專利名稱：：一種脂肪酶的固定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及脂肪酶的固定化方法，具體涉及一種將脂肪酶采用物理或化學(xué)的方法固定在不溶于水的載體上，形成一種可以重復(fù)使用的固定化脂肪酶的方法。
背景技術(shù)：
：隨著脂肪酶研究的深入和脂肪酶工程的發(fā)展，脂肪酶的應(yīng)用越來越廣泛。將脂肪酶用物理或化學(xué)的方法固定在不溶于水的載體上，形成一種可以重復(fù)使用的脂肪酶，叫固定化脂肪酶。固定化脂肪酶既保持了脂肪酶的催化特性，又克服了游離脂肪酶的不穩(wěn)定性，具有可反復(fù)或連續(xù)使用、易與反應(yīng)產(chǎn)物分離等顯著優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、輕工、食品等行業(yè)。固定化脂肪酶使工業(yè)用脂肪酶的穩(wěn)定性提高并延長了脂肪酶的使用壽命，因此脂肪酶的固定化受到了較為廣泛的關(guān)注。脂肪酶通常是被固定于不溶性的固體載體上，這有利于提高脂肪酶的熱穩(wěn)定性、使用穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而降低其使用成本。另一方面，固定化載體也是影響固定化脂肪酶性能的一個(gè)重要的因素。載體表面的微環(huán)境對(duì)固定化脂肪酶的活力和穩(wěn)定性有重要的影響，具有良好生物相容性和適度平衡親疏水性的載體能夠?yàn)橹久竸?chuàng)造適宜的微環(huán)境，減少非生物特異性的"脂肪酶一載體"相互作用，有效降低無機(jī)物及雜質(zhì)的吸附。因此，選取合適的載體和恰當(dāng)?shù)谋砻娓男苑椒@得尤為重要。選用不同的材料為載體、特別是在固體粉體材料上固定化脂肪酶已有大量的報(bào)道，但載體成本高又無法回收成為一個(gè)重要的制約。以膜狀物為載體有一定的報(bào)道，但這些膜，如靜電紡絲膜、中空纖維膜等，雖然功能性較強(qiáng)，但也普遍存在成本偏高，尚不能規(guī)模化生產(chǎn)等限制。近年來，隨著納米技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，也設(shè)計(jì)開發(fā)了不少微觀結(jié)構(gòu)規(guī)整的納米多孔材料，研究得較多的如二氧化硅、碳酸鈣、碳納米管、氧化鋁等。但這類無機(jī)材料本身生物相容性較差，固定化的過程易引起蛋白構(gòu)象的改變，在對(duì)其的修飾改性中又容易帶入新的影響脂肪酶構(gòu)象的因素，而脂肪酶這類生物大分子的活性往往是基于其特定的三維結(jié)構(gòu)，因此這類多孔納米材料也還有待進(jìn)一步改善。在固定化方法上，常見的吸附法操作簡單但作用力不強(qiáng)，吸附不牢固；共價(jià)法作用力強(qiáng)，但會(huì)導(dǎo)致脂肪酶部分位點(diǎn)的失活，造成脂肪酶活的降低；交聯(lián)涉及多步化學(xué)反應(yīng)使得成本高昂。雖然現(xiàn)有的固定化脂肪酶的方法很多，但由于均存在一定的缺點(diǎn)，有的載體成本偏高，有的脂肪酶與載體結(jié)合不牢固，有的方法復(fù)雜等等，因此很難找到一種理想的固定化脂肪酶的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種脂肪酶的固定化方法，該方法具有固定化脂肪酶活性高的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的脂肪酶的固定化方法是使用一種紡織物或者無紡布等薄膜狀材料為基布載體，通過織物整理劑對(duì)基布載體的表面改性形成疏水性的表面，將改性處理后的基布置于脂肪酶溶液或脂肪酶的漿狀物中浸泡，將基布干燥處理后實(shí)現(xiàn)脂肪酶的固定化。實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案如下1)按照織物整理劑與溶劑的體積比配制0.1-10°/。的織物整理劑溶液，按照織物整理劑溶液與基布的體積重量比(ml/g)為10:1-50:1量取織物整理劑i^液；2)將基布浸漬于步驟1)量取的織物整理劑溶液中，在25-5(TC處理O.1-2小時(shí)，將處理后的基布在40-70°C烘干；3)將步驟2)處理后的基布置于脂肪酶溶液或脂肪酶的漿狀物中3-10小時(shí)；4)將上述載有脂肪酶的基布于干燥后即得。其中，所述織物整理劑優(yōu)選有機(jī)硅類織物整理劑，如氨基硅油聚合物，可以來源于市售商品或自制劑方。其中，所述基布為紡織物或者無紡布或其它的薄膜材料，所述紡織物包括棉布或絲綢等，所述無紡布包括丙綸、氨綸、聚酯纖維、晴綸、滌綸或尼龍等。其中，步驟1)所述溶劑可以是有機(jī)溶劑或水，有機(jī)溶劑如正己烷。其中，步驟2)中基布在40-70°C烘干后，可再將基布在100-150°C烘l-2分鐘。其中，步驟3)所述脂肪酶包括脂肪酶粉、胞外產(chǎn)脂肪酶或細(xì)胞石皮壁后的發(fā)酵液。其中，步驟3)具體為將脂肪酶粉均勻分散溶于1-1000倍重量的水中，形成脂肪酶的漿狀物或脂肪酶溶液，將步驟2)處理后的基布置于脂肪酶的漿狀物或脂肪酶溶液中3-10小時(shí)。本發(fā)明以廉價(jià)的紡織物或者無紡布等薄膜狀材料為基布載體，借助織物整理劑對(duì)基布做改性處理后將脂肪酶固定。本發(fā)明中所用的脂肪酶的固定化方法有如下優(yōu)點(diǎn)1、固定化脂肪酶的活性高基布改性處理后形成的疏水性的表面有利于實(shí)現(xiàn)脂肪酶活性構(gòu)象的固定化，有效減少固定化過程中酶的失活現(xiàn)象，同時(shí)疏水表面也有利于小分子的疏水底物靠近酶的活性中心，從而提高反應(yīng)速率。2、固定化脂肪酶的穩(wěn)定性高基布改性處理后形成的疏水改性織物作載體，脂肪酶與載體間形成強(qiáng)烈的疏水相互作用，有利于穩(wěn)定酶的活性構(gòu)象，從而使固定化脂肪酶的穩(wěn)定性提高。另一方面，在脂肪酶催化的酯化反應(yīng)中，水作為產(chǎn)物之一，容易在載體上過多的累積，從而導(dǎo)致固定化脂肪酶活性和穩(wěn)定性的下降。而疏水改性織物能夠有效的降低水在載體上的積累，從而提高了固定化脂肪酶長期操作的穩(wěn)定性。3、基布的選擇范圍更大對(duì)于基布的選擇可以根據(jù)應(yīng)用的需要和反應(yīng)器的具體情況，選擇不同厚度、不同硬度等。4、處理方法簡單，條件要求溫和，易于實(shí)現(xiàn)。5、固定化脂肪酶形態(tài)多固定化脂肪酶可以膜狀、碎片狀、筒狀、條狀等形態(tài)出現(xiàn)，適應(yīng)于更廣泛形式的反應(yīng)器，減少壓降和擴(kuò)散阻力。圖1為本發(fā)明采用織物整理劑整理后載體與未整理載體固定化脂肪酶酯化穩(wěn)定性對(duì)比圖。圖2為本發(fā)明采用織物整理劑整理后載體與未整理載體固定化脂肪酶在高水含量下酯化率對(duì)比圖。具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的脂肪酶的固定化方法及其帶來的技術(shù)效果。本發(fā)明中所使用的原料或組分如無特別說明均可以通過商業(yè)途徑購得或按照常規(guī)方法制得。實(shí)施例1使用氨基硅油聚合物AS2-8040表面整理栽體制備固定化脂肪酶織物整理劑氨基硅油聚合物AS2-8040,道康寧(美國)公司。具體步驟如下1)稱取一定體積的氨基硅油聚合物溶解于正己烷中，配制成0.5%(v/v)濃度的溶液；2)按照絲綢質(zhì)量整理液體積=1:20(g/ml)的浴比將剪成小塊的織布浸泡于氨基硅油溶液中，35°C,120rpm振蕩lh,整理后的織物布在70。C下干燥30分鐘；3)改性后基布置于l(TC脂肪酶溶液中固定化3小時(shí)；4)固定化脂肪酶于陰涼通風(fēng)處晾干即可。實(shí)施例2使用M硅油微乳液C220A的表面整理載體制備固定化脂肪酶織物整理劑氨基硅油孩么乳液C220A，中國紡織科學(xué)院究院。具體步驟如下1)按照織物布質(zhì)量整理液體積=1:20(g/ml)的浴比將剪成小塊的織物布浸泡于去離子水稀釋后的微乳液中，微乳液C220A的用量為織物布質(zhì)量的5%;2)在35°C,120rpm條件下振蕩lh,整理后的織物布在70。C下干燥25分鐘，再在1Q(TC下烘1分鐘；3)改性后基布置于25。C脂肪酶溶液中固定化3小時(shí)；4)固定化脂肪酶冷凍干燥后即可。下面通過對(duì)比來說明本發(fā)明較常規(guī)方法的優(yōu)勢(shì)與改進(jìn)。比較例1織物整理劑整理后載體與未整理載體固定化脂肪酶催化水解比較具體方法如下1)織物整理劑改性處理后的基布載體制備參照實(shí)施例l,將未整理和用氨基硅油聚合物AS2-8040整理后的3cmx3cm大小的絲綢各一塊，浸沒至5ml10mg/mL脂肪酶(7000U/g)溶液中，在10。C固定化3h;固定化脂肪酶于陰涼通風(fēng)處晾干；2)以35。CIO分鐘水解橄欖油-聚乙烯醇乳化液的方法確定固定化脂肪酶酶活。酶活定義為測(cè)定條件下每分鐘產(chǎn)生lpmol脂肪酸的所需脂肪酶量，即為l個(gè)脂肪酶酶活單位，以U表示。固定化脂肪酶酶活回收率定義為固定化脂肪酶的表觀活力/(固定化脂肪酶溶液中活力_固定化后殘余脂肪酶溶液總活力)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表l，其中直接吸附是指載體未經(jīng)織物整理劑氨基硅油整理，直接在脂肪酶溶液中浸沒用來固定化脂肪酶；氨基硅油改性是指釆用本發(fā)明實(shí)施例1的方法得到的固定化脂肪酶。說明載體經(jīng)織物整理劑改性處理后，載體表面疏水性增強(qiáng)，脂肪酶活力和酶活回收率明顯提高。表l本發(fā)明氨基硅油改性法與直接吸附法的固定化脂肪酶活力比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>比較例2織物整理劑整理后載體與未整理載體固定化脂肪酶催化酯化比較具體方法如下1)織物整理劑改性處理后的基布載體制備參照實(shí)施例2，將未整理和用整理劑C220A整理后的3cmx3cm大小的絲綢各一塊，浸沒至5mL10mg/mL脂肪酶(7000U/g)溶液中，在10。C固定化3h,冷凍干燥固定化脂肪酶；2)每3cmx3cm大小的固定化脂肪酶催化5mL摩爾濃度為均為500mM/L的十二酸和十二醇的正己烷溶液，4(TC下反應(yīng)。每次反應(yīng)殘余物用50mM/L的NaOH溶液滴定剩余的脂肪g吏含量；實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2，說明載體經(jīng)織物整理劑改性處理后，載體表面疏水性增強(qiáng)，酯化活力明顯提高。表2織物整理劑整理后載體與未整理載體固定化脂肪酶催化酯化比較靜態(tài)水接觸角蛋白負(fù)載量(P酯化活力(xlO一2整理劑(。)g/cm2)jimol/min/cm2)未整理<9056.96.0C220A整理12353.624.1體固定化脂肪酶在不同有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性比較具體方法如下1)織物整理劑改性處理后的基布載體制備參照實(shí)施例1,將未整理或用氨基硅油聚合物AS2-8040整理后的3cmx3cm大小的絲綢各一塊，浸沒至5mL10mg/mL脂肪酶(7000U/g)溶液中，在l(TC固定化3h,固定化脂肪酶于陰涼通風(fēng)處晾干；2)將一定量的固定化脂肪酶分別在正己烷、曱苯、三氯曱烷、丙酮、異丙醇和N,N-二曱基曱酰胺(DMF)等不同極性的有機(jī)溶劑中于15。C浸泡24h,取出后按比較例1中方法測(cè)定其水解酶活；3)以未在有機(jī)溶劑中浸泡的固定化脂肪酶的酶活為100%，計(jì)算其它固定化脂肪酶的相對(duì)酶活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。可見，疏水整理后的載體固定化脂肪酶對(duì)于不同有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性均高于未經(jīng)整理的載體固定化脂肪酶，該結(jié)果進(jìn)一步證明了疏水界面活化對(duì)固定化脂肪酶的改善作用，整理改性后的載體表面有利于穩(wěn)定脂肪酶的活性構(gòu)象，從而使其穩(wěn)定性獲得^提高。表3織物整理劑整理后載體與未整理載體固定化脂肪酶在不同有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性比較_相對(duì)活性(％)_有機(jī)溶劑LogP未整理織物固定整理后織物固定_化脂肪酶_化脂肪酶對(duì)照——100100正己烷3.5397.3100甲苯2.5078.492.3三氯曱烷1.9759.568.3異丙醇0.2849.357.3丙酮-O.2341.947.1DMF-l.01.41.9注LogP為有機(jī)溶劑在水和正辛烷中的分配系數(shù)。比較例4織物整理劑整理后載體與未整理載體固定化脂肪酶在高水含量下酯化率比較具體方法如下1)織物整理劑改性處理后的基布載體制備參照實(shí)施例l,將未整理和用氨基硅油聚合物AS2-8040整理后的3cmx3cm大小的絲綢各一塊，浸沒至5mL10mg/mL脂肪酶(7000U/g)溶液中，在10。C固定化3h,固定化脂肪酶于陰涼通風(fēng)處晾干；2)每3cmx3cm大小的固定化脂肪酶催化5mL摩爾濃度均為500mM/L的十二酸和十二醇的正己烷溶液，按照體積百分比分別向反應(yīng)體系加入0-15%的去離子水。40。C下反應(yīng)4h。加入20mL無水乙醇結(jié)束反應(yīng)，用50mM/L的NaOH溶液滴定剩余的脂肪酸含量。固定化脂肪酶的酯化轉(zhuǎn)化率的確定同前。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖l。從圖l可見，在相同的體系含水量下，疏水改性整理后的載體固定化脂肪酶酯化轉(zhuǎn)化率(esterification)高于未改性整理的，且這種優(yōu)勢(shì)隨著體系含水量的增大，越加明顯。充分說明整理改性的織物能夠避免水在載體表面過多的積累，從而為脂肪酶提供一個(gè)良好的微環(huán)境，使固定化脂肪酶保持高活性。比較例5織物整理劑整理后載體與未整理載體固定化脂肪酶酯化穩(wěn)定性比較具體方法如下1)織物整理劑改性處理后的基布載體制備參照實(shí)施例l，將未整理或用氨基硅油聚合物AS2-8040整理后的3cmx3cm大小的絲綢各一塊，浸沒至5mL10mg/mL脂肪酶(7000U/g)溶液中，在10。C固定化3h;固定化脂肪酶于陰涼通風(fēng)處晾干；2)每3cmx3cm大小的固定化脂肪酶催化5mL摩爾濃度為均為500mM/L的十二酸和十二醇的正己烷溶液，4(TC下反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后將固定化脂肪酶投入新鮮的底物溶液中繼續(xù)下一批反應(yīng)。每次反應(yīng)殘余物用50mM/L的NaOH溶液滴定剩余的脂肪酸含量。固定化脂肪酶的酯化轉(zhuǎn)化率(conversion)定義為測(cè)定條件下，已轉(zhuǎn)化了的脂肪酸摩爾量占初始反應(yīng)脂肪酸摩爾量的百分比；實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。從圖2可見，疏水改性織物作載體，顯著提高了固定化脂肪酶長期操作的穩(wěn)定性。以上實(shí)施例只是用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，而不是用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡是在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)所做出的具體實(shí)施方式及應(yīng)用范圍上的些許變動(dòng)，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求1、一種脂肪酶的固定化方法，其特征在于包括如下步驟1)按照織物整理劑與溶劑的體積比配制0.1-10％的織物整理劑溶液，按照織物整理劑溶液與基布的體積重量比(ml/g)為10∶1-50∶1量取織物整理劑溶液；2)將基布浸漬于步驟1)量取的織物整理劑溶液中，在25-50℃處理0.1-2小時(shí)，將處理后的基布在40-70℃烘干；3)將步驟2)處理后的基布置于脂肪酶溶液或脂肪酶的漿狀物中3-10小時(shí)；4)將上述載有脂肪酶的基布干燥后即得。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述織物整理劑為有機(jī)硅類織物整理劑。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述有機(jī)硅類織物整理劑主要有效成分為氨基硅油聚合物。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述基布為紡織物或者無紡布。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述紡織物包括棉布或絲綢。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述無紡布包括丙綸、氨綸、聚酯纖維、晴綸、滌綸或尼龍。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步驟1)所述溶劑可以是有機(jī)溶劑或水。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑是正己烷。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步驟2)中所述基布在40-7(TC烘干后，將基布在100-150°C烘1_2分鐘。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步驟3)所述脂肪酶包括脂肪酶粉、胞外產(chǎn)脂肪酶或細(xì)胞破壁后的發(fā)酵液。全文摘要本發(fā)明涉及一種脂肪酶的固定化方法，使用紡織物或者無紡布等薄膜狀材料為基布載體，通過織物整理劑對(duì)基布載體的表面做改性處理形成疏水性的表面，將改性處理后的基布置于酶溶液或酶的漿狀物中浸泡，將基布干燥處理后實(shí)現(xiàn)酶的固定化。基布改性處理后形成的疏水性的表面有利于實(shí)現(xiàn)脂肪酶活性構(gòu)象的固定化，有效減少固定化過程中酶的失活現(xiàn)象，本發(fā)明具有固定化脂肪酶活性高、固定化脂肪酶穩(wěn)定性高、基布的選擇范圍更大、操作簡便、條件要求溫和及易于實(shí)現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)C12N11/02GK101613691SQ20081011573公開日2009年12月30日申請(qǐng)日期2008年6月27日優(yōu)先權(quán)日2008年6月27日發(fā)明者程媛媛,譚天偉,陳必強(qiáng)申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)