專利名稱：：利用牛體細(xì)胞核移植克隆胚胎的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物繁殖
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種利用利用牛體細(xì)胞核移植克隆胚胎的方法。
背景技術(shù)：
：體細(xì)胞核移植在20世紀(jì)末期出現(xiàn)了突破性進(jìn)展，自從多莉羊誕生之后，越來(lái)越多的體細(xì)胞克隆動(dòng)物降生，體細(xì)胞核移植的重耍意義逐步得到人們的認(rèn)可。但是該技術(shù)構(gòu)建的重構(gòu)胚的發(fā)育率低，而在制作重構(gòu)胚的技術(shù)中，供核細(xì)胞的前處理以及顯微注核去核操作是關(guān)鍵的限制步驟。目前人們對(duì)供核細(xì)胞的前處理主要有血清饑餓法(Campbelletal.,1996)和接觸抑制法(Kasinathanetal.,2001),以期達(dá)到細(xì)胞同期化的目的。還有人認(rèn)為傳代次數(shù)(.干.玉閣等，1999)對(duì)核移植的效果也有影響。此外還有一些其它特殊處理(Sullivanetal.，2004)的報(bào)道。但是各種方法是否有顯著的效果尚無(wú)定論。在卵母細(xì)胞的去核方法上，目前的主流方法是盲吸法，盲吸法以第一極體為參照進(jìn)行去核，乂包括吸引除核法(McGrathJetal.Science,1983,220:1300)和擠壓除核法(Shigaetal.,1999)兩種方法。去核方法還有(干.振飛等，2006)和手工克隆法(Peuraetal.，1998)。這三種方法各有利弊，盲吸法沒(méi)有對(duì)卵母細(xì)胞的化學(xué)性損傷，但是第一極體勾核的位置隨著卵母細(xì)胞的成熟會(huì)發(fā)生偏移，閃此i核率不太高，卵母細(xì)胞胞質(zhì)損火較多。去透明帶核移植法操作較為繁瑣，而且其實(shí)驗(yàn)步驟中也有染色及紫外照射的過(guò)程，同樣會(huì)對(duì)細(xì)胞有傷害。在構(gòu)建克隆胚哪種方法最佳上至今無(wú)統(tǒng)一觀點(diǎn)。在重構(gòu)胚的構(gòu)建上主耍有電融合法(Wilmutetal.,1997)和胞質(zhì)內(nèi)注射法(Wakay咖aetal.，1998)兩種。"多莉"就是使用電融合法構(gòu)建的。然而，上述方法所面臨著共同的難題是效率低下、過(guò)程繁瑣。顯微鏡下的操作環(huán)境是不利T細(xì)胞生存的，操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能對(duì)胚胎發(fā)育有害。由于顯微操作對(duì)儀器設(shè)備要求高并且技術(shù)性強(qiáng)，閃此操作人員的熟練程度也是一個(gè)制約因素，培養(yǎng)一名熟練的實(shí)驗(yàn)人員也需要很長(zhǎng)的時(shí)間，所以當(dāng)前亟待解決的一個(gè)難題就是發(fā)明一種簡(jiǎn)單、高效的核移植方法，以利丁-核移植技術(shù)在更廣范圍的推廣與應(yīng)用。胞質(zhì)內(nèi)直接注射法是由精子胞質(zhì)內(nèi)直接注射法(ICSI:intracytopasmicsper邁injection)發(fā)展而來(lái)(CollasandBarnes,1994)。胞質(zhì)內(nèi)注射的關(guān)鍵是注核以前的破膜處理以使供體細(xì)胞的質(zhì)膜破裂。直接注核法主要分為兩種方式Piezo驅(qū)動(dòng)裝置輔助的S接注核和恃通顯微操作系統(tǒng)輔助的直接注核(Wolfetal.,1998:Fulkaetal.,1998;Heymanetal.，1998;Campbelletal.，2007)。胞質(zhì)內(nèi)直接注射法是將供體破膜后,借助Piezo驅(qū)動(dòng)注射裝置將核胞體直接注入到受體胞質(zhì)中，研究人員采用此種方法以成功獲得克隆小鼠(Wakayamaetal.,1998)、克隆豬。后者則不需要該裝置，用普通的顯微操作系統(tǒng)即可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的胞質(zhì)內(nèi)H接注射。為了進(jìn)一步簡(jiǎn)化核移植操作過(guò)程,一些研究人員嘗試?yán)梦催M(jìn)行破膜處理的供體細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞直接注射核移植，從而避開(kāi)了核的分離和電融合的過(guò)程，該種方法也成功獲得克隆亞洲黃羊后代(Leeetal.,2005:Chenetal.，2007;Zhouetal.，2000)。胞質(zhì)內(nèi)全細(xì)胞直接注射法大大簡(jiǎn)化了核移植操作流程，降低了對(duì)SCNT對(duì)操作人員和試驗(yàn)設(shè)備的耍求為該技術(shù)的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。有關(guān)胞質(zhì)內(nèi)注射法硏究的進(jìn)展情況見(jiàn)表1。表1體細(xì)胞克隆發(fā)展過(guò)程中重大里程碑<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>迄今為止，尚未見(jiàn)有關(guān)利用不經(jīng)血清饑餓和破膜處理的供體細(xì)胞做供體，采用全細(xì)胞直接注射法生產(chǎn)?？寺∨咛サ难芯俊?br/>發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，利用利用牛卵母細(xì)胞去核，利用核移植方法獲得牛胚胎克隆的方法。本發(fā)明在供體細(xì)胞培養(yǎng)方面盡量簡(jiǎn)化不必耍的步驟，在去核操作中改進(jìn)了現(xiàn)有的盲吸法去核，采用全細(xì)胞直接注射法成功的獲得了?？寺∧遗?。本發(fā)明經(jīng)過(guò)火量重復(fù)試驗(yàn)己經(jīng)證明了該方法簡(jiǎn)便、快速、有效和和穩(wěn)定，能夠獲得比較理想的囊胚率，對(duì)于其他哺乳動(dòng)物的核移植有一定參考和借鑒意義。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一種獲得?？寺∨咛サ姆椒?，其步驟包括1)取牛卵母細(xì)胞在成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)；2)將牛供體細(xì)胞注入受體卵母細(xì)胞中，獲得重構(gòu)卵母細(xì)胞；3)將步驟2)的重構(gòu)卵母細(xì)胞激活，獲得重構(gòu)胚，本發(fā)明的特征在于，將取出的牛卵母細(xì)胞在改良的成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)22h,培養(yǎng)溫度391C,使所述的牛卵母細(xì)胞處于第二次減數(shù)分裂中期，去除成熟卵母細(xì)胞的細(xì)胞核，獲得牛受體細(xì)胞，采用全細(xì)胞直接注射法(Chenetal.,2007)將牛供體細(xì)胞注入所述的牛受體細(xì)胞中，獲得牛重構(gòu)胚，將所述牛重構(gòu)胚置于改良的成熟培養(yǎng)液的微滴中培養(yǎng)3-4h，然后將所述的牛胚胎暴露于激活劑l中激活5min，然后轉(zhuǎn)移到激活劑2中激活3-4h，將激活的牛重構(gòu)胚在胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天(在牛重構(gòu)胚培養(yǎng)第一天不添加胎牛血清，從體外培養(yǎng)的第二天開(kāi)始添加10%體積的胎牛血淸，以達(dá)到提高牛重構(gòu)胚發(fā)育潛能的效果)。本發(fā)明采用的培養(yǎng)液或培養(yǎng)基組成成分及配比如下輯酸緩沖液(DPBS):氯化鈉8.0g/L+氯化鉀0.2g/L+磷酸氫鈉1.15g/L+磷酸二氨鉀0.2g/L吸卵液肝素10ug/mL、3mg/mLBSA+丙酮酸鈉2.2mg/100mL+青霉素100IU/mL+鏈霉素100IU/mL+磷酸緩沖液(D-PBS),4"保存卞個(gè)月改良的成熟培養(yǎng)液配比如下以TCM-199商品培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基，購(gòu)G美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，貨號(hào)12340)為基本培養(yǎng)基，附加胎牛血清10%,乙基哌嗪乙磺酸25mmo1，閃酮酸鈉0.55mg/mL,青霉素100IU/mL，鏈毒素100IU/mL,促卵泡素0.1IU/mL、促黃體素0.1IU/mL、雌激素lug/mL、表皮生長(zhǎng)因于100ng/mL，pH7.0-7.2;激活培養(yǎng)基-1配比如下基礎(chǔ)液為改良的成熟培養(yǎng)液+離子霉素(Ionopbore,購(gòu)CI美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)19657)5,1/L,pH7.0-7.2;激活培養(yǎng)基-2配比如下基礎(chǔ)液為改良的成熟培養(yǎng)液+二甲基氨基嘌呤(6-DMAP,購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)P2629)2咖ol/L，pH7.0-7.2;胚胎培養(yǎng)液基配比如下氯化鈉107.63mmol/L+氯化鉀7.16mmol/L+磷酸二氫鉀1.19i咖ol/L+硫酸鎂1.51,ol/L+青毒素鈉0.012g/L+硫酸鏈霉素50wg/L+乳酸鈉5.35mmol/L+碳酸氫鈉25.00mmol/L+丙酮酸鈉7,27咖ol/L+氯化鈣1.78咖ol/L+肌醇2.77mmol/L+酚紅10.0ug/mL+枸杞酸鈉0.34咖ol/L+必需氨基酸30.0u1/ml+非必霜氨基酸10u1/mL+L-谷氨酰胺0.20mmol/L+BSA3mg/mL，pH7.0-7.2。卵母細(xì)胞去核液基礎(chǔ)液為成熟培養(yǎng)液，添加5ng/mL細(xì)胞松弛素B(CytochalsinB,購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)C6762)+10%聚乙烯吡咯烷酮(重量/體積)卵母細(xì)胞注核液注核液的基礎(chǔ)液為成熟培養(yǎng)液，然后在基礎(chǔ)液中添加l(m聚乙烯吡咯烷酮(重量/體積)。作為本發(fā)明的關(guān)鍵操作步驟，下列的技術(shù)特征是重要的上述步驟中所述的牛供體細(xì)胞不經(jīng)過(guò)血清饑餓和體外培養(yǎng)。所述的供體細(xì)胞是牛卵丘細(xì)胞，該牛供體細(xì)胞可以是顆粒細(xì)胞。該牛供體細(xì)胞可以不經(jīng)破膜處理。其中所述的牛重構(gòu)胚的培養(yǎng)采用卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)。所述的牛卵丘細(xì)胞單層與受體卵母細(xì)胞同源。所述的牛重構(gòu)胚的培養(yǎng)采用牛卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)。本發(fā)明的有益效果是1、本發(fā)明在供體細(xì)胞處理方面作了大膽的嘗試，對(duì)核移植的供體細(xì)胞未做任何處理，直接采用從牛卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體上脫下的卵丘細(xì)胞，省i了血淸饑餓和細(xì)胞膜的破碎過(guò)程，從而簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟，降低了對(duì)操作人員的試驗(yàn)操作技能的耍求，節(jié)省了試驗(yàn)時(shí)間，降低了細(xì)胞被污染的兒率，有益于牛重構(gòu)胚的后續(xù)發(fā)育。2、本發(fā)明在去核注核方面運(yùn)用了改進(jìn)的去核方法即以去核針尖刺破透明帶，然后在刺破口旁以針尖擠壓透明帶依靠透明帶內(nèi)的正壓將卵母細(xì)胞核擠出，減少了丟失卵胞質(zhì)的量，同時(shí)減少了對(duì)卵母細(xì)胞的損傷，從而有利于重構(gòu)胚的后續(xù)發(fā)育。更詳細(xì)的技術(shù)方案見(jiàn)《具體實(shí)施方式》。圖l:是培養(yǎng)前的牛卵母細(xì)胞(光學(xué)顯微鏡，100x);圖2:是培養(yǎng)成熟的牛卵母細(xì)胞(光學(xué)顯微鏡，200x);圖3:是脫除卵丘細(xì)胞的牛卵母細(xì)胞(150X);圖4:是經(jīng)Hoechst染色的成熟牛卵母細(xì)胞(400x);圖5:是以卵丘細(xì)胞為供體構(gòu)建的4-細(xì)胞期?？寺∨咛?400x);圖6:發(fā)育至16-32-cell細(xì)胞期牛重構(gòu)胚(400x);圖7:是擴(kuò)張的牛重構(gòu)胚(300X);圖8:是孵化中的牛重構(gòu)胚(400x)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l1、采樣將從湖北省武漢市紅旗肉牛居宰場(chǎng)采集的健康黃牛卵巢保存于39"C的DPBS，配方見(jiàn)《
發(fā)明內(nèi)容》，3小時(shí)內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室2、牛卵母細(xì)胞收集與培養(yǎng)用吸有少量吸卵液的，配方見(jiàn)《
發(fā)明內(nèi)容》，注射器(18號(hào)針頭)從牛卵巢表面3-8mm卵泡中吸取牛卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs),將該COCs經(jīng)DPBS洗滌3遍后，用成熟培養(yǎng)液(配方如上所述)洗潘3遍，轉(zhuǎn)入100ul成熟培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)22h(培養(yǎng)條件是39X:、相對(duì)濕度為1009i，5%(^培養(yǎng)箱)；3、牛卵母細(xì)胞的成熟度判定將在成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)了22h的牛卵母細(xì)胞在0.1%透明質(zhì)酸酵中經(jīng)反復(fù)吹打3min以脫凈外圍卵丘細(xì)胞。然后將胞質(zhì)均勻，形狀規(guī)則，脂滴含量豐富并且排除第一極體的牛卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有10ug/mL細(xì)胞松弛素B(Cytochalasin)的50ul的去核微滴或去核液(配制方法是在上述的改良的成熟培養(yǎng)液中添加10ug/mL細(xì)胞松弛素B)中。用石蠟油覆蓋該微滴，置于39'C,相對(duì)濕度為100%,5%002的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。在直徑為60咖的培養(yǎng)皿蓋中制作去核和注核微滴；4、供體細(xì)胞的準(zhǔn)備從來(lái)自于一頭遺傳背景確定的優(yōu)良雌性黃牛卵巢中抽取牛卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)單獨(dú)進(jìn)行成熟培養(yǎng)。在培養(yǎng)22h后用0.1%透明質(zhì)酸酶在培養(yǎng)微滴中用自制吸管(willi柳，2006)輕輕吹打，脫下牛卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體外圍卵丘細(xì)胞，然后，吸取10ul上述成熟培養(yǎng)液在90ul的去核液中，配方見(jiàn)《
發(fā)明內(nèi)容》，充分混勻，經(jīng)3次10倍稀釋后，吸取10ul含卵丘細(xì)胞的細(xì)胞懸液加入50ul的去核微滴，配方見(jiàn)《
發(fā)明內(nèi)容》，中；5、將步驟3中獲得成熟的牛卵母細(xì)胞去核使成熟的牛卵母細(xì)胞第一極體位于類似于鐘表盤的3點(diǎn)方向，固定針位于牛卵母細(xì)胞笫一極體正對(duì)面，用去核針的針尖輕輕刺破透明帶，然后用針尖在刺破點(diǎn)旁邊輕輕擠壓透明帶,使牛卵母細(xì)胞的細(xì)胞核連同紡錘體被擠到透明帶外；在熒光顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞有無(wú)熒光特征，如無(wú)藍(lán)色炎光者為去核成功。最后將成功去核的牛卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到注核微滴中，配方《
發(fā)明內(nèi)容》，培養(yǎng)10min。6、牛重構(gòu)胚的構(gòu)建先將步驟3獲得的牛卵丘細(xì)胞加入注核微滴做供體，再用注核針吸如一個(gè)細(xì)胞膜完整、形態(tài)正常的細(xì)胞作為供體，然后用尚定針問(wèn)定該牛卵母細(xì)胞，找到第一極體并使其位于類似于鐘表盤的3點(diǎn)方向。用注核針沿極體方向刺入牛卵母細(xì)胞，并將刺口適量擴(kuò)大。抽出注核針在刺口上下—擠壓卵母細(xì)胞，以便將極體和細(xì)胞核一并擠山。如擠山物質(zhì)收縮成緊湊的團(tuán)，可判斷為去核成功。擠出細(xì)胞核后馬上將供體細(xì)胞沿上述刺破口注入卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，然后將構(gòu)建的重組胚胎轉(zhuǎn)移到微滴的一邊并釋放，重復(fù)以上步驟直到所有卵母細(xì)胞的顯微操作完成為止。7、將步驟6所得的重構(gòu)胚轉(zhuǎn)到改良的成熟培養(yǎng)液的微滴中培養(yǎng)(使其休整)3-4h。8、將步驟7所得的細(xì)胞膜完整的重構(gòu)胚轉(zhuǎn)移到激活培養(yǎng)基-l中激活5min，然后轉(zhuǎn)移到激活培養(yǎng)基-2中3-4h,激活完成后轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)，每大換液一次，觀察記錄發(fā)育情況。表3不同類型牛供體細(xì)胞對(duì)SCNT牛重構(gòu)胚發(fā)育潛能的影響細(xì)胞類荊重復(fù)次數(shù)卵裂率(％)囊胚率(％)雜胚率i囊胚率n新鮮牛卵丘細(xì)胞438.18±6.02(63/165)原代牛卵丘細(xì)胞341.35±3.71(53/128)第3代牛顆粒細(xì)胞439.86±6.07(57/143)38.10±5.65(24/63)15.46±3.69(19/165)39.62±4.62(21/53)16,41±4.23(21/128)40.35±6.54(23/57)16.08±5.89(23/143)注同列不同上標(biāo)者差異顯著(P〈0.05);囊胚率I:囊胚數(shù)/卵裂胚胎數(shù)；囊胚率II:囊胚數(shù)/成熟卵母細(xì)胞數(shù)表4不同處理的牛供體細(xì)胞對(duì)SCNT牛重構(gòu)胚發(fā)育潛能的影響不同處理的細(xì)胞重復(fù)次數(shù)卵裂率(％)囊胚率(％)囊胚率I囊胚率II饑餓3d原代卵丘441.97±2.16(61/147)匯合3d原代卵丘541.35±3.71(67/162)匯合4d原代卵丘439.69±6.07(52/131)31,15±5.65(19/61)12.93±5.69(19/147)32.83±7.68(22/67)13.58±4.23(22/162)34.61±5.47(18/52)13,74±5.47(18/131)注同列不同上標(biāo)者差異顯著(P〈0.05);囊胚率I:囊胚數(shù)/爽i裂胚胎數(shù)本表中卵丘(即細(xì)胞)為牛卵丘細(xì)胞。囊胚率n:囊胚數(shù)/成熟卵母細(xì)胞數(shù)參考文獻(xiàn)1-CollasP，BarnesFLNucleartransplantationbymicroinjectionofinnercellmassandgranulosacellnuclei,iftx)印rorfZtev;1994，38:264—2672.WolfE，ZakhartchenkoV，BremG.Nucleartransferinmammals:recentdevelopmentsandfutureperspectives,/5/otec/"o_/，1998，65:99-1103-Fulka丄Jr.，F(xiàn)irstNL，LoiP，MoorRM.Cloningbysomaticcellnucleartransfer.5ioes幼7S1998,20:847-8514.HeymanY，VignonX,ChesneP,LeBourhisD,MarchalJ,RenardJP.Cloningincattle:fromembryosplittingtosomaticnucleartransfer,y印ro0^Ai/trZter，1998,38:595-6035.CampbellKH,FisherP,ChenWC，ChoiI，KellyRD，LeeJH,XhuJ.Somaticcellnucleartransfer:Past,presentandfutureperspectives.7Serio卵加Jo57'2007，68Su卯l1:S214-2316.WakayamaT，PerryAC，ZuccottiM,JohnsonKR，YanagimachiR.Full—termdevelopmentofmicefromenucleatedoocytesinjectedwithcumuluscellnuclei,他fure,1998,394:369-3747.LeeBC，KimMK,JangG,0hHJ,YudaF，KiraHJ，HosseinMS,KimJJ,KangSK，SchattenG，HwangWS.Dogsclonedfromadultsomaticcells.Afefure,2005,436:6418.ChenDY,J"iangMX,ZhaoZJ,WangHL,SunQY,ZhangLS，LiRC,CaoHH，ZhangQJ，MaDLCloningofAsianyellowgoat(C.hircus)bysomaticcellnucleartransfer:telophaseenucleationcombinedwithwholecellintracytoplasmicinjection,ifoi/e/rc/Zfev;2007，74:28-349國(guó)ZhouQ，BoulangerL，RenardJP.Asimplifiedmethodforthereconstructionoffullycompetentmousezygotesfromadultsomaticdonornuclei.C7。77i恥2000，2:35-44。權(quán)利要求1、一種獲得牛克隆胚胎的方法，其步驟包括1)取牛卵母細(xì)胞在成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)；2)將牛供體細(xì)胞注入受體卵母細(xì)胞中，獲得重構(gòu)卵母細(xì)胞；3)將步驟2)的重構(gòu)卵母細(xì)胞激活，獲得重構(gòu)胚，其特征在于，將取出的牛卵母細(xì)胞在改良的成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)22h，培養(yǎng)溫度39℃，使所述的牛卵母細(xì)胞處于第二次減數(shù)分裂中期，去除成熟卵母細(xì)胞的細(xì)胞核，獲得牛受體細(xì)胞，采用全細(xì)胞直接注射法將牛供體細(xì)胞注入所述的牛受體細(xì)胞中，獲得牛重構(gòu)胚，將所述牛重構(gòu)胚置于改良的成熟培養(yǎng)液的微滴中培養(yǎng)3-4h，然后將所述的牛胚胎暴露于激活培養(yǎng)基-1中激活5min，然后轉(zhuǎn)移到激活培養(yǎng)基-2中激活3-4h，將激活的牛重構(gòu)胚在胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天，其中改良的成熟培養(yǎng)液配比如下以TCM-199商品液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加胎牛血清10％，乙基哌嗪乙磺酸25mM，丙酮酸鈉0.55mg/mL，青霉素100IU/mL，鏈霉素100IU/mL，促卵泡素0.1IU/mL、促黃體素0.1IU/mL、雌激素1ug/mL、表皮生長(zhǎng)因子100ng/mL，pH7.0-7.2；激活培養(yǎng)基-1配比如下基礎(chǔ)液為改良的成熟培養(yǎng)液+離子霉素5μmol/L，pH7.0-7.2；激活培養(yǎng)基-2配比如下基礎(chǔ)液為改良的成熟培養(yǎng)液+二甲基氨基嘌呤2mmol/L，pH7.0-7.2；胚胎培養(yǎng)液配比如下氯化鈉107.63mmol/L+氯化鉀7.16mmol/L+磷酸二氫鉀1.19mmol/L+硫酸鎂1.51mmol/L+青霉素鈉0.012g/L+硫酸鏈霉素50μg/L+乳酸鈉5.35mmol/L+碳酸氫鈉25.00mmol/L+丙酮酸鈉7.27mmol/L+氯化鈣1.78mmol/L+肌醇2.77mmol/L+酚紅10.0μg/mL+枸杞酸鈉0.34mmol/L+必需氨基酸30.0μl/ml+非必需氨基酸10μl/mL+L-谷氨酰胺0.20mmol/L+BSA3mg/mL，pH7.0-7.2。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的牛供體細(xì)胞不經(jīng)過(guò)血淸饑餓和體外培養(yǎng)。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的牛供體細(xì)胞是牛卵丘細(xì)胞。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的牛供體細(xì)胞是牛顆粒細(xì)胞。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的牛供體細(xì)胞不經(jīng)破膜處理。6、根據(jù)權(quán)利耍求l所述的方法，其特征是牛重構(gòu)胚的培養(yǎng)采用牛卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)。7、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的牛卵丘細(xì)胞單層與受體牛卵母細(xì)胞同源。8、根據(jù)權(quán)利耍求l所述的方法，其特征在于，在牛重構(gòu)胚培養(yǎng)第一犬不添加胎牛血清，從體外培養(yǎng)的第二天開(kāi)始添加10%體積的胎牛血清。全文摘要本發(fā)明屬于哺乳動(dòng)物繁殖
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種利用牛體細(xì)胞獲得克隆胚胎的方法。公開(kāi)了一種簡(jiǎn)單高效生產(chǎn)牛克隆胚胎的方法。根據(jù)豬體細(xì)胞膜在注入卵胞質(zhì)內(nèi)會(huì)在30min后自動(dòng)溶解消失的研究成果，在牛中提出采用不破膜的全細(xì)胞為供體進(jìn)行全細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)直接注射構(gòu)建?？寺∨咛?；從而簡(jiǎn)化了體細(xì)胞核移植的操作流程。發(fā)明特征是(1)牛卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體的采集與培養(yǎng)；(2)卵母細(xì)胞的去核；(3)供體細(xì)胞的制備；(4)共培養(yǎng)細(xì)胞單層的制備；(5)重構(gòu)胚的構(gòu)建；(6)重構(gòu)胚的激活；(7)重構(gòu)胚的培養(yǎng)等。本發(fā)明最大的特點(diǎn)是易于操作、步驟簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定，為牛體細(xì)胞核移植技術(shù)的推廣以及進(jìn)一步研究提供了一種新的思路和方法。文檔編號(hào)C12N5/10GK101302497SQ20081011582公開(kāi)日2008年11月12日申請(qǐng)日期2008年6月27日優(yōu)先權(quán)日2008年6月27日發(fā)明者于孟飛,易建明,楊利國(guó),高國(guó)龍申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)