Slc17a5基因及其編碼蛋白在制備治療或診斷與硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝障礙或異常相關(guān)疾病 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了SLC17A5基因及其編碼蛋白在制備治療或診斷與硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝障礙或異常相關(guān)疾病藥物中的用途。本發(fā)明通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)最終確證了SLC17A5基因編碼蛋白（Sialin蛋白）為哺乳動(dòng)物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以將SLC17A5基因或其編碼蛋白制備成治療體內(nèi)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝障礙相關(guān)疾病及抗高血壓、抗休克、治療心肌梗死及預(yù)防胃潰瘍等的藥物。
【專利說(shuō)明】SLC17A5基因及其編碼蛋白在制備治療或診斷與硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝障礙或異常相關(guān)疾病藥物中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及SLC17A5基因及其編碼蛋白的醫(yī)藥用途，尤其涉及SLC17A5基因及其編碼蛋白在制備治療與機(jī)體內(nèi)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝障礙相關(guān)疾病藥物中的用途，屬于SLC17A5基因及其編碼蛋白的醫(yī)藥用途領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]硝酸鹽是自然界廣泛存在的一種無(wú)機(jī)物。最初哺乳動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的硝酸鹽被當(dāng)作是一氧化氮的代謝產(chǎn)物，不具有生物學(xué)活性。后來(lái)人們逐步認(rèn)識(shí)到酸化的硝酸鹽具有殺菌作用，可參與宿主防御，因此對(duì)于硝酸鹽的認(rèn)識(shí)有了新的變化。近年來(lái)的研究表明，硝酸鹽還具有調(diào)節(jié)血壓、調(diào)節(jié)血管張力、作為神經(jīng)信號(hào)和免疫調(diào)節(jié)的功能，對(duì)于口腔、消化道感染、高血壓、休克、心肌梗死以及胃潰瘍等疾病具有潛在的治療價(jià)值。
[0003]硝酸鹽的生理功能依賴于硝酸鹽一亞硝酸鹽一一氧化氮途徑。一氧化氮是一種具有重要生理功能的氣體分子。一直以來(lái)一氧化氮合成酶以L-精氨酸為底物合成一氧化氮途徑被認(rèn)為是機(jī)體一氧化氮的唯一來(lái)源，而硝酸鹽則被當(dāng)成無(wú)生理功能的代謝產(chǎn)物或作為一氧化氮合成的檢測(cè)指標(biāo)。從1994年開始兩個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn)，硝酸鹽和亞硝酸鹽在缺氧和酸性條件下可以還原為一氧化氮。這種非酶源性的一氧化氮途徑(硝酸鹽一亞硝酸鹽一一氧化氮途徑)不僅在缺氧和酸性條件下可以發(fā)生，在正常生理?xiàng)l件下，許多組織和細(xì)胞也會(huì)利用這種非酶源性途徑產(chǎn)生一氧化氮，行使生理功能。
[0004]硝酸鹽在機(jī)體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于“胃腸——唾液腺循環(huán)”。飲食中的硝酸鹽被胃、十二指腸吸收后進(jìn)入血液和內(nèi)源性產(chǎn)生的硝酸鹽一起運(yùn)行于血液循環(huán)中，血循環(huán)中的大部分硝酸鹽直接排出體外不能被利用，其中60%~70%由尿液排出體外，少量由糞便(低于1%)和汗液(低于10%)排出體外。約20%~25%的硝酸鹽被唾液腺主動(dòng)性地從血液中攝取，濃縮并分泌進(jìn)入唾液，唾液硝酸鹽濃度約為血液硝酸鹽的5倍~10倍。
[0005]由唾液腺分泌的硝酸鹽可被口腔內(nèi)兼性厭氧菌中的硝酸鹽還原酶還原為亞硝酸鹽，這樣唾液中就既含有硝酸鹽也含有亞硝酸鹽了。唾液被吞咽后進(jìn)入胃和小腸，硝酸鹽和亞硝酸鹽被再次吸收而再利用，完成“胃腸一唾液腺循環(huán)”，這個(gè)循環(huán)既保障了硝酸鹽的有效利用，也提供穩(wěn)定的亞硝酸鹽來(lái)源。因?yàn)椴溉閯?dòng)物缺乏硝酸鹽還原酶，所以由唾液硝酸鹽還原的亞硝酸鹽是機(jī)體重要的亞硝酸鹽來(lái)源。高濃度的外來(lái)亞硝酸鹽，如來(lái)自亞硝酸鹽污染的食物或飲水，可導(dǎo)致亞硝酸鹽的不良反應(yīng)。但引起不良反應(yīng)的濃度較高(mM~M)，而有生理功能的亞硝酸鹽濃度極低(nM~μ M)。
[0006]在機(jī)體硝酸鹽“胃腸一唾液腺循環(huán)”和硝酸鹽一亞硝酸鹽一一氧化氮途徑中，唾液腺起到極其重要的作用。唾液硝酸鹽有著許多重要的生理功能，如殺死口腔以及上消化道常見的細(xì)菌、微生物或抑制其生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)胃腸功能，以及提供機(jī)體非酶源性一氧化氮的前體物質(zhì)一亞硝酸鹽。對(duì)于唾液以及食物中的硝酸鹽、亞硝酸鹽的認(rèn)識(shí)最近20年來(lái)有了很大改變，由更多地關(guān)注其消極因素轉(zhuǎn)而更多地關(guān)注其積極因素。[0007]在整個(gè)“胃腸一唾液腺循環(huán)”和硝酸鹽一亞硝酸鹽一一氧化氮途徑的體系中，到目前為止，硝酸鹽和亞硝酸鹽如何在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)還沒(méi)有報(bào)道。植物能夠吸收和利用土壤中的硝酸鹽以供應(yīng)體內(nèi)代謝所需的氮元素，植物對(duì)硝酸鹽的吸收無(wú)論是高濃度環(huán)境還是低濃度下都是主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程，而非離子擴(kuò)散。植物根系和酵母等低等生物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體系研究比較清楚，已經(jīng)克隆出多個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)通道。低等生物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)通道屬于從低等生物到高等生物高度保守的膜轉(zhuǎn)運(yùn)體主要輔助因子超家族(major facilitatorSuperfamily，MFS)，具有膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的典型特征，具有十二個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。人類和其它哺乳動(dòng)物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)通道還未有報(bào)道。
[0008]1999年發(fā)現(xiàn)一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的基因(SLC17A5)，SLC17A5位于6ql4_ql5，開放閱讀框架有1485bp。SLC17A5編碼唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Sialin)，屬于主要輔助因子超家族(major
facilitator superfamily, MFS)中的一個(gè)亞家族-陰陽(yáng)離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體(anion/cationsymporters, ACS)家族。Sialin蛋白由495個(gè)氨基酸組成,擁有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),氨基端(N端)和羧基端(C端)位于細(xì)胞漿側(cè)。SLC17A5的突變會(huì)導(dǎo)致兩種主要的唾液酸儲(chǔ)存病:快速進(jìn)展型的嬰兒唾液酸儲(chǔ)存病(infantile sialic acid storage disease, ISSD)和進(jìn)展緩慢的成人型(Salla disease, SD),還存在一種介于兩者之間的中間型，即嚴(yán)重型SD。Sialin最初被認(rèn)為位于細(xì)胞內(nèi)的溶酶體膜上，特異性轉(zhuǎn)運(yùn)溶酶體內(nèi)的游離唾液酸(free sialicacid, free SA)進(jìn)入細(xì)胞漿，SLC17A5突變?cè)斐蒘ialin蛋白部分和全部功能的喪失，導(dǎo)致發(fā)育和神經(jīng)功能障礙。隨后的研究表明，Sialin不僅在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，而且在非神經(jīng)系統(tǒng)中也廣泛表達(dá)，突觸上的Sialin蛋白具有轉(zhuǎn)運(yùn)天門冬氨酸和谷氨酸的能力，提示其還具有其它的生理功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的主要目的是提供SLC17A5基因及其所編碼蛋白的一種新的醫(yī)藥用途。
[0010]本發(fā)明通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)SLC17A5基因編碼蛋白(Sialin)為哺乳動(dòng)物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與動(dòng)物機(jī)體內(nèi)硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝密切相關(guān)。機(jī)體利用硝酸鹽“胃腸——唾液腺循環(huán)”和硝酸鹽一亞硝酸鹽一一氧化氮途徑這一體系發(fā)揮重要生理功能如調(diào)節(jié)血壓、調(diào)節(jié)血管張力、作為神經(jīng)信號(hào)和免疫調(diào)節(jié)；其具有廣闊的疾病治療前景如治療感染、高血壓、休克、心肌梗死以及胃潰瘍(Cosby K, et al.(2003)Nitrite reductionto nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.NatMed9(12):1498-1505 ;Gladwin MT, et al.(2000)Relative role of heme nitrosylationand beta-cysteine93nitrosation in the transport and metabolism of nitric oxideby hemoglobin in the human circulation.Proc Natl Acad Sci USA97(18):9943-9948 ；Lundberg JO,Weitzberg E,&Gladwin MT (2008)The nitrate-nitrite-nitric oxidepathway in physiology and therapeutics.Nat Rev Drug Discov7 (2):156-167 ；Lundberg JO, Carlstrom M, Larsen FJ, &ffeitzberg E(2011)Roles of dietary inorganicnitrate in cardiovascular health and disease.Cardiovasc Res89(3):525-532.X在這一體系中硝酸鹽能否在機(jī)體內(nèi)的有效轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝作用至關(guān)重要。涎腺功能障礙(放射性涎腺損傷、Sjogren’s syndrome等)及SLC17A5基因突變導(dǎo)致的遺傳性疾病——唾液酸儲(chǔ)存病(SASD)影響這一體系的有效運(yùn)行及機(jī)體功能(Xia DS, Deng DJ, &ffangSL(2003)Destruction of parotid glands affects nitrate and nitrite metabolism.J Dent Res82(2):101-105 ;Xia D,Deng D,&ffang S (2003)Alterations of nitrateand nitrite content in saliva, serum, and urine in patients with salivarydysfunction.J Oral Pathol Med32 (2):95-99 ；Verheijen FW, et al.(1999)A newgene, encoding an anion transporter, is mutated in sialic acid storage diseases.Nat Genet23 (4):462-465.)。因此，可以將SLC17A5基因或其編碼蛋白制備成治療體內(nèi)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝障礙相關(guān)疾病及抗高血壓、抗休克、治療心肌梗死及預(yù)防胃潰瘍等的藥物。
[0011]其中，所述SLC17A5基因(mRNA)的核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示；SLC17A5基因編碼蛋白(Sialin)的氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。[0012]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先進(jìn)行了 “胃腸一唾液腺循環(huán)”干擾研究實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，唾液腺功能低下患者(Sjogren’s syndrome, SS)唾液中硝酸鹽、亞硝酸鹽顯著減少，而尿液中明顯升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示唾液腺功能障礙阻礙了硝酸鹽和亞硝酸鹽代謝，唾液腺是機(jī)體硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的重要器官。
[0013]本發(fā)明通過(guò)阻斷大鼠硝酸鹽“胃腸一涎腺循環(huán)”實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，唾液腺在機(jī)體硝酸鹽“胃腸——涎腺循環(huán)”和硝酸鹽——亞硝酸鹽一一一氧化氮途徑中具有極其重要的作用。
[0014]在此基礎(chǔ)上本發(fā)明繼續(xù)進(jìn)行了大鼠應(yīng)激實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明唾液腺不僅在維持機(jī)體硝酸鹽平衡方面具有重要作用，同時(shí)唾液硝酸鹽分泌障礙嚴(yán)重影響全身尤其是消化系統(tǒng)健康。本發(fā)明通過(guò)進(jìn)一步的研究證實(shí)，唾液腺組織能主動(dòng)的攝取硝酸鹽而在唾液腺組織濃集。通過(guò)基因芯片分析，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)唾液腺高表達(dá)SLC17A5 ；RT-PCR和Western Blot證實(shí)SLC17A5和Sialin在唾液腺中的表達(dá)高于全身其他器官。通過(guò)對(duì)唾液腺細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗電生理研究發(fā)現(xiàn)，唾液腺細(xì)胞膜上存在著強(qiáng)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)通道且與已知的對(duì)硝酸鹽離子有弱轉(zhuǎn)運(yùn)能力的氯離子通道1-3 (C1CN1-3)在電生理上完全不一樣。這個(gè)獨(dú)特的強(qiáng)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)通道具有硝酸鹽離子/質(zhì)子共轉(zhuǎn)運(yùn)體特征，質(zhì)子可以促進(jìn)硝酸鹽離子向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，同樣細(xì)胞外的硝酸鹽離子也可以輔助質(zhì)子內(nèi)流。而且這個(gè)唾液腺細(xì)胞強(qiáng)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)通道同樣具有轉(zhuǎn)運(yùn)亞硝酸鹽、SA和天門冬氨酸和谷氨酸的能力，電生理特征與硝酸鹽一致。根據(jù)以上電生理特征本發(fā)明對(duì)SLC17A5基因及其編碼蛋白進(jìn)行深入的研究:
[0015]首先進(jìn)行SLC17A5表達(dá)蛋白Sialin的定位研究，通過(guò)免疫組織化學(xué)、WesternBlot和Confocal研究發(fā)現(xiàn)，Sialin不僅在細(xì)胞內(nèi)的溶酶體膜上表達(dá)，而且在細(xì)胞膜上也有表達(dá)，唾液腺組織上，Sialin主要定位于唾液腺腺泡細(xì)胞的基底膜上，這為Sialin行使離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能提供了有利的證據(jù)。
[0016]在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明通過(guò)shRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染SLC17A5 shRNA后檢測(cè)唾液腺細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SLC17A5基因抑制后，唾液腺細(xì)胞獨(dú)特的強(qiáng)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)通道被有效抑制，其電信號(hào)下降50%以上，細(xì)胞攝取硝酸鹽的能力也大大下降。同樣細(xì)胞攝取已知Sialin底物SA的能力也同樣下降。而轉(zhuǎn)染了細(xì)胞膜高表達(dá)的SLC17A5后，強(qiáng)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)通道功能得到了增強(qiáng)。以上結(jié)果提示Sialin與硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。
[0017]為了檢驗(yàn)導(dǎo)致ISSD和SD的天然突變體是否影響硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)，本發(fā)明在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上轉(zhuǎn)導(dǎo)SLC17A5天然突變體H183R和R39C。H183R和R39C突變分別會(huì)導(dǎo)致快速進(jìn)展型的嬰兒唾液酸儲(chǔ)存病(ISSD)和進(jìn)展緩慢的成人型(SD)。結(jié)果顯示H183R和R39C轉(zhuǎn)染唾液腺細(xì)胞后導(dǎo)致強(qiáng)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)通道功能顯著下降，而H183R下降比R39C明顯。H183R轉(zhuǎn)染正常成纖維細(xì)胞后，其硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)通道功能也顯著下降，提示硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)通道不僅存在于唾液腺細(xì)胞中，同樣存在于全身其它細(xì)胞中，但成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力僅為唾液腺細(xì)胞的1/30。ISSD患者的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力較正常成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽能力下降約75%。
[0018]本發(fā)明通過(guò)小型豬腮腺導(dǎo)管逆行轉(zhuǎn)導(dǎo)H183R突變體，并檢測(cè)唾液硝酸鹽發(fā)現(xiàn)，H183R突變導(dǎo)致唾液硝酸鹽顯著下降。
[0019]根據(jù)上述一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明最終確證了 Sialin蛋白為哺乳動(dòng)物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。因此可以將SLC17A5基因制備成基因治療藥物轉(zhuǎn)導(dǎo)治療放射性涎腺損傷、Sjogren’s syndrome和唾液酸儲(chǔ)存病(SASD)導(dǎo)致的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝障礙。此外,還可以將Sialin蛋白制備成通道激動(dòng)劑治療高血壓、休克、心肌梗死及胃潰瘍疾病。作為診斷上的醫(yī)療用途，可以 將SLC17A5基因制備成基因芯片或?qū)ialin蛋白制備成蛋白芯片進(jìn)行聞血壓基因篩查。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1 Sialin定位及表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0021]圖2轉(zhuǎn)染效力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0022]圖3 Salin基因抑制后膜電流下降。
[0023]圖4 Sialin基因抑制后唾液腺細(xì)胞攝取硝酸鹽能力。
[0024]圖5 Sialin基因突變與HSG細(xì)胞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0025]圖6 ISSD患者成纖維細(xì)胞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0026]圖7正常成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染sialinH183R后細(xì)胞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能。
[0027]圖8 Sialin基因突變與硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0029]實(shí)驗(yàn)例I “胃腸一唾液腺循環(huán)”干擾研究實(shí)驗(yàn)
[0030]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，唾液腺功能低下患者(Sjogren’s syndrome, SS)唾液中硝酸鹽、亞硝酸鹽顯著減少，而尿液中明顯升高。健康志愿者唾液硝酸鹽濃度為990.1±46.5μΜ，亞硝酸鹽濃度為122.2±17.6yM;S S患者唾液硝酸鹽濃度為227.6 ± 17.6 μ M，亞硝酸鹽濃度為79.9±38.8μΜ。健康志愿者尿液中硝酸鹽濃度為1584.2±653.4yM，SS患者尿液中硝酸鹽濃度為4603.9±2188.1 μ Μ。腮腺萎縮小型豬實(shí)驗(yàn)同樣顯示腮腺萎縮導(dǎo)致小型豬唾液硝酸鹽、亞硝酸鹽顯著減少，尿液中明顯升高。
[0031]實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示唾液腺功能障礙阻礙了硝酸鹽和亞硝酸鹽代謝，唾液腺是機(jī)體硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的重要器官。
[0032]實(shí)驗(yàn)例2阻斷唾液腺硝酸鹽分泌導(dǎo)致胃粘膜保護(hù)作用下降實(shí)驗(yàn)
[0033]1、實(shí)驗(yàn)材料和方法
[0034]I)腮腺和頜下腺導(dǎo)管結(jié)扎阻斷唾液腺硝酸鹽分泌[0035]230 - 250g SD雄性大鼠10%水合氯醛麻醉下切開皮膚，結(jié)扎雙側(cè)腮腺和頜下腺導(dǎo)管(P&SDL)。手術(shù)對(duì)照組(sham):切開皮膚不結(jié)扎導(dǎo)管。
[0036]2)大鼠應(yīng)激實(shí)驗(yàn)
[0037]采用浸水束縛應(yīng)激(water-1mmmersion-restraint, WIR)實(shí)驗(yàn)。SD雄性大鼠禁食18-20小時(shí)，禁水I小時(shí)后將其束縛于大鼠固定器中，垂直浸入20 ± 2 °C水中，水平面至劍突水平，持續(xù)4小時(shí) 。
[0038]3)收集大鼠胃液檢測(cè)硝酸鹽和亞硝酸鹽
[0039]行幽門結(jié)扎術(shù)，2h后收集胃液。以3000r/min離心lOmin，取上清液加入0.5%的
0.1M NaOH緩沖液防止亞硝酸鹽的降解。Neos印超濾管(3KDa)，14000g離心20分鐘，去除大分子蛋白質(zhì)備用。硝酸鹽、亞硝酸鹽檢測(cè)采用R&D公司的Nitrate/Nitrite Kit。
[0040]4)大鼠胃內(nèi)一氧化氮(NO)氣體檢測(cè)及胃粘膜表面血流測(cè)定
[0041]Interscan4000 一氧化氮?dú)怏w數(shù)字分析儀(InterScan, USA)檢測(cè)胃內(nèi)一氧化氮?dú)怏w，激光多普勒血流儀(PeriFlux4001Master and PeriFluxPf3;Perimed, Stockholm, Sweden)檢測(cè)胃粘膜表面血流。
[0042]2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0043]I)唾液硝酸鹽阻斷降低了胃液硝酸鹽亞硝酸鹽的濃度及胃內(nèi)NO水平
[0044]大鼠雙側(cè)唾液腺導(dǎo)管結(jié)扎一星期以后，胃內(nèi)硝酸鹽、亞硝酸鹽及NO水平明顯降低。胃液硝酸鹽水平由sham組的52 ± 22 μ M降低到P&SDL組的25 ± 15 μ M (P < 0.05，η=12)，此外，亞硝酸鹽水平由2.04±0.61 μ M降低到 0.88±0.27 μ Μ(Ρ < 0.01，η=12)。胃內(nèi)NO含量從 78±43ppb 降低為 36±15ppb(P < 0.05，n=12)。
[0045]2)唾液硝酸鹽阻斷降低了胃粘膜表面血流，加重了胃粘膜應(yīng)激損傷。
[0046]P&SDL大大降低的胃粘膜表面血流，由sham組的47.24±18.33PU降低為P&SDL組的35.03 + 10.79PU(P < 0.05，n=12)，與此同時(shí)，胃粘膜損傷程度加重，UI指數(shù)由sham組的23.62±8.45mm 上升為 P&SDL 組的 41.83±18.47mm(P < 0.01，n=12)。
[0047]以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，唾液腺不僅在維持機(jī)體硝酸鹽平衡方面具有重要作用，同時(shí)唾液硝酸鹽分泌障礙嚴(yán)重影響全身尤其是消化系統(tǒng)健康。
[0048]實(shí)驗(yàn)例3 Sialin的定位及表達(dá)實(shí)驗(yàn)
[0049]1、實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法
[0050]取人腮腺、頜下腺標(biāo)本，生理鹽水沖洗后，用4%的多聚甲醛(溶于0.1M PBS溶液中)固定24h。脫水、固定、包埋。切片(4μπι厚)后脫蠟，水化，枸鹽酸微波修復(fù)抗原。常規(guī)免疫組化流程，采用免疫雙標(biāo)法檢測(cè)蛋白的表達(dá)和定位。
[0051]1.1 Sialin與溶酶體膜標(biāo)記蛋白共定位實(shí)驗(yàn)
[0052]抗Sialin—抗為:羊抗人 Sialin IgG 抗體(Santa Cruz, CA, USA),稀釋倍數(shù)為 1:1OO0 抗 LAMP-1 (Lysosomal-associated membrane proteinl) 一抗為:小鼠抗人LAMP-1 IgG 抗體(Santa Cruz, CA，USA)，稀釋倍數(shù)為 1:50。二抗分別為 Dylight649 標(biāo)記的兔抗羊IgG(H+L) 二抗(KPL, Gaithersburg, USA)以及FITC標(biāo)記的驢抗鼠IgG 二抗(Proteintech, Chicago, USA)。
[0053]1.2 Sialin與細(xì)胞膜標(biāo)記蛋白共定位實(shí)驗(yàn)
[0054]抗Sialin — 抗為:羊抗人 Sialin IgG 抗體(Santa Cruz, CA, USA),稀釋倍數(shù)為 1:100?？?Na+/K+ATPase — 抗為:小鼠抗人 Na+/K+ATPase IgG 抗體(SantaCruz，CA，USA)，稀釋倍數(shù)為1:50。二抗分別為Dylight649標(biāo)記的兔抗羊IgG(H+L) 二抗(KPL, Gaithersburg, USA),以及FITC標(biāo)記的驢抗鼠 IgG二抗(Proteintech, Chicago, USA)。
[0055]采用Leica共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)唾液腺組織免疫熒光。
[0056]2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 [0057]Sialin蛋白在唾液腺腺泡細(xì)胞上不僅表達(dá)于胞漿中同時(shí)在細(xì)胞膜上也有表達(dá)。Sialin蛋白主要表達(dá)于腺泡細(xì)胞的基底膜和側(cè)膜。通過(guò)與細(xì)胞膜標(biāo)記蛋白Na7K+ATPase共定位研究發(fā)現(xiàn)，Sialin與Na+/K+ATPase在細(xì)胞膜上完全重疊，提示Sialin與Na+/K+ATPase一樣具有細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能。胞漿中的Sialin呈現(xiàn)散在不均勻表達(dá)。通過(guò)與溶酶體膜標(biāo)記蛋白LAMP-1共定位研究發(fā)現(xiàn)，Sialin與LAMP-1部分重疊，符合溶酶體膜和微囊膜蛋白的特點(diǎn)(圖1)。
[0058]實(shí)驗(yàn)例4 Sialin(SLC17A5)基因抑制和細(xì)胞膜過(guò)表達(dá)研究細(xì)胞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能實(shí)驗(yàn)
[0059]1、實(shí)驗(yàn)材料和方法
[0060]I)細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0061]2 X IO5人頜下腺細(xì)胞系(human submandibular gland cells, HSG cells,由 InduS.Ambudkar, Molecular Physiology and Therapeutics Branch, National Institute ofDental and Craniofacial Research，NIH，USA提供)細(xì)胞傳代接種于6孔板中，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清，2mM左旋谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素的DMEM-F12，37℃，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24小時(shí)后，細(xì)胞50-70%匯合，更換新鮮培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)染試劑混合物，均勻加入到整個(gè)孔內(nèi)，隨后輕輕混勻。
[0062]Sialin shRNA (sh-sialin)轉(zhuǎn)染試劑混合物含無(wú)血清培養(yǎng)基100 μ 1，TurboFectin?8.06.0 μ I 及 sh-sialin 質(zhì)粒 2.0 μ g。s hRNA 陰性對(duì)照質(zhì)粒(scrambledshRNA, scram-sh)為 pRS shRNA 載體帶 29bp 對(duì) SLC17A5 無(wú)效的序列。
[0063]膜過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染試劑混合物含無(wú)血清培養(yǎng)基100 μ 1，TurboFectin?8.06.0 μ I,sialinL22AL23A 質(zhì)粒 2.0 μ g0
[0064]sh-sialin (TR309394)Λscram-sh (TR30003)和 TurboFectin?8.0 均購(gòu)自 Origene公司。sialinL22AL23A 質(zhì)粒由 William A.Gahl (Medical Genetics Branch, NationalHuman Genome Research Institute，NIH，USA)和 Changyu Zheng (Molecular Physiologyand Therapeutics Branch, National Institute of Dental and Craniofacial Research，NIH, USA)提供。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后裂解細(xì)胞，并提取細(xì)胞膜蛋白，Western blot在蛋白水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效力。
[0065]2)細(xì)胞膜電生理檢測(cè)
[0066]3)細(xì)胞外液離子成分改變后檢測(cè)細(xì)胞膜電流變化，釆用標(biāo)準(zhǔn)全細(xì)胞膜片鉗方法檢測(cè)細(xì)胞膜電流，其方法參照文獻(xiàn)(Liu X，Liao Dj Ambudkar IS(2001)Distinct mechanismsOftCa2+Ji oscillations in HSY and HSG cells:role of Ca2+influx and internalCa2+Store recycling.J Membr Bioll81:185-193.)。
[0067]4)細(xì)胞硝酸鹽攝取實(shí)驗(yàn)
[0068]細(xì)胞外液硝酸鹽離子加載后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)硝酸鹽離子變化。硝酸鹽離子加載后O~25分鐘內(nèi)選擇不同時(shí)點(diǎn)去離子水裂解細(xì)胞，收集裂解液檢測(cè)裂解液中硝酸鹽離子濃度，以蛋白濃度校正。離子對(duì)高相液相色譜(ion-pair high-performance liquidchromatograhy, 1n-pair HPLC)法檢測(cè)硝酸鹽離子濃度。1n-pair HPLC方法如下:Water?高相液相色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相為17%有機(jī)相(乙腈)和83%的無(wú)機(jī)相(pH3.9磷酸鈉緩沖液，內(nèi)含3.0mM TBAOH)ο流速為0.4mL/min。205nm波長(zhǎng)檢測(cè)硝酸鹽陰離子。0-200 μ MNaNO3梯度稀釋，作為標(biāo)準(zhǔn)品，建立線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，Empower軟件分析。以待測(cè)樣品峰面積換算出樣品硝酸鹽含量。
[0069]2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0070]I) Western blot結(jié)果顯示:sh-sialin有效地抑制了 sialin在細(xì)胞膜表達(dá)，sialinL22AL23A顯著增加了 sialin在細(xì)胞膜表達(dá)(圖2)。
[0071]sialinL22AL23A具有和野生型sialin相同的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，而且特異性地在細(xì)胞膜表達(dá)(Wreden CC, Wlizla M, Reimer RJ(2005) Varied mechanisms underlie the freesialic acid storage disorders.J Biol Chem280:1408-1416)。
[0072]2)電生理檢測(cè)結(jié)果
[0073]Sialin基因抑制后細(xì)胞外液5mM硝酸鹽離子(N03_)、唾液酸離子(SA)或硝酸鹽離子+唾液酸離子(SA+N03_)加載后產(chǎn)生的膜電流較對(duì)照組顯著下降50%以上(圖3，P<0.01，n=5_10)
[0074]sialinL22AL23A轉(zhuǎn)染增加sialin細(xì)胞膜表達(dá)，細(xì)胞外液15mM硝酸鹽離子(N03_)、唾液酸離子(SA)加載后產(chǎn)生的膜電流較對(duì)照組顯著增加約I倍(P < 0.01，n=5-6)。
[0075]3)細(xì)胞硝酸鹽攝取實(shí)驗(yàn)
[0076]Sialin基因抑制后細(xì)胞外液15mM硝酸鹽離子(N03_)加載，pH7.2，10~25分鐘后細(xì)胞內(nèi)硝酸鹽水平顯著低于對(duì)照組，下降30%以上(圖4，*P < 0.05，林P < 0.01，n=5_6)，提示唾液腺細(xì)胞攝取硝酸鹽能力受到抑制。
[0077]實(shí)驗(yàn)例5Sialin基因突變與硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能研究實(shí)驗(yàn)
[0078]Sialin蛋白由495個(gè)氨基酸組成,擁有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),氨基端(N端)和羧基端(C端)位于細(xì)胞漿側(cè)。SLC17A5的突變會(huì)導(dǎo)致兩種主要的唾液酸儲(chǔ)存病:快速進(jìn)展型的嬰兒唾液酸儲(chǔ)存病(infantile sialic acid storage disease, ISSD)和進(jìn)展緩慢的成人型(Salla disease，SD)。sialinH183R 突變導(dǎo)致 ISSD，R39C 突變導(dǎo)致 SD。
[0079]1、實(shí)驗(yàn)材料和方法
[0080]基本方法同前。sialinH183R和 sialinR39C 質(zhì)粒由 William A.Gahl 和 ChangyuZheng (NIH, USA)提供。唾液酸儲(chǔ)存病患者成纖維細(xì)胞由William A.Gahl (NIH, USA)提供。
[0081]2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0082]I) Sialin基因突變與唾液腺細(xì)胞(HSG細(xì)胞)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能
[0083]ISSD和SD疾病突變體轉(zhuǎn)染，5mM硝酸鹽(N03_)、唾液酸離子(SA)加載后HSG細(xì)胞產(chǎn)生的膜電流較對(duì)照組顯著下降(#P < 0.01，n=5-15，圖5)。癥狀較輕的突變(SD，R39C)硝酸鹽(N03-)、唾液酸離子(SA)膜電流下降約50%;而癥狀較重的突變(ISSD，sialinH183R)硝酸鹽(N03_)、唾液酸離子(SA)膜電流下降約75%。提示唾液酸儲(chǔ)存病與機(jī)體硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。相關(guān)體內(nèi)試驗(yàn)見動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。[0084]2) Sialin基因突變與成纖維細(xì)胞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能
[0085]ISSD患者成纖維細(xì)胞150mM硝酸鹽(N03_)、唾液酸離子(SA)加載后細(xì)胞膜電流較正常成纖維細(xì)胞顯著下降約75% (#P < 0.01，n=4-8,圖6)。
[0086]正常成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染sialinH183R后得到了相似的結(jié)果，細(xì)胞膜電流較正常成纖維細(xì)胞顯著下降約75% (**P < 0.01，n=4-8，圖7)。 [0087]實(shí)驗(yàn)例7 Sialin基因突變與硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
[0088]1、實(shí)驗(yàn)材料和方法
[0089]I)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)
[0090]AdCMV-EGFP 腺病毒載體構(gòu)建參見文獻(xiàn)(Zheng C，Baum BJ(2005)Evaluation ofviral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands.Mol Therl2 (3):528-536.)。2*10nAdCMV-EGFP、50 μ gsialinH183R 質(zhì)粒(來(lái)源同前)與0.1M 聚乙烯亞胺(PEI，Sigma)混勻，總體積為 3ml。AdCMV-EGFP_sialinH183R-PEI 復(fù)合體經(jīng)腮腺導(dǎo)管口逆行導(dǎo)入小型豬(雄性，5月齡，體重25-30kg)腮腺中(Li J，et al.(2004)Developing a convenient large animal model for gene transfer to salivary glandsin viv0.J Gene Med6(I):55-63 ;Shan Z, et al.(2005)Increased fluid secretionafter adenoviral-mediated transfer of the human aquaporin-1cDNAto irradiatedminiature pig parotid glands.Mol Therll (3):444-451.)。對(duì)照為 pAC-luc 質(zhì)粒和野生型 sialin(WT-sialin)由 Changyu Zheng (NIH, USA)提供。
[0091]2)腮腺液硝酸鹽檢測(cè)
[0092]基因轉(zhuǎn)導(dǎo)三天后給予40mg/kg體重硝酸鉀喂食,0.5mg/kg毛果蕓香堿肌注后30分鐘及60分鐘收集腮腺液，方法參見文獻(xiàn)(Li J, et al.(2004)Developing aconvenient large animal model for gene transfer to salivary glands in viv0.J Gene Med6(I):55-63 ;Shan Z, et al.(2005)Increased fluid secretion afteradenoviral-mediated transfer of the human aquaporin-1cDNA to irradiatedminiature pig parotid glands.Mol Therll (3):444-451.)? R&D nitrate 試劑盒(R&D 公司)檢測(cè)腮腺液中硝酸鹽濃度。
[0093]3)免疫組化及Western blot檢測(cè)sialin在腿腺中的表達(dá)Sialin抗體購(gòu)自Abcam公司。
[0094]2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0095]硝酸鉀食物加載后30分鐘，sialinH183R轉(zhuǎn)染組腮腺液硝酸鹽濃度為152.50±49.29μΜ，顯著低于對(duì)照組 221.63±20.83 μ M (P < 0.05, η=8)。加載 60 分鐘后，sialinH183R轉(zhuǎn)染組腮腺液硝酸鹽濃度為204.09±83.12 μ M，顯著低于對(duì)照組305.31±78.83μΜ (P < 0.05，η=8)。免疫組化及 Western blot 驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效力，圖 8，C 為sialinH183R轉(zhuǎn)染腮腺，D為對(duì)照腮腺。
【權(quán)利要求】
1.SLC17A5基因在制備治療體內(nèi)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝障礙相關(guān)疾病、抗高血壓、抗休克、治療心肌梗死或預(yù)防胃潰瘍的藥物。
2.SLC17A5基因在制備診斷機(jī)體內(nèi)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝障礙或異常相關(guān)的疾病的試劑中的用途。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述SLC17A5基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1 所示。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述的與機(jī)體內(nèi)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝障礙或異常相關(guān)的疾病包括唾液腺功能低下、口腔或消化道感染。
5.按照權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于:所述的藥物為基因治療藥物。
6.SLC17A5基因所編碼蛋白在制備治療體內(nèi)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝障礙相關(guān)疾病、抗高血壓、抗休克、治療心肌梗死或預(yù)防胃潰瘍的藥物中的用途。
7.按照權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于:所述蛋白的氨基酸序列為SEQID N0.2所/Jn ο
8.按照權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于:所述的與機(jī)體內(nèi)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝障礙或異常相關(guān)疾病包括唾液腺功能低下、口腔或消化道感染。
9.一種治療或診斷與機(jī)體內(nèi)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝障礙相關(guān)的疾病的藥物或試劑，其特征在于，包括:SLC17A5基因和藥學(xué)上可接受的載體。
10.一種治療或診斷與機(jī)體內(nèi)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝障礙相關(guān)的疾病的藥物或試劑，其特征在于，包括:SLC17A5基因所編碼 蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號(hào)】A61P9/02GK103536932SQ201210237820
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月9日
【發(fā)明者】王松靈, 秦力錚, 劉細(xì)保, 鄧大君, 英杜·阿伯德卡 申請(qǐng)人:王松靈