專(zhuān)利名稱(chēng)：：轉(zhuǎn)pta基因提高百合抗蚜蟲(chóng)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的提高抗蚜蟲(chóng)性的方法，特別是一種轉(zhuǎn)pta基因提高百合抗蚜蟲(chóng)性的方法。技術(shù)背景百合屬植物(Liliums卯.)總稱(chēng)為"百合"。百合科(Liliaceae)植物為多年生露地鱗莖花卉。野生種或人工培育的培品種繁多，種質(zhì)資源遺傳變異十分豐富。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界百合屬植物共有100多種(文獻(xiàn)記錄130種)。中國(guó)是百合屬植物的自然分布中心之一，據(jù)文獻(xiàn)記載原產(chǎn)中國(guó)百合屬植物約55個(gè)種。其中有36個(gè)種、18個(gè)變種為中國(guó)所特有。屬內(nèi)許多種花朵碩大、花色艷麗多彩、花姿百態(tài)、芳香怡人，具有較高的觀賞價(jià)值。百合作為高檔的鮮切花商品之一，在世界各地廣為栽培，在世界鮮切花市場(chǎng)中占有十分重要的地位。然而，目前絕大多數(shù)百合栽培品種不抗蚜蟲(chóng)。蚜蟲(chóng)已成為是危害百合生產(chǎn)的主要害蟲(chóng)之一，除其自身吸食百合汁液，致使百合生長(zhǎng)不良以外，還通過(guò)傳播各種病毒(如花葉病毒)而導(dǎo)致病毒病對(duì)百合造成間接危害。特別是近年來(lái)受大氣溫室效應(yīng)的影響，我國(guó)百合主要種植地區(qū)百合生育期間氣溫升高，出現(xiàn)"暖冬"，致使蚜蟲(chóng)危害猖獗，每年在百合生產(chǎn)上因蚜蟲(chóng)及由其傳播的病毒所造成的經(jīng)濟(jì)損失十分嚴(yán)重，如何有效防治蚜蟲(chóng)已成為百合生產(chǎn)上的重大問(wèn)題之一。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，天南星科(Araceae)植物半夏(Pinelliaternata)凝集素(Pinelliaternataagglutinin,PTA)對(duì)嫁蟲(chóng)具有很強(qiáng)的抗性(黃大昉，潘映紅，張淑香，曹景平，楊雪梅，張杰，尹蔚莊.從掌葉半夏和半夏中發(fā)現(xiàn)對(duì)幾種釾蟲(chóng)有致死活性的蛋白?！吨袊?guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)》，1997年30巻第2期94頁(yè)。)，前期的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)pta基因的轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)蚜蟲(chóng)的抗性明顯提高(Yao，J.，Pang，Y.，Qi，H,,Wan,B.，Zhao，X.,Kong，W.,Sun，X.andTangK.(2003).TransgenictobaccoexpressingPinelliaternataagglutininconfersenhancedresistancetoaphids.TransgenicResearch12(6):715-722)，說(shuō)明pta基因在植物抗蚜蟲(chóng)育種中具有很好的應(yīng)用前景。然而，到目前為止，還沒(méi)有利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高百合抗蚜蟲(chóng)性的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種轉(zhuǎn)pta基因提高百合抗蚜蟲(chóng)性的方法。本發(fā)明涉及的基因克隆、載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)基因植物的分子檢測(cè)及抗蟲(chóng)測(cè)定用于本發(fā)明，為利用基因工程技術(shù)培育抗蚜百合奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的采用RT-PCR技術(shù)從半夏中克隆出半夏凝集素基因pta，構(gòu)建含pta基因的植物表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將pta基因?qū)氚俸喜⒔?jīng)過(guò)抗生素篩選獲得轉(zhuǎn)化植株；利用PCR技術(shù)檢測(cè)外源目的基因pta的整合情況，抗蟲(chóng)性試驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株的抗蚜性，最終獲得抗蚜性提高的轉(zhuǎn)基因百合植株。本發(fā)明包括如下具體步驟(1)采用RT-PCR技術(shù)獲得半夏凝集素基因pta;(2)將pta基因置于花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子之后，構(gòu)建成含pta基因的植物表達(dá)載體；(3)將含pta基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株，獲得用于轉(zhuǎn)化百合的含Pta基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；(4)利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化百合無(wú)菌苗葉片，經(jīng)過(guò)抗生素篩選，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因百合植株；(5)對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因百合植株進(jìn)行抗蟲(chóng)性測(cè)定，最終獲得抗蚜性提高的轉(zhuǎn)基因百合植株。所述的經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因百合植株是指，分別設(shè)計(jì)合成pta基因核心片段的檢測(cè)引物，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，紫外線下觀察到目的條帶的陽(yáng)性植株即為轉(zhuǎn)基因百合植株。本發(fā)明的轉(zhuǎn)pta基因提高百合抗蚜蟲(chóng)性的方法，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將半夏凝集素基因pta導(dǎo)入百合植株中，然后通過(guò)抗蟲(chóng)性測(cè)定最終篩選獲得抗蚜性提高的轉(zhuǎn)基因百合植株，結(jié)果表明，在含半夏凝集素基因pta的轉(zhuǎn)基因百合植株上存活的蚜蟲(chóng)數(shù)量同非轉(zhuǎn)基因?qū)φ丈系南啾蕊@著減少(P〈0.05)。本發(fā)明中所涉及的根癌農(nóng)桿菌菌株為市場(chǎng)上公開(kāi)出售的菌株EHA105，從澳大利亞CAMBIA公司購(gòu)得，菌株編號(hào)為Gambar1。具體實(shí)施方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1采用RT-PCR技術(shù)獲得半夏凝集素基因pta1.半夏總RNA的提取取少量半夏(來(lái)源于上海中醫(yī)藥大學(xué))幼嫩葉片，用液氮速凍后，迅速用研缽研碎，加入盛有1mLTRIzol(TRIzolReagents,GIBCOBRL，USA)的1.5mLEppendorf管中，充分振蕩后，于室溫下放置5min，加200叱氯仿，用力振蕩15sec，室溫放置2-3min后，于4°C、12，000g離心15min;將上清液吸入干凈的1.5mLE卯endorf管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫下放置10min后，于4。C、12，000g離心10min;棄上清，加1mL75%乙醇清洗，振蕩后，于4°C、7,500g離心5min;室溫干燥15-20min后溶于適量(50叱)RNAase-free水中；用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量。2.半夏凝集素基因pta的克隆采用RT-PCR技術(shù)克隆半夏凝集素基因pta，具體地，將所獲的半夏總RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，再根據(jù)所述半夏pta基因的編碼序列(序列表中的序列1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增出pta基因完整編碼框的上下游引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以所述的第一鏈cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后將擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建到pGEMT-easy測(cè)序載體上進(jìn)行測(cè)序(采用3730自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序)。測(cè)序結(jié)果表明，所克隆的序列與GenBank中所報(bào)道的半夏pta基因的編碼序列(序列表中的序列1)一致。本實(shí)施例采用RT-PCR技術(shù)從半夏中獲得序列正確的半夏凝集素基因pta，為利用轉(zhuǎn)Pta基因提高百合抗蚜蟲(chóng)性提供了目的基因。實(shí)施例2將pta基因置于花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子之后，構(gòu)建含pta基因的植物表達(dá)載體1.含pta基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA2300::p35S-pta-nos的構(gòu)建首先，采用HindIII和EcoRI雙酶切植物表達(dá)載體pBI121質(zhì)粒和pCAMBIA2300質(zhì)粒，再利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收片段(pBI121的gus表達(dá)盒和pCAMBIA2300大片段)；再將回收片段同連接酶混合均勻并短暫離心后，于16'C恒溫反應(yīng)12小時(shí)，回收連接產(chǎn)物后將回收產(chǎn)物利用氯化鈣凍融法轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5a，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含羧芐青霉素的LB培養(yǎng)平板上，從長(zhǎng)出的白色菌落中提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)并酶切驗(yàn)證，獲得中間載體pCAMBIA2300::p35S-gus-nos。進(jìn)而，用實(shí)施例1中pta基因替換中間載體上的gus基因。具體地，利用BamHI/SacI雙酶切pGEMT-easy+pta和中間載體pCAMBIA2300::p35S-gus-nos，回收pta和pCAMBIA2300::p35S-gus-nos大片段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做PCR檢測(cè)和酶切驗(yàn)證。實(shí)施例3將含pta基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株，獲得用于轉(zhuǎn)化百合的含pta基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株將含pta基因的植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA2300::p35S-pta-nos利用凍融法轉(zhuǎn)入市售的根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，含pta基因的植物雙元表達(dá)載體己被成功構(gòu)建到根癌農(nóng)桿菌菌株中。本實(shí)施例獲得了含半夏凝集素基因pta植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105(pCAMBIA2300::p35S-pta-nos)，該菌株可用于通過(guò)轉(zhuǎn)基因策略來(lái)提高百合抗蚜蟲(chóng)性的研究中。實(shí)施例4利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化百合無(wú)菌苗葉片,經(jīng)過(guò)抗生素篩選，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因百合植株1.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的pta基因轉(zhuǎn)化百合葉片1.1.外植體的獲得將麝香百合(LiliumlongiflorumThunb)"SnowQueen"的鱗莖用75%乙醇浸泡0.5min，再用20%NaClO浸泡20min后用無(wú)菌水沖洗3_4次，再用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分，將鱗片切成0.5cm2的小塊接種于誘導(dǎo)分化固體培養(yǎng)基[MS(MurashigeandSkoog,1962)+1mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.1mg/L2，4-D+30g/L蔗糖+2.6g/L植物凝膠，pH值為5.8]中，于25°C、12h/12h(light/dark)光照培養(yǎng)，即可獲得百合無(wú)菌苗。待苗長(zhǎng)至7cm左右后，剪取無(wú)菌苗葉片外植體(0.5cm2)用于轉(zhuǎn)化。1.2.農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)將所述的葉片外植體，轉(zhuǎn)到含活化好的EHA105(pCAMBIA2300::p35S-pta-nos)的液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS+1mg/LNAA+0.5mg/L6_BA+AS100Wnol/L)中共培養(yǎng)，輕搖10-15min后，將外植體用無(wú)菌紙吸干多余菌液接至固體共培養(yǎng)基上，于28'C暗培養(yǎng)3d。1.3.抗性再生植株的篩選將所述的共培養(yǎng)3d后的百合外植體轉(zhuǎn)入到發(fā)芽篩選培養(yǎng)基(MS+0.5mg/L6-BA十1rag/LIAA+75mg/LKan+250mg/LCb)上于25。C、16h/8h光照培養(yǎng)，每?jī)芍芾^代培養(yǎng)一次，經(jīng)過(guò)2-3次繼代后即可獲得Kan抗性芽。將生長(zhǎng)良好的抗性芽剪下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(1/2MS+75mg/LKan+Cb125mg/L)上培養(yǎng)至生根，從而獲得Kan抗性再生百合植株。2.轉(zhuǎn)基因百合植株的PCR檢測(cè)根據(jù)目的基因Pta核心序列設(shè)計(jì)正向引物設(shè)計(jì)和反向引物對(duì)目的基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，利用所設(shè)計(jì)的PCR特異引物，能擴(kuò)增出480bp的特異DNA片段。而以非轉(zhuǎn)化百合基因組DNA為模板時(shí)，沒(méi)有擴(kuò)增出任何片段。本實(shí)施例將所述的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化百合，獲得了經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因百合植株。實(shí)施例5對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因百合植株進(jìn)行抗蟲(chóng)性測(cè)定，最終獲得抗蚜性提高的轉(zhuǎn)基因百合植株按Yao等(Yao，丄，Pang,Y.,Qi，H.，Wan，B.，Zhao，X.，Kong,W.，Sun，X.andTangK.(2003).TransgenictobaccoexpressingPinelliaternataagglutininconfersenhancedresistancetoaphids.TransgenicResearch12(6):715-722)的方法對(duì)含半夏凝集素基因pta的轉(zhuǎn)基因百合植株(10_20厘米高)進(jìn)行蚜蟲(chóng)(桃蚜)抗性鑒定，在每株植株上接種5頭蚜蟲(chóng)三齡若蟲(chóng)，13天后測(cè)定存活的蚜蟲(chóng)數(shù)。上述實(shí)施例采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得了含基因pta的轉(zhuǎn)基因百合植株。結(jié)果表明，在含半夏凝集素基因pta的轉(zhuǎn)基因百合植株上存活的岈蟲(chóng)數(shù)量同非轉(zhuǎn)基因?qū)φ丈系南啾蕊@著減少，如表1所示，轉(zhuǎn)半夏凝集素基因pta的百合植株對(duì)蚜蟲(chóng)的抗性得以提高，說(shuō)明轉(zhuǎn)pta基因是提高百合抗蟲(chóng)性的有效方法。表1轉(zhuǎn)基因植株的抗蚜鑒定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>P<0.05序列表<110〉上海交通大學(xué)<120〉轉(zhuǎn)pta基因提高百合抗蚜蟲(chóng)性的方法〈160〉1<170〉Patentlnversion3.4〈210〉1〈211〉810<212〉DNA<213>半夏(Pinelliater皿ta)〈400〉11atggcctccaagctcctcctcttcctcctcccggccatcctcggcctcatcatcccgcgg61ccagccgtggcggtgggcaccaactacctactgtccggcgaaaccctagacacggacggc121catctgaagaatggcgacttcgactttatcatgcaggaagactgcaacgccgtcctgtac181aacggcaactggcagtccaacacggccaac已ctgcaagctcaccctcacc241gaccgcggcgagctcgtcatcaacaacggcgagggatccgccgtctggaggagcggctcc301cagtccgcgaagggc已a(bǔ)ctacgccgccgtcctccatccggggtcatctac361ggcccatccgtcttcaagatcaacccttgggtccccggcctcaacagcctgcggctcggc421aacgtccctttcacgtgcaacatgctcttctccggccaggtcctctacggcg已cggc卿481atcactgcgagctggtcatgc鄉(xiāng)gcgactgcaacctggtcctgtacggc541gggaagtgcgactggcagtcggca已cggcgagcactgcttcctccggctg601aaccac已已gggcgagctcatc已tcaaggatgacgacttcaagagc已tctggagcagccag661tccagctccaagcagggtgactacgtcttcatcctxcaggacaacggctacggcgtcatc721tacggccctgccatctgggcgaccagctcgaagcgctccgttgctgctcagg卿cgatg781atcggcatggtgacggagaaggtgaattaa權(quán)利要求1.一種轉(zhuǎn)pta基因提高百合抗蚜蟲(chóng)性的方法，其特征在于采用RT-PCR技術(shù)從半夏中克隆出半夏凝集素基因pta，構(gòu)建含pta基因的植物表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將pta基因?qū)氚俸喜⒔?jīng)過(guò)抗生素篩選獲得轉(zhuǎn)化植株；利用PCR技術(shù)檢測(cè)外源目的基因pta的整合情況，抗蟲(chóng)性試驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株的抗蚜性，最終獲得抗蚜性提高的轉(zhuǎn)基因百合植株。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)pta基因提高百合抗蚜蟲(chóng)性的方法，其特征是，包括如下具體步驟(1)采用RT-PCR技術(shù)獲得半夏凝集素基因pta;(2)將pta基因置于花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子之后，構(gòu)建成含pta基因的植物表達(dá)載體；(3)將含pta基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株，獲得用于轉(zhuǎn)化百合的含Pta基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；(4)利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化百合無(wú)菌苗葉片，經(jīng)過(guò)抗生素篩選，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因百合植株；(5)對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因百合植株進(jìn)行抗蟲(chóng)性測(cè)定，最終獲得抗蚜性提高的轉(zhuǎn)基因百合植株。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)pta基因提高百合抗蚜蟲(chóng)性的方法，其特征是，所述的經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因百合植株是指，分別設(shè)計(jì)合成pta基因核心片段的檢測(cè)引物，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，紫外線下觀察到目的條帶的陽(yáng)性植株即為轉(zhuǎn)基因百合植株。全文摘要本發(fā)明是一種生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的轉(zhuǎn)pta基因提高百合抗蚜蟲(chóng)性的方法。本發(fā)明采用RT-PCR技術(shù)從半夏中克隆出半夏凝集素基因pta，構(gòu)建含pta基因的植物表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將pta基因?qū)氚俸喜⒔?jīng)過(guò)抗生素篩選獲得轉(zhuǎn)化植株；利用PCR技術(shù)檢測(cè)外源目的基因pta的整合情況，抗蟲(chóng)性試驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株的抗蚜性，最終獲得抗蚜性提高的轉(zhuǎn)基因百合植株。本發(fā)明提供了一種提高百合抗蚜性的方法，為利用基因工程技術(shù)培育百合抗蚜品種打下了基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C12N15/82GK101302519SQ20081003957公開(kāi)日2008年11月12日申請(qǐng)日期2008年6月26日優(yōu)先權(quán)日2008年6月26日發(fā)明者唐東芹,唐克軒,月王申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)