專利名稱：中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列、構(gòu)建方法及其氨基酸序列和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中國(guó)林蛙功能序列及其編碼的蛋白序列，具體地說(shuō)是一種中 國(guó)林蛙lectin樣抗腫瘤功能基因Rdr-lec序列及其編碼的氨基酸序列和其用途。
背景技術(shù)：
目前國(guó)際上僅研究報(bào)道了從日本稻田蛙(Rana Japonica)、牛蛙(Rana catesbeiana)等蛙中分離得到具有凝集素活性的核糖核酸酶jSBL ([l]Fusao Sakakibara， Hiroaki Kawauchi， Giichi Takayanagi， Hitomilse. Egg lectin of Rana japonica and its receptor glycoprotein of ehrlich tumor cells. 1979. Cancer research. 39:1347-1352 )與cSBL ( [2]Kazuo Nitta, Giichi Takayanagi， Hiroaki Kawauchi， Sen-itiroh Hakomori. Isolation and Characterization of Rana catesbeiana Lectin and Demonstration of the Lectin-binding Glycoprotein of Rodent and Human Tumor Cell Membranes. 1987. CANCER RESEARCH. 47， 4877—4883)。
Sakakibara等[1]從日本稻田蛙的卵中分離出一種具有凝集活性的核糖核酸酶 jSBL，可優(yōu)先凝集大量的各種人類和動(dòng)物的腫瘤細(xì)胞，而不是正常的紅細(xì)胞，淋 巴細(xì)胞，或成纖維細(xì)胞。Nitta等[2]從牛蛙卵中也分離出具有凝集各種腫瘤細(xì)胞作 用的核糖核酸酶cSBL。具有凝集活性的核糖核酸酶可識(shí)別大量的各種腫瘤細(xì)胞的 細(xì)胞表面糖蛋白特征的具體組織結(jié)構(gòu)和方向，這無(wú)疑對(duì)于人類癌癥提供了一個(gè)重 要的基礎(chǔ)診斷和治療。
cSBL和jSBL蛋白對(duì)體內(nèi)的各種癌細(xì)胞均表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，其中cSBL己被證 明是一種在體外非常有效用的化療藥物。在一項(xiàng)有關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究中，研究人員將 腫瘤細(xì)胞注入小鼠腹膜內(nèi)腔，24小時(shí)后開(kāi)始每天按一定劑量對(duì)其中部分小鼠進(jìn)行 治療。研究結(jié)果表明，被治療小鼠的存活時(shí)間顯著高于未被治療小鼠的存活時(shí)間。對(duì)cSBL進(jìn)行的研究顯示，其酶活性不受人類RNA酶抑制因子的抑制，它們 一旦進(jìn)入細(xì)胞中，其降解腫瘤細(xì)胞RNA、殺死癌細(xì)胞的作用能很好地發(fā)揮，有利 于作為抗癌藥物應(yīng)用。
中國(guó)林蛙是中國(guó)特有的兩棲動(dòng)物資源，目前國(guó)內(nèi)對(duì)于中國(guó)林蛙的研究開(kāi)發(fā)僅 局限于林蛙油及林蛙抗菌肽等，對(duì)于其凝集素樣的核糖核酸酶及其抗腫瘤作用的 研究在國(guó)際國(guó)內(nèi)均屬于空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷而提出一種中國(guó)林蛙lectin樣功能 基因Rdr-lec序列。
本發(fā)明另一目的在于提出一種上述中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序 列的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的又一目的在于提出一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec的氨 基酸序列。及由該氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的且與該氨 基酸序列功能相同的氨基酸衍生序列。
本發(fā)明的再一目的在于提出一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列
的用途。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的發(fā)明思路為
降解DNA的藥物所導(dǎo)致的凋亡與野生型p53腫瘤遏制物的存在與否關(guān)系密 切，在p53缺失的情況下，降解DNA的藥物對(duì)腫瘤無(wú)效。目前人類的大部分腫瘤 (尤其是實(shí)質(zhì)性腫瘤)都能通過(guò)變異使p53失活，或產(chǎn)生p53抗體。而且，導(dǎo)致 DNA損傷的藥物往往能夠使正常細(xì)胞產(chǎn)生基因變異。而由lectin樣核糖核酸酶 介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凝集和對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用與野生型P53腫瘤遏制物 的存在與否無(wú)關(guān)，并且不產(chǎn)生基因的變異，因此，作為降解RNA的lectin樣核 糖核酸酶在藥物治療方面具有優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明基因序列從中國(guó)林蛙基因組中擴(kuò)增得到的，是一條新基因。其編碼的 功能蛋白可作為一種有選擇性的細(xì)胞毒素，其是以中國(guó)林蛙為基礎(chǔ)的，作為制備 新型、高效的抗腫瘤功能生物藥物的應(yīng)用，具有重要的醫(yī)藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明采用的具體技術(shù)方案為
一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列，其為序列表中SEQ ID No. 1
所示的核苷酸序列，具體如下
成熟蛋白編碼區(qū)基因序列
> Rdr-lec
cagaactggc caacatttca gcsgaagcac 3tttca3gca 3tcc肪ccat cgtctgt33c 60 agcatcatga acaacatcat atatatcgta ggaggtcaat gcaaggaacg caacactttc 120 ataatttctt ctgcaaccac cgtaagggcc atctgtagcg gggcgtcaac cgatagaaat 180 gtattaagta ccacaag3tt ccagctcaac acttgcattc gtagtgccat tgtaccccgc 240 ccttgtccat atacctccag accggaaact aatgtgatat gtgta犯atg tgagaataga 300 cttcccgtac attttgttgg aataggaagt tgt 333 一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec的氨基酸序列，其為序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，具體如下
由基因序列推導(dǎo)得到成熟蛋白編碼區(qū)蛋白序列 〉Rdr-lec
QNWPTFQQKH ISSNPTIVCN SIMNNIIYIV GGQCKERNTF IISSATTVRA ICSGASTDRN 60 VLSTTRFQLN TCIRSAIVPR PCPYTSRPET NVICVKCENR LPVHFVGIGS C 111 上述的一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列的構(gòu)建方法，其具體 步驟為提取出中國(guó)林蛙的基因組DNA，設(shè)計(jì)基因特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 產(chǎn)物電泳，從電泳膠中回收目標(biāo)DNA片段，與質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞，提取質(zhì)粒， PCR初步鑒定目標(biāo)基因后，測(cè)序。
上述的一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列的構(gòu)建方法，其中，所述的基因特異性引物為
正向引物NP1: ATG TGT GCA AAA TCT CTT CTT CTG G 反向引物CP0: GTA AAG CGT TGC TTG ACC AAG TAA TT 上述的一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列的構(gòu)建方法，其中，
所述PCR反應(yīng)體系及參數(shù)
基因組模板100ng、 dNTPs (lOraM) l|iL、 lOXTaq Buffer 5iU、 Taq DNA
Polymerase 3U和引物(NP1， CPO)各30pmo1、補(bǔ)無(wú)菌超純水至總體積為50 u 1，
混合均勻；
擴(kuò)增條件為94。C30s， 48。C30s， 72。C50s， 35個(gè)循環(huán)，72。C延伸7min結(jié)束。 上述的一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列的構(gòu)建方法，其中，
所述與質(zhì)粒連接的具體步驟為
(1) 目標(biāo)DNA片斷(20ng)、 pGM-T載體(50ng)、 T4 DNA Ligase 3U、 10XT4 DNA Ligase Buffer 1 u 1，補(bǔ)無(wú)菌超純水至總體積10 n 1;
(2) 16"C連接10 12小時(shí)制備成連接好載體的基因；
(3) 對(duì)步驟(2)連接好的樣品進(jìn)行PCR檢湖!J;連接產(chǎn)物1 "1、 dNTPs UOmM) lpL、 lOXTaq Buffer 5wl、 Taq DNA Polymerase3U和質(zhì)粒通用引物(T7， SP6) 各10pmo1，補(bǔ)無(wú)菌超純水至總體積50ul，混合均勻；PCR擴(kuò)增條件94°C30s， 48。C30s， 72。C50s， 35個(gè)循環(huán)，72"C延伸7min結(jié)束;
(4) 2.5。/。TAE瓊脂糖凝膠中上樣電泳檢領(lǐng)g，紫外分析儀中，觀察DNA條帶。 上述的一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列的構(gòu)建方法，其中，
所述轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的具體步驟為
(1) 將5ul (50ng)目標(biāo)基因與質(zhì)粒連接的產(chǎn)物(重組質(zhì)粒pGM-lec)加 入到100 " 1感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，混勻，冰浴30min;
(2) 42。C水浴中熱激90s;取出后立即置于冰浴2min;
(3) 加入500 ul提前37。C預(yù)熱好的不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37°C， 150rpm
7搖床培養(yǎng)45min;
(4) 4000rpm離心2min，棄部分上清液，濃縮后取100 wl涂轉(zhuǎn)化平板，涂 勻，干燥，倒置平板，37"C恒溫箱培養(yǎng)16h;
(5) 挑取分離良好、中等大小的白色菌落接種到含有抗生素的LB液體培養(yǎng) 基中，搖床37"、 180rpm培養(yǎng)12h。
上述的一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列的構(gòu)建方法，其中， 所述提取質(zhì)粒PCR鑒定的PCR反應(yīng)體系及參數(shù)為
提取的重組質(zhì)粒(pGM-lec)l w 1、dNTPs(10mM)0. 5jiL、 lOXTaq Buffer 2 n 1、 T叫DNA Polymerase 1.5U和質(zhì)粒通用引物(T7， SP6)各5pmo1，補(bǔ)無(wú)菌超純水 至總體積20ul，混合均勻；
PCR擴(kuò)增條件94。C30s， 48。C30s， 72。C50s， 35個(gè)循環(huán)，72。C延伸7min結(jié)束。
本發(fā)明所述的一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列可以在制備治 療抗腫瘤藥物中應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效益
本發(fā)明首先提取中國(guó)林蛙的基因組DNA，設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增基因， 測(cè)定基因順序。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，確定為新的基因Rdr-lec，即本發(fā)明所述的中 國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述中國(guó)林蛙 lectin樣功能基因Rdr-lec序列的蛋白有在治療耐藥病原菌引起的感染性疾病方 面具有應(yīng)用價(jià)值，且本發(fā)明所述重組蛋白在制備治療腫瘤細(xì)胞的生物藥物中具有 廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
下面結(jié)合附圖及最佳實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，以使公眾對(duì)
發(fā)明內(nèi)容
有整體和充分的了解，而并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。前述部分已經(jīng)充分公開(kāi) 了本發(fā)明可以實(shí)施的保護(hù)范圍，因此凡依照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容進(jìn)行的任何本領(lǐng)域公 知的等同替換，均屬于對(duì)本發(fā)明的侵犯。頁(yè)


圖1為目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果圖； 圖2為載體連接檢測(cè)結(jié)果圖； 圖3為轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的轉(zhuǎn)化結(jié)果圖； 圖4為質(zhì)粒PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果圖； 圖5為空載體誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)宿主菌生長(zhǎng)無(wú)影響圖； 圖6為重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)宿主菌生長(zhǎng)有抑制作用圖； 圖7為大腸桿菌裂解液的SDS-PAGE圖； 圖8為SDS-PAGE檢測(cè)親和膠純化后重組蛋白的純度圖； 圖9為大腸桿菌裂解液總蛋白與純化的重組蛋白Western blotting檢測(cè)圖； 圖10為重組融合蛋白對(duì)HeLa腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明具體實(shí)施方式
所用材料及設(shè)備來(lái)源
1、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中國(guó)林蛙(Rana dybowskii)來(lái)源吉林省樺甸市，選擇標(biāo)準(zhǔn)
識(shí)別特征皮色多為深褐色，肚黃色，嘴端略鈍圓，耳膜邊有羊角黑瘢，頸背處
有"A"形黑斑，四肢有環(huán)行黑斑。
2、 所用菌種和載體大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5oc， PGM-T載體(均購(gòu)于TIANGEN生
物技術(shù)有限公司)。
3、 工具酶與生化試劑
瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，硅膠膜型PCR產(chǎn)物(DNA片斷)純化試劑盒，普通 質(zhì)粒小提試齊U盒，Tryptone， Yeast Extract, Agarose,氨節(jié)青霉素，X-Gal， IPTG等(均購(gòu)于TIANGEN生物技術(shù)有限公司)，dNTPs， T4 DNA Ligase，入DNA/Hind III， TaqDNA Polymerase, EcoR I， HindIII， lkb DNA Ladder, DNA Marker I (均 購(gòu)于TaKaRa公司)，基因組DNA提取試劑盒、核酸染料GoldView， 50bp DNA Ladder(購(gòu)于北京賽百盛生物技術(shù)有限公司)，其它試劑均為市售分析純。4、設(shè)備和器材
TGL-16C型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；
HQ-60型旋渦混合器，北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司；
PCR擴(kuò)增儀9700型，Gene Amp公司；
THZ-D型臺(tái)式恒溫振蕩器，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；
UV-IV型紫外分析儀，北京市新科技應(yīng)用研究所；
SPN202F型電子天平，梅特勒一托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司；
DYY-6C型電泳儀北京市六一儀器廠；
DYCP-31DN型電泳槽，北京六一儀器廠；
LRH-250型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；
LS-835L型立式壓力蒸汽滅菌鍋江陰江濱醫(yī)療設(shè)備廠；
SWCJ-B型凈化工作臺(tái)，天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；
DZKW型電子恒溫水浴鍋，光明牌。
本發(fā)明一種中國(guó)林蛙lectin樣抗腫瘤功能基因Rdr-lec序列的具體構(gòu)建方
法
1、 引物設(shè)計(jì)
基因特異性引物
正向引物NP1: ATG TGT GCA AAA TCT CTT CTT CTG G 反向引物CPO: GTA AAG CGT TGC TTG ACC AAG TAA TT
2、 目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增
(1) 使用血液基因組提取試劑盒，從林蛙新鮮血液中提取基因組DNA， 1%瓊
脂糖電泳檢測(cè)分子量及濃度。
(2) 向無(wú)菌PCR管中加入基因組模板100ng、dNTPs(10mM)lnL、10XTaq Buffer
5ul、 Taq DNA Polymerase 3U和引物(NP1， CPO)各30pmo1、補(bǔ)無(wú)菌超純水至 總體積為50ul，混合均勻；(3) 將加入樣品的PCR管放入己經(jīng)預(yù)熱好的PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增 條件94。C30s， 48。C30s， 72。C50s， 35個(gè)循環(huán)，72。C延伸7min結(jié)束。
(4) PCR結(jié)束后，在2. 5%TAE瓊脂糖凝膠中上樣電泳檢測(cè)并切膠純化目標(biāo)基因。 紫外分析儀中，觀察DNA條帶。
目標(biāo)基因PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，經(jīng)PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳，以50bpDNA Ladder為參照標(biāo)準(zhǔn)，在紫外分析儀中，可看到約在500bp位置(完整開(kāi)放閱讀框 架，包括信號(hào)序列，準(zhǔn)確值為495bp)出現(xiàn)明亮的熒光條帶，證明目的基因擴(kuò)增 成功，切膠純化后可用于接下來(lái)的載體連接。
3、 pGM-T載體連接
(1) 向無(wú)菌PCR管中加入目標(biāo)基因片斷(20ng)、 pGM-T載體(50ng)、 T4 DNA Ligase 3U、 10XT4 DNA Ligase Buffer lyl，補(bǔ)無(wú)菌超純水至總體積10 ix 1;
(2) 16"C連接10 12小時(shí)制備成連接好目標(biāo)基因的載體；
(3 )對(duì)連接好的樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)。向無(wú)菌PCR管中加入連接產(chǎn)物1 iU 、 dNTPs (lOraM) lpL、 10XTaq Buffer 5 ul、 Taq DNA Polymerase3U和質(zhì)粒通用引物(T7， SP6)各10pmo1，補(bǔ)無(wú)菌超純水至總體積50ixl，混合均勻。
(4) 將加入樣品的PCR管放入己經(jīng)預(yù)熱好的PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增 條件94。C30s， 48。C30s， 72。C50s， 35個(gè)循環(huán)，72。C延伸7min結(jié)束。
(5) PCR結(jié)束后，在2.5。/。TAE瓊脂糖凝膠中上樣電泳檢測(cè)。紫外分析儀中， 觀察DNA條帶。
pGM-T載體連接檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，對(duì)16。C連接過(guò)夜的結(jié)果進(jìn)行PCR及瓊 脂糖電泳檢測(cè)，在紫外分析儀中，以Marker I為參照標(biāo)準(zhǔn)，可看到在600bp位 置出現(xiàn)明亮的熒光條帶，與預(yù)期結(jié)果基本一致，證明載體連接成功，可進(jìn)行后續(xù) 實(shí)驗(yàn)。
4、 制備轉(zhuǎn)化平板
(1)配制LB及LB/Agar培養(yǎng)基① LB液體培養(yǎng)基配制(500ml): Tryptone 5g、 Yeast Extract 2. 5g、 NaCl 5g， 加入400ml水，充分?jǐn)嚢枞芙猓渭?NNa0H (約0.2ml)，調(diào)pH值到7.0，再加 水定容至500ml (取出200ml用于配制固體培養(yǎng)基，300ml分裝兩瓶，各150ml)。 121°C， 0, lMPa，高壓滅菌20min。 4。C存放。
② LB/Agar/Amp固體培養(yǎng)基配制按LB液體培養(yǎng)基準(zhǔn)備好，高壓滅菌前加入 Agar3g/200ml，高壓滅菌，冷卻至55。C，在超凈臺(tái)上向其中加入抗生素(氨節(jié) 青霉素)0.2ml，混勻，倒平板(20ffll/板)，4t:存放。
(2)在超凈臺(tái)上，向鋪好含有相應(yīng)抗生素的LB/Agar/A^D固體培養(yǎng)基表面加入 16iUIPTG (50mg/ral)、 40 u IX-Gal (20mg/ml)，使用無(wú)菌涂棒涂勻，避光37°C 恒溫箱中放置1~3小時(shí)后使用。 5、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5ot
(1) 5ul (50ng)連接產(chǎn)物加入到100ul感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30min。
(2) 42t:水浴中熱激90s。取出后立即置于冰浴2min。
(3) 加入500 "1提前37。C預(yù)熱好的LB培養(yǎng)基(不含抗生素)，37°C， 150rpm 搖床培養(yǎng)45min。
(4) 4000rpm離心2min，棄部分上清液，濃縮后取100 y 1涂轉(zhuǎn)化平板，涂勻， 干燥，倒置平板，37。C恒溫箱培養(yǎng)16h。
(5) 挑取分離良好、中等大小的白色菌落接種到含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基 中，搖床37。C、 180rpm培養(yǎng)12h。
轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖3所示，16h培養(yǎng)后，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化的目的基因在培養(yǎng)基上長(zhǎng) 出藍(lán)色和白色兩種菌落，其中白色菌落為所需目的菌，在經(jīng)過(guò)菌落檢測(cè)后，若結(jié) 果正確，則可用于液體培養(yǎng)及質(zhì)粒提取。 6、提取質(zhì)粒、擴(kuò)增及測(cè)序
(1) 用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒。
(2) PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒中的插入DNA片段。向無(wú)菌PCR管中加入提取的重組質(zhì)粒(pGM-lec)l u 1、dNTPs(10mM)0. 5pL、10XTaq Buffer 2 ul、TaqDNA Polymerase 1.5U和質(zhì)粒通用引物(T7， SP6)各5pmo1，補(bǔ)無(wú)菌超純水至總體積20 ix 1，混合 均勻。PCR擴(kuò)增條件94。C30s， 48。C30s， 72。C50s， 35個(gè)循環(huán)，72。C延伸7min 結(jié)束。2.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。至總體積20ul，混合均勻。
PCR擴(kuò)增檢測(cè)質(zhì)粒上目標(biāo)基因片段插入如圖4所示，經(jīng)12h培養(yǎng)所得菌液進(jìn) 行質(zhì)粒提取，對(duì)所得質(zhì)粒進(jìn)行PCR反應(yīng)及瓊脂糖電泳檢測(cè)，以Marker I為參照 標(biāo)準(zhǔn)，可看到在600bp位置出現(xiàn)明亮的熒光條帶，與預(yù)期結(jié)果基本一致，證明質(zhì) 粒提取結(jié)果正確。
(3)將提取的質(zhì)粒測(cè)序。
質(zhì)粒樣品由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。得到成熟蛋白編碼區(qū) 基因序列為SEQ ID No. l所示，具體為 > Rdr-lec
cagaactggc caacatttc3 gC3g33gcac 3tttc犯gcs 3tcc肪cc3t cgtctgt朋c 60 agcatcatga aca^catcat atat3tcgta ggaggtcaM gc犯ggaacg caacactttc 120 ataatttctt ctgcaaccac cgtaagggcc atctgtagcg gggcgtcaac cgat卿aat 180 gtattaagta ccacaagatt ccagctc犯c acttgcattc gtagtgccat tgtaccccgc 240 ccttgtccat atacctccag accggaaact aatgtgatat gtgt犯aeitg tg卿ataga 300 cttcccgtac attttgttgg aataggaeigt tgt 333
由基因序列推導(dǎo)得到成熟蛋白編碼區(qū)蛋白序列如SEQ ID No. 2所示，具體為 〉Rdr-lec
QNWPTFQQKH ISSNPTIVCN SIMNNIIYIV GGQCKERNTF IISSATTVRA ICSGASTDRN 60 VLSTTRFQLN TCIRSAIVPR PCPYTSRPET NVICVKCENR LPVHFVGIGS C 111
將上述測(cè)序結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明，本發(fā)明所述的 中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列為新的基因。
實(shí)施例2本發(fā)明構(gòu)建的中國(guó)林蛙lectin樣抗腫瘤功能基因Rdr-lec序列及氨基酸序列的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)
中國(guó)林蛙Rdr-lec基因的重組融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中對(duì)宿主菌的細(xì)胞毒性研究 一、材料和方法
1、 材料
(1) 菌種和載體
大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于TIANGEN生物技術(shù)有限公司，pFLAG-CTS 載體購(gòu)于sigma-aldrich。
(2) 工具酶與生化試劑
Tryptone, Yeast Extract, Agarose,氨節(jié)青霉素，X-Gal， IPTG等(均購(gòu)于 TIANGEN生物技術(shù)有限公司)，其它試劑均為市售分析純。
(3) 設(shè)備和器材
THZ-D型臺(tái)式恒溫振蕩器，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠； SPN202F型電子天平，梅特勒一托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司； LRH-250型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司； LS-835L型立式壓力蒸汽滅菌鍋江陰江濱醫(yī)療設(shè)備廠； SWCJ-B型凈化工作臺(tái)，天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；
2、 實(shí)驗(yàn)方法
將攜帶有空質(zhì)粒pFLAG-CTS或攜帶有中國(guó)林蛙Rdr-lec基因的重組質(zhì)粒 pFLAG-lec的大腸桿菌BL21 (DE3)涂布于LB/agar/Amp平板上活化，挑取 LB/agar/A卿平板上過(guò)夜生長(zhǎng)的單菌落，接種于20ml LB/Amp培養(yǎng)基中，37°C， 180rpm搖菌過(guò)夜。次日在20ml菌液中再加入新鮮LB/Amp培養(yǎng)基20ml， 37°C， 180rpm搖菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD6。。=0. 8)，分出20ml菌液于已滅菌并預(yù)熱至37 °C 的三角瓶中，加入終濃度為20uM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，剩余的20ml菌液中不加IPTG， 作為非誘導(dǎo)對(duì)照，定時(shí)檢測(cè)0D6。。，記錄IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)過(guò)程中對(duì)宿主菌 生長(zhǎng)的抑制情況。
14二、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、 空載體誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)宿主菌生長(zhǎng)無(wú)影響。
如圖5所示，用20uM IPTG誘導(dǎo)攜帶有空質(zhì)粒pFLAG-CTS的Escherichia Coli BL21 (DE3)表達(dá)后，宿主菌的生長(zhǎng)情況與未誘導(dǎo)相比，沒(méi)有差別。可見(jiàn)空載體 的誘導(dǎo)表達(dá)不影響宿主菌的生長(zhǎng)。
2、 重組質(zhì)粒pFLAG-lec誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中對(duì)宿主菌生長(zhǎng)具有明顯抑制作用。
如圖6所示重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)宿主菌生長(zhǎng)有抑制作用，分別用20uM、 40uM 和lOOuM IPTG誘導(dǎo)攜帶有重組質(zhì)粒pFLAG-lec的Escherichia Coli BL21 (DE3) 表達(dá)重組蛋白30min后，明顯可見(jiàn)宿主菌的生長(zhǎng)受到抑制，60min后抑制率分別 達(dá)到11. 9%， 9. 4%， 8. 7%,誘導(dǎo)210min后抑制率可達(dá)到36. 4%， 31. 8%, 33. 5%。
三、 結(jié)論
攜帶有中國(guó)林蛙Rdr-lec基因的重組質(zhì)粒pFLAG-lec的大腸桿菌BL21(DE3)， 在加入誘導(dǎo)劑IPTG以后幵始轉(zhuǎn)錄和表達(dá)Rdr-lec基因，重組蛋白分泌至大腸桿 菌的周質(zhì)腔中儲(chǔ)存。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)劑IPTG對(duì)帶有空載體的大腸桿菌沒(méi)有抑制作用，說(shuō)明 空載體本身的誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)大腸桿菌沒(méi)有細(xì)胞毒作用。
誘導(dǎo)劑IPTG對(duì)帶有Rdr-lec重組質(zhì)粒pFLAG-lec的大腸桿菌具有顯著的抑 制作用，說(shuō)明重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)大腸桿菌具有顯著的細(xì)胞毒作用。尤其值得 注意的是攜帶有pFLAG-CTS質(zhì)粒的宿主菌都是耐受Amp抗生素的耐藥菌，說(shuō)明了 重組蛋白的細(xì)胞毒性較強(qiáng)，這些重組蛋白在治療耐藥病原菌引起的感染性疾病方 面具有應(yīng)用價(jià)值。同樣說(shuō)明這些重組蛋白有在治療腫瘤細(xì)胞中具有很好的應(yīng)用價(jià) 值。 . 實(shí)施例3中國(guó)林蛙Rdr-lec基因的重組融合蛋白的制備
一、材料與設(shè)備1、 菌種和載體
大腸桿菌BL21(DE3 )感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于TIANGEN生物技術(shù)有限公司，pFLAG-CTS 載體貝勾于sigma-Aldrich。
2、 工具酶與生化試劑
Tryptone, Yeast Extract, Agarose,氨節(jié)青霉素，X-Gal， IPTG等(均購(gòu)于 TI認(rèn)GEN生物技術(shù)有限公司)，小鼠抗FLAG單克隆抗體(均購(gòu)于Sigma公司)，連 接有堿性磷酸酶的羊抗小鼠二抗，BCIP/NBT顯色試劑盒(購(gòu)于北京中杉金橋生物 公司)，其它試劑均為市售分析純。
3、 設(shè)備
THZ-D型臺(tái)式恒溫振蕩器，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠； LRH-250型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司； LS-835L型立式壓力蒸汽滅菌鍋江陰江濱醫(yī)療設(shè)備廠； 超凈工作臺(tái)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司； YC-1層析柜，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司； 高速冷凍離心機(jī)(SORVALL RC6PLUS)， THERMO; 冷凍干燥機(jī)(FD-1B-50)，北京亞泰科隆實(shí)驗(yàn)科技開(kāi)發(fā)中心； 超聲波細(xì)胞粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司； 萬(wàn)分之一電子天平(AR2140)，奧豪斯公司； PH儀(PHSJ-3F)，上海雷磁 可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì) (UV-1700)， SHIMADZU; 垂直電泳槽(DYC2-24D)，北京六一儀器廠； 電泳儀(DYY-8C)，北京六一儀器廠 二、實(shí)驗(yàn)方法
161、 菌體的培養(yǎng)及超聲裂解
將攜帶重組質(zhì)粒的菌體，在LB/Agar/Amp培養(yǎng)基的平板上劃線，37'C恒溫箱 中培養(yǎng)過(guò)夜。次日用接種針挑取分離良好的單菌落，接入LB/Amp液體培養(yǎng)基中， 置于搖床，于37°C， 180rpm，培養(yǎng)12小時(shí)。按照5%接種量接種于預(yù)熱好的LB/Amp 培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)6L菌液。使菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期(OD600=0.6 0.8)時(shí)加入終濃 度為20uM的IPTG誘導(dǎo)4h。
離心收集菌體，PBS洗滌三次。加入破碎緩沖液，冰浴超聲，裂解菌體。離 心收集上清液。分離膠濃度為12%的SDS-PAGE及western blotting檢測(cè)裂解液 中的目標(biāo)蛋白。
2、 親和膠純化重組融合蛋白
在重組蛋白的C端帶有FLAG標(biāo)簽(其氨基酸序列為EFPGTRSVDYKDDDDK ) ， FLAG 不會(huì)影響目標(biāo)蛋白質(zhì)正確折疊成三維結(jié)構(gòu)，也不會(huì)影響目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性。可方 便地利用小鼠抗FLAG單克隆抗體偶聯(lián)的瓊脂糖親和膠(購(gòu)于sig腿公司)進(jìn)行 純化。具體方法是將細(xì)胞裂解液高速冷凍離心(4°C， 20000rpm， 30min)后， 取上清，與親和膠孵育，4°C，過(guò)夜。離心(4°C， 1500rpm， 2min),收集親和膠。 用TBS洗膠，五次。向親和膠中加入lml甘氨酸洗脫液，輕搖lmin，離心(4°C， 1500rpm， 2min)，取上清，放入一支有10ul中和液的離心管內(nèi)，分批共洗脫親 和膠5次，收集5管洗脫蛋白。
3、 檢測(cè)樣品純度
將得到的洗脫蛋白合并，對(duì)水充分透析后凍干。將凍干粉用100ul TBS溶解 后，用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，進(jìn)行SDS-PAGE，檢測(cè)產(chǎn)品純度，western blotting鑒定重組蛋白。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、 大腸桿菌裂解液中重組融合蛋白的檢測(cè)
攜帶有Rdr-lec基因的重組質(zhì)粒pFLAG-lec的大腸桿菌在LB/A即培養(yǎng)基中 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(0D600=0. 6 0. 8)，加入終濃度為20uM的IPTG誘導(dǎo)4h后，離心 收集菌體，洗漆菌體后冰浴超聲裂解細(xì)胞，將得到的裂解液進(jìn)行SDS-PAGE (分離 膠濃度為12%)，檢測(cè)到裂解液中在預(yù)期分子量位置有重組融合蛋白的條帶如圖7 所示，圖7為大腸桿菌裂解液的SDS-PAGE圖。圖中，最左邊泳道為核糖核酸酶A， 中間泳道為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，最右側(cè)為大腸桿菌裂解液。由圖可見(jiàn)，在分子量 約14. 2kDa處有目標(biāo)蛋白表達(dá)。
2、 親和膠純化重組融合蛋白R(shí)dr-lec
將細(xì)胞裂解液高速冷凍離心(4°C， 20000rpm， 30min)后，取上清，與連接 有抗FLAG抗體的親和膠一起孵育過(guò)夜，使目標(biāo)蛋白吸附于親和膠上。經(jīng)過(guò)多次 洗滌親和膠去除雜蛋白后，采用分部酸洗脫，使目標(biāo)蛋白R(shí)dr-lec從親和膠上解 析下來(lái)。洗脫后的Rdr-lec蛋白立即用中和液中和至中性pH值。電泳檢測(cè)重組 蛋白R(shí)dr-lec的純度。結(jié)果圖8所示，圖8為SDS-PAGE檢測(cè)親和膠純化后重組 蛋白的純度圖；由圖可見(jiàn)，在分子量約為14.2kDa處重組蛋白為均一條帶。采用 親和膠純化得到了重組蛋白的單一組分。
分別將大腸桿菌裂解液和純化的重組蛋白經(jīng)12y。分離膠濃度的SDS-PAGE分離 后，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，分別用抗FLAG小鼠單克隆抗體(Sigma, 300倍稀釋)、 二抗一一堿性磷酸酶連接的羊抗小鼠抗體(中杉金橋生物公司，20倍稀釋)與 抗原反應(yīng)，BCIP/NBT顯色鑒定重組蛋白，如圖9示。圖9為大腸桿菌裂解液總 蛋白與純化的重組蛋白Western blotting檢測(cè)圖。圖中，左邊為Rdr-lec純品， 右邊為大腸桿菌裂解液。由此可鑒定大腸桿菌裂解液總蛋白中有重組蛋白表達(dá)， 經(jīng)過(guò)親和膠純化后得到了重組蛋白的純品。四、結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)將導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，制備核糖核酸酶Rdr-lec重組 融合蛋白。由于核糖核酸酶為胞內(nèi)酶，首先進(jìn)行細(xì)胞破碎，上清液即為粗酶液。 采用親和膠分離純化，得到林蛙核糖核酸酶Rdr-lec重組融合蛋白，SDS-PAGE電 泳檢測(cè)到分子量約在14.2kDa左右的均一條帶。Western blotting法鑒定了 Rdr-lec重組融合蛋白。建立了有效的Rdr-lec重組融合蛋白的制備方法。
實(shí)施例4中國(guó)林蛙Rdr-lec基因的重組融合蛋白的體外抗腫瘤作用研究
一、 材料與設(shè)備
1、 細(xì)胞株、培養(yǎng)基與生化試劑
人宮頸癌細(xì)胞HeLa為本實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco，小牛血 清、青霉素、鏈霉素、MTT、臺(tái)盼藍(lán)、DMSO購(gòu)于鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，其它試 劑均為市售分析純。
2、 設(shè)備
二氧化碳培養(yǎng)箱(日本Forma);
酶標(biāo)儀 (Lab systems Dragon well scan MK3);
倒置顯微鏡(Nikon 808434);
立式壓力蒸汽滅菌鍋(LS-835L型)江陰江濱醫(yī)療設(shè)備廠； 凈化工作臺(tái)(SWCJ-B型)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。
二、 實(shí)驗(yàn)方法 1、細(xì)胞培養(yǎng)
HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司)，內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛 血清(56°C滅活30min)、 100U/ml青霉素、lOOpg/ml鏈霉素，于37°C、體積分?jǐn)?shù)為5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 3d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
2、 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組融合蛋白R(shí)dr-lec對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用
收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，配制成細(xì)胞懸液，于顯微鏡下用 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞初始濃度為lX104細(xì)胞/ml。于96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔接 種100)ul (每孔含1000個(gè)細(xì)胞)。培養(yǎng)24h后，吸出培養(yǎng)液，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加 入含不同藥物濃度的培養(yǎng)液，用培養(yǎng)基配制重組融合蛋白R(shí)dr-lec，設(shè)5個(gè)濃度 50|ig/l、 25ng/l、 12. 5|ig/l、 6.25ng/l、 3. 12pg/l，空白對(duì)照組加入不含藥物的 等體積培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)平行孔，每孔加樣10(^1。置37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%C02 孵育箱中培養(yǎng)48h后棄去培養(yǎng)液，用培養(yǎng)液洗2次，以去除藥液，每孔加入0.5% MTT溶液(RPMI 1640配制)20^1。 37°C保溫4h，棄上清液，每孔加入DMSO 200pl 溶解Formazan顆粒，平板振蕩儀振蕩10min，在酶標(biāo)儀上570nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸 光度值，繪制細(xì)胞存活率曲線。
三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組融合蛋白對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用如圖10所示，圖10為重組 融合蛋白對(duì)HeLa腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用圖。由圖可見(jiàn)，重組融合蛋白R(shí)dr-lec 對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著抑制作用，其IG。約為12. 3ug/ml。
四、 結(jié)論
重組融合蛋白R(shí)dr-lec在極低濃度下對(duì)于受試的HeLa腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)大的 體外細(xì)胞毒性，其lC5。的值約為12.3ug/ml，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)。可見(jiàn)， 重組融合蛋白R(shí)dr-lec具有殺傷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。對(duì)于腫瘤的臨床治療具有 重要的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。序列表
<110>北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院
〈120>中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列、構(gòu)建方法及其氨基酸序列 和用途 〈130〉 <140〉 <141>
〈213>人工序列 <400>
c卿actggc caacatttca gc卿agcac atttc犯gca atccaaccat cgtctgtaac 60 agcatcatga acaacatcat atatatcgta gg鄉(xiāng)tcast gc肪ggaacg caeicactttc 120 at犯UtCtt CtgC朋CC3C cgts鄉(xiāng)gcc 3tCtgt3gCg gggcgtc朋c Cg3t卿肪t 180 gtattaagta ccacaagatt ccagctcaac acttgcattc gtagtgccat tgtaccccgc 240 ccttgtccat atacctccag accggaaact aatgtgatat gtgtaaaatg tg3gaataga 300
cttcccgtac attttgttgg aat3ggaagt tgt 333 〈212〉 DNA 〈211〉 333
中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列
〈213〉人工序列 <400>
21QNWPTFQQKH ISSNPTIVCN SI麗NIIYIV GGQCKERNTF IISSATTVRA ICSGASTDRN 60 VLSTTRFQLN TCIRSAIVPR PCPYTSRPET NVICVKCENR LPVHFVGIGS C 111
〈212〉 PRT 〈211〉 111
中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec的氨基酸序列
權(quán)利要求
1、一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列，其特征在于，為序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2、 一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec的氨基酸序列，其特征在于， 為序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3、 一種權(quán)利要求2所述的一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec的氨基 酸序列的衍生序列，其特征在于，其是由序列表中SEQ ID No. 2所示的氨基酸序 列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的且與序列表中SEQ ID No.2所示的氨 基酸序列功能相同的氨基酸序列。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列的 構(gòu)建方法，其特征在于，其具體步驟為提取出中國(guó)林蛙的基因組DNA，設(shè)計(jì)基 因特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳，從電泳膠中回收目標(biāo)DNA片段，與質(zhì) 粒連接，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞，提取質(zhì)粒，PCR初步鑒定目標(biāo)基因后，測(cè)序。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列的 構(gòu)建方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)體系及參數(shù)基因組模板、dNTPs、 lOXTaq Buffer、 Taq DNA Polymerase和基因特異性 引物，補(bǔ)無(wú)菌超純水至總體積為50iU,混合均勻；擴(kuò)增條件為94。C30s， 48。C30s， 72。C50s， 35個(gè)循環(huán)，72。C延伸7min結(jié)束。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列的 構(gòu)建方法，其特征在于，所述與質(zhì)粒連接的具體步驟為(1) 目標(biāo)DNA片斷、載體、T4 DNA Ligase 3U、 10XT4 DNA Ligase Buffer, 補(bǔ)無(wú)菌超純水至總體積10 y 1;(2) 16。C連接10 12小時(shí)制備成連接好目標(biāo)基因的載體；(3) 對(duì)步驟(2)連接好的樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)；連接產(chǎn)物、dNTPs、 10XTaq Buffer、 Taq DNA Polymerase和質(zhì)粒通用引物，補(bǔ)無(wú)菌超純水至總體積50 U 1， 混合均勻；PCR擴(kuò)增條件94。C30s， 48。C30s， 72。C50s， 35個(gè)循環(huán)，72。C延伸7min結(jié)束；(4) 2.5。/。TAE瓊脂糖凝膠中上樣電泳檢測(cè)，紫外分析儀中，觀察DNA條帶。
7、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列的 構(gòu)建方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的具體步驟為(1) 將5wl目標(biāo)基因與質(zhì)粒連接的產(chǎn)物加入到100 ul感受態(tài)細(xì)胞中，混 勻，冰浴30min;(2) 42i:水浴中熱激90s;取出后立即置于冰浴2rain;(3) 加入500 ul提前37匸預(yù)熱好的不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37°C， 150rpm 搖床培養(yǎng)45min;(4) 4000rpm離心2min，棄部分上清液，濃縮后取100 ix 1涂轉(zhuǎn)化平板，涂 勻，干燥，倒置平板，37"C恒溫箱培養(yǎng)16h;(5) 挑取分離良好、中等大小的白色菌落接種到含有抗生素的LB液體培養(yǎng) 基中，搖床37。C、 180rpm培養(yǎng)12h。
8、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列的 構(gòu)建方法，其特征在于，所述提取質(zhì)粒PCR鑒定的PCR反應(yīng)體系及參數(shù)為提取的重組質(zhì)粒、dNTPs、 lOXTaq Buffer、 Taq DNA Polymerase和質(zhì)粒通 用引物，補(bǔ)無(wú)菌超純水至總體積20ul，混合均勻；PCR擴(kuò)增條件:94。C30s， 48。C30s， 72。C50s， 35個(gè)循環(huán)，72。C延伸7min結(jié)束。
9、 根據(jù)權(quán)利要求4至8中任意一項(xiàng)所述的一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因 Rdr-lec序列的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的基因特異性引物為正向引物NP1: ATG TGT GCA AAA TCT CTT CTT CTG G 反向引物CPO: GTA AAG CGT TGC TTG ACC AAG TAA TT
10、 一種中國(guó)林蛙lectin樣抗腫瘤功能基因Rdr-lec序列在制備治療腫瘤 藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列，其為序列表中SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明首先提取中國(guó)林蛙的基因組DNA，設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增基因，測(cè)定基因順序。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，確定為新的基因Rdr-lec，即本發(fā)明所述的中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述中國(guó)林蛙lectin樣功能基因Rdr-lec序列的蛋白有在治療耐藥病原菌引起的感染性疾病方面具有應(yīng)用價(jià)值，且本發(fā)明所述重組蛋白在制備治療腫瘤細(xì)胞的生物藥物中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101619315SQ20081011613
公開(kāi)日2010年1月6日 申請(qǐng)日期2008年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月3日
發(fā)明者偉 趙, 陶鳳云 申請(qǐng)人:北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院