專利名稱：黃色素生成缺陷鞘脂單胞菌及其在結(jié)冷膠生產(chǎn)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一抹黃色素生成缺陷但能生產(chǎn)正常品質(zhì)結(jié)冷膠的鞘脂單
胞菌菌株ZD001 (Sp/z/"gomo"ay取ZD001 )及其在孩t生物發(fā)酵制備結(jié)冷 膠中的應(yīng)用。 '
(二)
背景技術(shù)：
結(jié)冷膠 (Gellan Gum)是少動鞘月旨單胞菌 (559/2/"go"w"M p薦c/"w6/fo')經(jīng)好氧發(fā)酵產(chǎn)生的微生物胞外多糖，由美S Kelco公司于 1978年開發(fā)成功。它是繼黃原膠之后又一種無毒、安全、理化性質(zhì)優(yōu)良 的微生物胞外多糖。日本早在1988年就準(zhǔn)許在食品中使用，美國于1992 年獲FDA批準(zhǔn)而用于食品，我國于1996年批準(zhǔn)其作為食品增稠劑、穩(wěn) 定劑使用，另有十多個國家也已批準(zhǔn)用作食品添加劑。近年來，結(jié)冷膠以 其獨(dú)特的優(yōu)良特性，被作為新型乳化劑、懸浮劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、凝膠 劑、緩釋劑、成膜材料等日益廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等工業(yè)領(lǐng)域， 應(yīng)用前景廣闊。
結(jié)冷膠是由(3-1,3-D-葡萄糖，(3-1,4-D-葡萄糖醛酸和a-1,4-L-鼠李糖按 摩爾比2 : 1 : l組成，其以(3-l,3畫D-葡萄糖、卩-l,4-D畫葡萄糖搭酸、卩隱1,3-D-葡萄糖、a-l,4-L-鼠李糖的連接順序構(gòu)成四糖單元。在四糖單元聚合形成 的糖長鏈骨架上連有?；肿恿恳话銥?x105-lxl()S道爾頓左右。結(jié)冷 膠主要以兩種形式存在，即未經(jīng)脫酰基的高?；Y(jié)冷膠(也稱天然結(jié)冷膠) 和經(jīng)物理化學(xué)方法人工脫?；牡王；Y(jié)冷膠。高酰基天然結(jié)冷膠中有兩 種?；匆阴；透视王；?，通常乙?；B接在第一個葡萄糖殘基的
5C6位上，而甘油?；B接在同一個葡萄糖殘基的C2位上， 一般每個四糖 單元中平均含有l(wèi)個甘油?；?.5個乙?；５王；Y(jié)冷膠則是由高酰基 結(jié)冷膠通過脫?；幚砗蠖旧喜缓；漠a(chǎn)物，因此，結(jié)冷膠分子因 是否脫?；兔擋；潭炔煌?，分子量差異較大，目前在食品工業(yè)上應(yīng)用 較多的是分子量相對較低的低?；Y(jié)冷膠。
當(dāng)前生產(chǎn)所用的結(jié)冷膠產(chǎn)生菌少動鞘脂單胞菌在發(fā)酵過程中同時會 產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物黃色素(主要是類胡蘿卜色素)，這不僅與結(jié)冷膠竟?fàn)幪?源，還使發(fā)酵液變黃。在結(jié)冷膠制備過程中，尤其是在高?；Y(jié)冷膠的制 備過程中，為了去除膠體中的黃色素，增加了結(jié)冷月交4是取脫色中乙醇或異 丙醇的用量( 一般用3倍發(fā)酵液體積的'乙醇或異丙醇)與操作時間，使提 取純化的效率降低、成本提高。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一抹黃色素生成缺陷但能生產(chǎn)正常品質(zhì)結(jié)冷膠
的鞘脂單胞菌菌抹ZDOOl (5^/7/"go"w"os w. ZD001 )。該ZD001菌抹已
保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏中心地址中國武漢武漢大學(xué)，
郵政編碼430072;保藏日期2009年9月10日；寸呆藏編號CCTCCNo:
M209198。故該菌抹以下稱ZD001 ( CCTCC NO: M 209198 )菌抹。 本發(fā)明采用的技術(shù)方案
ZD001. ( CCTCC NO:M 209198 )菌林是本申請發(fā)明.人分離選育所得。 對其16S rDNA進(jìn)行測序與分子比對，其與少動鞘脂單胞菌 (S盧"g簡o廳拜"'m。M/s ) 16S rDNA核苷酸序歹'J同源性為99%以上， 認(rèn)定ZD001 (CCTCCNO: M209198)菌抹為已見報道的結(jié)冷膠產(chǎn)生菌少 動鞘脂單胞菌的同種變異抹。
6所述ZD001 (CCTCC NO: M 209198)菌株的16S rDNA序列如下:
AGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTT。所述ZD001 (CCTCCNO:M 209198)菌抹特征如下為革蘭氏陰性桿菌;無芽孢;直桿狀；在營養(yǎng)瓊脂平板上菌落呈乳白色；氧化酶試驗(yàn)陽性；接觸酶試驗(yàn)陽性；專性需氧；分解葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖；淀粉水解試-驗(yàn)陽性；不能液化明膠；43"不生長；菌體大小為1.5 5.(Vmx0.8-1.0^im;不產(chǎn)黃色素。
本發(fā)明還涉及所述的ZD0Q1 (CCTCC NO: M 209198 )菌4朱在微生物發(fā)酵制備結(jié)冷膠中的應(yīng)用。
具體的，所述應(yīng)用為將所述ZDOOl (CCTCC NO:M 209198 )菌抹按常規(guī)方法經(jīng)活化、種子培養(yǎng)后，接種至常規(guī)適用于鞘脂單胞菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，28 32°C、 pH6.8~7.2搖床培養(yǎng)32~60h,獲得含有高?；Y(jié)冷膠的發(fā)酵液。該發(fā)酵液可直接分離純化得到高?；Y(jié)冷膠，也可進(jìn)行脫?；幚碇迫〉王；Y(jié)冷膠。
制備產(chǎn)物為高酰基結(jié)冷膠時，方法如下將所述含有高酰基結(jié)冷膠的發(fā)酵液調(diào)pH值為5.0 6.0，升溫至50。C 70。C(優(yōu)選60°C )保溫30min 2h(優(yōu)選lh)后，降溫至4(TC 5(TC,調(diào)pH為7.0,加入溶菌酶和石咸性蛋白酶保溫lh 3h (優(yōu)選2h)去除蛋白質(zhì)；去除蛋白質(zhì)后的發(fā)酵液加入絮凝劑溶液進(jìn)行絮凝沉淀(絮凝劑溶液加入量約為去除蛋白質(zhì)后發(fā)酵液體積的5%),再經(jīng)分離(加入體積為發(fā)酵液體積30%左右的體積濃度卯°/0以上的異丙醇或乙醇，說選95%異丙醇，攪拌，板框壓濾)、干燥(90。C)，制得所述高酰基結(jié)冷膠，所述絮凝劑(濃度通常為20%, w/v)為下列之一或其中兩種以上的混合CaCl2、 MgCl2、 NaCl、 KC1。
制備產(chǎn)物為低酰基結(jié)冷膠時，方法如下往所述含有高?；Y(jié)冷膠的發(fā)酵液中加入堿金屬或堿土金屬氯化物溶液(濃度通常為20%， w/v)，調(diào)pH為11.0，固液分離(板框固液分離)得到纖維料1,將纖維料1與
水按1: 4~6體積比混合，調(diào)pH2.5~4.0 (優(yōu)選pH3.0 ),洗滌15min lh (優(yōu)選30min),壓濾得到纖維料2，將纖維料2與水按1: 9 12體積比混合均勻，升溫至80。C 卯。C(優(yōu)選83。C 87。C ),加入堿性試劑調(diào)pH為9.5 10.5
(優(yōu)選pH9.8 10.2 )反應(yīng)8min 15min (優(yōu)選10min 12min )，反應(yīng)結(jié)束后調(diào)反應(yīng)液pH為中性，加入助濾劑(添加量為1 3%, w/v,.優(yōu)選2%),過濾，取濾液加入絮凝劑(優(yōu)選10%質(zhì)量濃度，添加體積為濾液體積的5%)進(jìn)行絮凝沉淀，再經(jīng)分離、干燥，制得所述低?；Y(jié)冷膠；所迷堿金屬或堿土金屬氯化物為下列之一或其中兩種以上的混合CaCl2、MgCl2、NaCl、KC1 (優(yōu)選CaCl2)，所述堿性試劑為下列之一或其中兩種以上的混合NaOH、 KOH、 Na3P04,所述助濾劑為硅藻土、珍珠巖或其混合物，所述絮凝劑為下列之一或其中兩種以上的混合CaCl2、 MgC"、 NaCl、 KC1
(優(yōu)選KC1)。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:提供了 一抹黃色素生成缺陷的鞘脂單胞菌ZDOOl (CCTCCNO:M 209198)菌林，其發(fā)酵液不含黃色素而呈乳白色，提取時可減少乙醇或異丙醇用量，簡化工序，提高得率，降低成本，利于工業(yè)化生產(chǎn)獲得優(yōu)質(zhì)的結(jié)冷膠。具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此
實(shí)施例1: ZD001 (CCTCC NO: M 209198)菌林的分離及鑒定1、無菌采集土壤樣品，稀釋涂布于YM瓊脂培養(yǎng)基平板上；
92、 該平板置于30。C培養(yǎng)5天；
3、 挑取不同形態(tài)的細(xì)菌菌落，于相同培養(yǎng)基平板分別劃線純化分離，置于30。C培養(yǎng)5天。
YM瓊脂培養(yǎng)基終濃度組成為0.30%酵母抽提物，0.30%麥芽抽提物，
0. 50、蛋白胨，1.00%葡萄糖，瓊脂1.50% ,溶劑為蒸餾水。
注本發(fā)明中培養(yǎng)基濃度均指質(zhì)量體積百分比濃度，某組分濃度1%表示100mL培養(yǎng)基中含有l(wèi)g該物質(zhì)
經(jīng)篩選獲得一4朱黃色素生成缺陷的ZD001 (CCTCCNO:M209198)菌抹。該菌為革蘭氏陰性桿菌;無芽孢;直桿狀；在營養(yǎng)瓊脂平板上菌落呈乳白色；氧化酶試驗(yàn)陽性；'接觸酶試驗(yàn)陽性；專性需氧；分解葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖；淀粉水解試驗(yàn)陽性;不能液化明膠；43。C不生長；菌體大小為1.5-5.0(imx 0.8-1.0|im;不產(chǎn)黃色素。
實(shí)施例2: ZD001 ( CCTCC NO: M 209198 )的發(fā)酵工藝
1、 純菌種接種于YPG培養(yǎng)基斜面上，30。C培養(yǎng)72h;
2、 一級種子培養(yǎng)將斜面種子接入50mL—級種子培養(yǎng)基(盛于250mL三角瓶)，于30。C， 200rpm振蕩培養(yǎng)24h,即為一級種子液；
3、 二級種子培養(yǎng)將一級種子液以5%體積比的接種量接入100mL二級種子培養(yǎng)基(盛于500mL三角瓶)，于30。C， 200rpm振蕩培養(yǎng)12h，即為二級種子液；
4、 罐上發(fā)酵將二級種子液以5%體積比的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C、 pH6.8~7.2條件下，通風(fēng)1. Ovvm，轉(zhuǎn)速300rpm,培養(yǎng)48小時；
5、 收集發(fā)酵產(chǎn)物收集步驟4培養(yǎng)48小時的含結(jié)冷膠發(fā)酵液。
YPG斜面培養(yǎng)基組成與終濃度為葡萄糖2.00%,蛋白胨0.50%,酵母抽提物0.30%,瓊脂1.50% ，溶劑為蒸餾水，pH7.2;
一級種子培養(yǎng)基終濃度組成為酵母膏0.20%;牛肉膏0.30%;蛋白胨0.50%;氯化鉀0.10%,溶劑為蒸餾水，pH7.2;
二級種子培養(yǎng)基葡萄糖1.50%;酵母膏.0.50%;蛋白胨0.50%;磷酸二氬鉀0.06%;磷酸氫二鉀0.06%;硫酸鎂0.06%,溶劑為蒸餾水，pH7.2;
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖3.00%;酵母膏0.05%;蛋白胨0.30%;磷酸二氬鉀0.06%;磷酸氫二鉀0.10%;硫S吏鎂0.06%;溶劑為蒸餾水，pH7.2。
實(shí)施例3:高?；Y(jié)冷膠的制備工藝
1、 發(fā)酵液預(yù)處理發(fā)酵液100L,用10。/。(v/v)的HCl調(diào)pH6,0,升溫至60。C,保溫lh;
2、 蛋白雜質(zhì)去除降溫至40。C時，用10o/。(w/v)NaOH調(diào)pH7.0，加入50g的溶菌酶(20萬U/g,龐博生物)及100g的堿性蛋白酶(2萬U/g，龐博生物)，保溫2h;
3、 絮凝沉淀，分離經(jīng)過預(yù)處理及蛋白去雜處理后的發(fā)酵液中加入5L濃度為20% (w/v)的CaCl2溶液，攪拌30min后，加入30L異丙醇，繼續(xù)攪拌lh后，板框壓濾；
4、 干燥、粉碎壓濾所得纖維料90。C干燥2h后粉碎，制得高酰基結(jié)冷膠成品，為乳白色粉末，含氮量為0.05 0.30%。
實(shí)施例4:脫酰結(jié)冷膠的制備工藝 .
1、發(fā)酵液預(yù)處理取成熟發(fā)酵液100L，加入3L濃度為20。/。(w/v)的CaCl2溶液，攪拌10min后用10。/。NaOH調(diào)pH至11.0,攪拌3min后板框壓濾，得
纖維料；2、 洗滌將步驟l預(yù)處理后的纖維料與水按l: 5的體積比混合，用10%HC1 調(diào)pH3.0,攪拌30min后板框壓濾，得纖維料。
3、 脫?；幚韺⒉襟E2洗滌后的纖維料與水按1: IO的體積比混合，攪 拌均勻，升溫至90。C左右，使纖維料完全溶解，維持溫度85。C，加入10% NaOH水溶液，調(diào)pH值9.5 10.5,反應(yīng)10min后，用10。/。HCl調(diào)pH6.0;
4、 加入質(zhì)量為料液體積2%的硅藻土，維持溫度80。C以上板框過濾后加入 料液(濾過液)體積5。/。的KCl溶液(質(zhì)量濃度為10%)，板框壓搾；
5、 干燥、粉碎壓榨所得結(jié)冷膠纖維料90。C干燥2h后粉碎，制得低?；?結(jié)冷膠成品。所得的低?；Y(jié)冷膠為乳白色粉末，強(qiáng)度》800g/cm2,透 光率> 80%。 'SEQUENCE LISTING
<110>浙江大學(xué)
浙江中肯生物科技有限公司
<120>黃色素生成缺陷鞘脂單胞菌及其在結(jié)冷膠生產(chǎn)中的應(yīng)用
<130>
<160> 1
<170> Patentln version 3.4
<210> 1
<211> 1481
<212〉 DNA
<213〉 Sphingoraonas sp.
<400> 1
agagtttgatCCtggCtCELggg.cggcatgc60
gagatccttcggggtctagtggcgcacgggtgcgtaacgcgtgggaatctgccUggggt120
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tcgccctgagatgagcccgcgtaggattagctagttggtggcaccaaggc240
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gt鄉(xiāng)ggaacctgcggctggatcacctcctt148權(quán)利要求
1.一株黃色素生成缺陷鞘脂單胞菌(Sphingomonas sp.)ZD001，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，430072，保藏日期2009年09月10日，保藏編號CCTCC NoM 209198。
2. 如權(quán)利要求1所述的鞘脂單胞菌，其特征在于所述鞘脂單胞菌的16S rDNA序列'如下GGGAACCTGCGGCTGGATC ACCTCCTT 。
3. 如權(quán)利要求1所述的鞘脂單胞菌，其特征在于所述鞘脂單胞菌菌抹特 征如下為革蘭氏陰性桿菌；無芽孢；直桿狀；在營養(yǎng)瓊脂平板上菌 落呈乳白色；氧化酶試驗(yàn)陽性；接觸酶試驗(yàn)陽性；專性需氧；分解葡 萄糖、果糖、木糖、蔗糖；淀粉水解試驗(yàn)陽性；不能液化明月交；43°C 不生長;菌體大小為1.5 5.0pmx0.8-1.0^im;不產(chǎn)黃色素。'
4. 如權(quán)利要求1所述的鞘脂單胞菌在微生物發(fā)酵制備結(jié)冷膠中的應(yīng)用。
5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為將所述鞘脂單胞 菌菌抹經(jīng)活化、種子培養(yǎng)后，接種至適用于鞘脂單胞菌的發(fā)酵培養(yǎng)基， 28 32°C、 pH6.8~7.2搖床培養(yǎng)32~60h,獲得含有高酰基結(jié)冷膠的乳白 色發(fā)酵液。
6. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述含有高酰基結(jié)冷膠的發(fā)酵 液經(jīng)分離純化，制得高酰基結(jié)冷膠；所述分離純化方法如下含有高 酰基發(fā)酵液調(diào)pH值為5.0~6.0,升溫至50。C 70。C保溫30min 2h后， 降溫至40。C 50。C,調(diào)pH為.7.0,加入〗容菌酶和i咸性蛋白酶保溫lh 3h 去除蛋白質(zhì)；去除蛋白質(zhì)后的發(fā)酵液加入絮凝劑溶液進(jìn)行絮凝沉淀， 再經(jīng)夯離、干燥，制得所述高?；Y(jié)冷膠，所述智凝劑為下列之一或 其中兩種以上任意比例的混合CaCl2、 MgCl2、 NaCl、 KC1。
7. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述含有高?；Y(jié)冷膠的發(fā)酵液經(jīng)脫?；幚砗?、再經(jīng)分離純化制得低?；Y(jié)冷膠，所述的低?；Y(jié)冷膠的制備方法如下含有高酰基結(jié)冷膠的發(fā)酵液加入堿金屬或堿 土金屬氯化物溶液，調(diào)pH為ll.O，固液分離得到纖維料l,將纖維料 1與水按1: 4 6體積比混合，調(diào)pH2.5 4.0，洗滌15min lh，壓濾得 到纖維料2,將纖維料2與水按1: 9 12體積比混合均勻，升溫至 80。C 90。C，加入堿性試劑調(diào)pH為`9.5 10.5反應(yīng)8min 15min，反應(yīng)結(jié) 束后調(diào)反應(yīng)液pH為'中性，加入助濾劑，過濾，取濾液加入絮凝劑進(jìn)行 絮凝沉淀，再經(jīng)分離、干燥，制得所述低?；Y(jié)冷膠；所述堿金屬或 堿土金屬氯化物為下列之一或其中兩種以上的混合CaCl2、 MgCl2、 NaCl、 KC1，所述堿性試劑為下列之一或其中兩種以上的混合NaOH、 KOH、 Na3P04,所述助濾劑為硅藻土、珍珠巖或其混合，所述絮凝劑 為下列之一或其中兩種以上的混合CaCl2、 MgCl2、 NaCl、 KC1。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株黃色素生成缺陷鞘脂單胞菌(Sphingomonassp.ZD001)及其在微生物發(fā)酵制備結(jié)冷膠中的應(yīng)用。該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，430072，保藏日期2009年09月10日，保藏編號CCTCC NoM 209198。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在該菌株發(fā)酵液不含黃色素而呈乳白色，只需用少量的乙醇或異丙醇沉淀多糖，即可得到無色優(yōu)質(zhì)的結(jié)冷膠，可使結(jié)冷膠生產(chǎn)簡化后續(xù)提純脫色工藝，提高得率，降低生產(chǎn)成本。
文檔編號C12N1/20GK101665778SQ20091015300
公開日2010年3月10日 申請日期2009年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月25日
發(fā)明者吳榮明, 吳雪昌, 亮 朱, 歐 李, 錢朝東, 梅 陳, 陳亞敏 申請人:浙江大學(xué);浙江中肯生物科技有限公司