accgccacgt cgctccgcca540
cctctcgtgg tcggaggcgt tccacgtccc gctcgccagc atctccgggg cggattgcga600
ctttggagac ctcacctcct taaggggcgt gatgcaggag gtggccgaag cgatgtcgcg660
ggtggcgaac acggtggcag cggcgctggc ggaggagctg accgggcgcg gaggcggcgg720
ggcatcggcg gcgccgtggt tccctgcggg gtgcgacgag acgacgtgct tcctgcggct780
caaccggtac ccggcgtgcc ctttcgcggc ggacacgttc gggctggtgc cgcacacgga840
cagcgacttc ctcaccgtcc tgtgccagga ccaggtcggg ggcctgcacc tgatgaagga900
ctcccggtgg gtggccgtca ggccacgccc cgacgccctc gtcgtcaaca tcggcgatct960
gtttcaggcg tggagcaaca acaggtacaa gagcgtggag cataaagtgg tggccaacgc1020
caagacgggc cggctatcgg tggcctactt cctgtgcccg tcctacgact cgcttgtcgg1080
gacatgcggc gagccatcgc catacagggc cttcaccttc ggggagtaca ggaagaaggt1140
gcaggaagac gtcaggacaa ccgggaaaaa gattggcctc ccaaactttt tcaagcattc1200
ttcagtacaa taatgatcgc atcaatgaca gcaaccgctt gttctatata tgttcgttat1260
aatttatggt cgatgtgaac tcgaccgtac catcaatcca tctcactgta caattgtgtg1320
tgcggtgttc ggggttggag gttctttcct tatcatttcc gtggcctttt ttggtttgta1380
gattgtaatt ggcaaggtag tactatacaa gtgattaaac c1421
<210>3
<211>358
<212>PRT
<213>稻屬水稻(Oryza sativa var.nipponbare)
<400>3
Met Pro Ala Phe Ala Asp Ile Ala Ile Asp Pro Pro Leu Ala Asp Ser
1 5 10 15
Tyr Arg Ala Leu Ala Leu Leu Arg Arg Asp Arg Asp Gly Gly Ile Ala
20 25 30
Pro Pro Ala Val Gln Met Val Gly Ser Gly Gly Ala Val Leu Glu Arg
35 40 45
Asp Leu Pro Met Val Asp Leu Glu Arg Leu Thr Arg Gly Gly Ala Gly
50 55 60
Glu Arg Lys Ala Cys Ala Gly Ala Met Ala Arg Ala Ala Ser Glu Trp
65 70 75 80
Gly Phe Phe Gln Leu Thr Asn His Gly Val Gly Arg Glu Leu Met Glu
85 90 95
Glu Met Arg Arg Glu Gln Ala Arg Leu Phe Arg Leu Pro Phe Glu Thr
100 105 110
Lys Glu Lys Ala Gly Leu Leu Asn Gly Ser Tyr Arg Trp Gly Asn Pro
115 120 125
Thr Ala Thr Ser Leu Arg His Leu Ser Trp Ser Glu Ala Phe His Val
130 135 140
Pro Leu Ala Ser Ile Ser Gly Ala Asp Cys Asp Phe Gly Asp Leu Thr
145 150 155 160
Ser Leu Arg Gly Val Met Gln Glu Val Ala Glu Ala Met Ser Arg Val
165 170 175
Ala Asn Thr Val Ala Ala Ala Leu Ala Glu Glu Leu Thr Gly Arg Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Ala Ser Ala Ala Pro Trp Phe Pro Ala Gly Cys Asp Glu
195 200 205
Thr Thr Cys Phe Leu Arg Leu Asn Arg Tyr Pro Ala Cys Pro Phe Ala
210 215 220
Ala Asp Thr Phe Gly Leu Val Pro His Thr Asp Ser Asp Phe Leu Thr
225 230 235 240
Val Leu Cys Gln Asp Gln Val Gly Gly Leu His Leu Met Lys Asp Ser
245 250 255
Arg Trp Val Ala Val Arg Pro Arg Pro Asp Ala Leu Val Val Asn Ile
260 265 270
Gly Asp Leu Phe Gln Ala Trp Ser Asn Asn Arg Tyr Lys Ser Val Glu
275 280 285
His Lys Val Val Ala Asn Ala Lys Thr Gly Arg Leu Ser Val Ala Tyr
290 295 300
Phe Leu Cys Pro Ser Tyr Asp Ser Leu Val Gly Thr Cys Gly Glu Pro
305 310 315 320
Ser Pro Tyr Arg Ala Phe Thr Phe Gly Glu Tyr Arg Lys Lys Val Gln
325 330 335
Glu Asp Val Arg Thr Thr Gly Lys Lys Ile Gly Leu Pro Asn Phe Phe
340 345 350
Lys His Ser Ser Val Gln
35權利要求
1、一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白
a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
b)在序列表中序列3所示的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且與水稻矮化相關由a)衍生的蛋白質。
2、權利要求1所述蛋白的編碼基因。
3、根據(jù)權利要求2所述的基因，其特征在于所述編碼基因是如下1)至5)任一所述的基因
1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
2)其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
3)其編碼序列是序列表中序列2自5末端第137-1213位所示的DNA分子；
4)在嚴格條件下可與序列表中序列1或2限定的DNA序列雜交且編碼上述與水稻矮化相關蛋白的DNA分子；
5)與1)或2)或3)的基因具有90％以上的同源性，且編碼上述與水稻矮化相關的DNA分子。
4、含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體。
5、根據(jù)權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為在pCAMBIA1300載體的多克隆位點插入權利要求2或3所述的基因獲得的重組表達載體。
6、擴增權利要求2或3所述基因全長或任一片段的引物對。
7、含有權利要求2或3所述基因的轉基因細胞系或重組菌。
8、一種培育株高降低的水稻的方法，是將含有權利要求2或3所述基因導入植物細胞中，獲得株高降低的轉基因水稻。
9、一種培育株高降低的水稻的方法，是將權利要求8中所述的株高降低的水稻與需要改良的高桿水稻品種雜交，然后再與親本回交的方法獲株高降低的水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻矮化相關蛋白及其編碼基因與應用。該蛋白，是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)在序列表中序列3所示的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且與水稻矮桿相關由a)衍生的蛋白質。本發(fā)明同時還提供了編碼該蛋白的基因，以及含有所述基因的重組表達載體、轉基因細胞系或重組菌。利用所述基因可以培育株高降低的水稻。本發(fā)明的與水稻矮化相關的蛋白及其編碼基因對縮短育種年限，提高育種效率、豐富水稻矮源具有極其重要的價值。
文檔編號C12N1/21GK101607989SQ20081011535
公開日2009年12月23日 申請日期2008年6月20日 優(yōu)先權日2008年6月20日
發(fā)明者程祝寬, 健 黃, 明 李, 丁 唐 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所