禾谷縊管蚜gapdh內(nèi)參基因部分序列、克隆方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及“禾谷縊管蚜GAPDH內(nèi)參基因部分序列、克隆方法及應(yīng)用”屬分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及禾谷縊管蚜內(nèi)參基因GAPDH，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本發(fā)明所獲得的禾谷縊管蚜內(nèi)參基因GAPDH（999bp）的核苷酸序列可作為今后研究禾谷縊管蚜功能基因或在不同發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)，以及作為傳毒介體時(shí)病毒在其體內(nèi)表達(dá)的相對(duì)水平的內(nèi)參基因。
【專利說明】禾谷縊管蚜GAPDH內(nèi)參基因部分序列、克隆方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及禾谷縊管蚜參照基因GAPDH基因部分序列、克隆方法及其作為內(nèi)參基因在RT-qPCR中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]禾谷纟益管姆(Rhopalosiphum padi L., RP)隸屬于同翅目姆科(Homoptera:Aphididae)。這種姆蟲在世界范圍廣泛分布,是禾本科植物重要的害蟲之一。除了能通過吸食植株?duì)I養(yǎng)而直接影響谷物產(chǎn)量外，它主要是作為禾本科作物和雜草病毒病的傳播介體造成危害。禾谷縊管蚜以持久性非增殖方式傳播黃矮病毒，是黃癥病毒科黃癥病毒屬多種大麥黃矮病毒的優(yōu)勢(shì)傳毒介體。
[0003]在禾谷縊管蚜刺吸取食受黃矮病感染的植株韌皮部汁液的同時(shí)，它也取食到了存在于韌皮部病毒粒體。在介體蚜蟲的中腸和/或后腸以及唾液腺中發(fā)生受體介導(dǎo)的胞吞胞吐。黃矮病在寄主植物體內(nèi)的增殖一般地采用絕對(duì)和相對(duì)定量的方法，但是還沒有關(guān)于在獲毒期，接毒期以及影響傳毒效率、傳毒周期田間植物病毒流行的所有關(guān)鍵時(shí)期的介體體內(nèi)病毒的滴度和積累變化的研究報(bào)道。病毒進(jìn)入介體蚜蟲體內(nèi)后，伴隨著無數(shù)的基因表達(dá)呈上調(diào)或下調(diào)，許多蛋白通過一種轉(zhuǎn)胞吞的方式被整合成與病毒傳播相關(guān)。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)，我們能迅速地評(píng)價(jià)分子功能和生物學(xué)過程中病毒的影響以及病毒的實(shí)時(shí)濃度。
[0004]近年來，定量PCR(qPCR)中相對(duì)定量的方法較為流行，它消除了在實(shí)驗(yàn)處理間、RNA提取效率及RNA完整性 方面等系統(tǒng)誤差，應(yīng)用到了分子研究工作的許多方面。在生物體中，看家基因(House-keeping gene)在所有細(xì)胞中都是保守的,在正?；蚍钦Ｇ闆r下都是持續(xù)表達(dá)的。因此，在RT-qPCR實(shí)驗(yàn)中，選擇適合的、可信的看家基因做為內(nèi)參基因是必不可少的。隨著果妮(Drosophila melanogaster)和小菜蛾(Plutella xylostella L.)等不同的昆蟲全基因組序列的發(fā)表，尋找看家基因做為內(nèi)參基因成為這些完全變態(tài)昆蟲的研究重點(diǎn)之一。在運(yùn)用RT-qPCR分析昆蟲基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中通常用下列內(nèi)參基因，如18S rRNA, ACTl, EF-1 a，GAPDH, UBI, RPSs, RPLs和TUB等。對(duì)于不完全變態(tài)昆蟲，特別是傳播多種植物病毒的姆蟲，近年來開展了大豆姆(Aphis glycines)看家基因的研究。對(duì)于監(jiān)測(cè)介體禾谷縊管蚜體內(nèi)病毒粒體的變化，用RT-qPCR確定病毒基因表達(dá)的相對(duì)水平，還沒有找到有效適用的看家基因。盡管有研究中ACTl基因已被用來做為檢測(cè)禾谷縊管蚜中兩種植物病毒的內(nèi)參基因，但這個(gè)基因?qū)嶋H上是來源于家蠶(Bombyx mori)的。GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)是糖酵解反應(yīng)中的一個(gè)酶，由4個(gè)30~40kDa的亞基組成，分子量146kDa。該基因幾乎在所有組織中都高水平表達(dá)，在同種細(xì)胞或者組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)量一般是恒定的，故被廣泛用作real time PCR實(shí)驗(yàn)操作的管家基因。但禾谷縊管蚜的GAPDH基因的克隆和作為內(nèi)參基因的應(yīng)用在國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明提供禾谷縊管蚜GAPDH基因片段，可作為禾谷縊管蚜內(nèi)參基因的應(yīng)用。
[0006]并同時(shí)提供克隆禾谷縊管蚜的GAPDH的特異性引物，建立基于SYBR GreenI染料技術(shù)的RT-qPCR方法，從而為禾谷縊管蚜的GAPDH作為內(nèi)參基因，在利用qPCR對(duì)禾谷縊管蚜功能基因或作為傳毒介體病毒在體內(nèi)增殖變化的研究中提供有用的方法。
[0007]禾谷縊管蚜GAPDH基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID Nol所示。
[0008]一種禾谷縊管蚜GAPDH基因的部分序列的克隆方法，提取禾谷縊管蚜基因組總RNA,采用弓丨物GAPDH進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，以產(chǎn)物第一鏈cDNA作為模板、以引物對(duì)GAPDH F/GAPDHR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到陽(yáng)性克隆，最后經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。其中引物序列為:
[0009]GAPDH F:5/ -ATGTCAAACATTGGTATCAATGGATTTGG-3'；
[0010]GAPDH R:5/ -TTTAATCCTTAGATTGCATGTACTTGAT-3'。
[0011]所獲得的目的片段大小為999bp。
[0012]所述PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下:94°C 3min, [94°C 45s,58°C lmin、72°C lmin]30 個(gè)循環(huán)，72°C延長(zhǎng)10min，4°C保存。 [0013]本發(fā)明還提供一種qPCR擴(kuò)增GAPDH基因部分序列的方法，抽提禾谷縊管蚜基因組總RNA，以試劑盒中自帶的引物混合物為引物進(jìn)行RT反應(yīng)，然后以產(chǎn)物第一鏈cDNA作為模板進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，熒光染料為SYBR Green I，其中定量PCR擴(kuò)增中的禾谷縊管蚜的定量引物，其序列為:
[0014]QGAPDH F:5/ -ACTACTGTTCACGCTACCACCG-3'；
[0015]QGAPDH R:5/ -GCTGCTTCCTTGACCTTACCTT-3'。
[0016]所獲得的目的片段大小為272bp。
[0017]所述定量PCR擴(kuò)增采用兩步法，即在95 °C預(yù)變性15min之后，先運(yùn)行40個(gè)循環(huán)的 95°C 10sec,59.2°C 32sec，72°C 32sec，再運(yùn)行溶解曲線階段的 95°C 15sec，60°C lmin,95°C 30sec,60°C 15sec。
[0018]禾谷縊管蚜GAPDH基因片段作為內(nèi)參基因應(yīng)用于禾谷縊管蚜功能基因或介體內(nèi)黃矮病毒基因表達(dá)定量PCR檢測(cè)的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明根據(jù)NCBI其它昆蟲的核苷酸序列，克隆了禾谷縊管蚜的GAPDH看家基因的部分序列。設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性的定量引物，建立基于SYBR GreenI染料技術(shù)的RT-qPCR方法，從而為禾谷縊管蚜的GAPDH作為內(nèi)參基因，在利用qPCR對(duì)禾谷縊管蚜功能基因或作為傳毒介體病毒在體內(nèi)增殖變化的研究中提供有用的方法。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0021]1.本發(fā)明首次克隆得到禾谷縊管蚜的GAPDH基因片段。
[0022]2.本發(fā)明首次提出在禾谷縊管蚜定量PCR檢測(cè)中建立通用的內(nèi)參基因；
[0023]3.本發(fā)明首次提出將禾谷縊管蚜的GAPDH基因作為內(nèi)參基因在禾谷縊管蚜不同發(fā)育時(shí)期的定量PCR檢測(cè)；
[0024]4.本發(fā)明提出的禾谷縊管蚜的GAPDH基因作為內(nèi)參基因可以相對(duì)定量黃矮病毒的基因在介體中的相對(duì)表達(dá)水平；
[0025]5.本發(fā)明提出的檢測(cè)引物具有特異性，優(yōu)化了 PCR擴(kuò)增程序，大大的提高了檢測(cè)效率、縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)結(jié)果的可信度?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0026]圖1.禾谷縊管蚜GAPDH內(nèi)參基因的PCR電泳圖；
[0027]其中:M代表 DL2000DNA Marker,從上到下依次為 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp,250bp,
[0028]IOObp ; I~4泳道為4次重復(fù)。
[0029]圖2-1.禾谷縊管蚜GAPDH內(nèi)參基因的溶解曲線(無翅成蚜)；
[0030]其中:橫坐標(biāo)代表在溶解曲線擴(kuò)增階段，從60°C到95°C之間的溫度范圍；縱坐標(biāo)代表SYBRGreen I熒光染料結(jié)合到GAPDH目標(biāo)片段的雙鏈DNA后，進(jìn)入溶解曲線擴(kuò)增階段，隨溫度升高，被ROX標(biāo)準(zhǔn)化后的SYBR Green I熒光信號(hào)值即Rn的導(dǎo)數(shù)值，峰值指在所對(duì)應(yīng)的溫度下Rn急劇降低的拐點(diǎn)處的導(dǎo)數(shù)值，
[0031]圖2-2.禾谷縊管蚜GAPDH內(nèi)參基因的溶解曲線(有翅成蚜)；[0032]其中:橫坐標(biāo)代表在溶解曲線擴(kuò)增階段，從60°C到95°C之間的溫度范圍；縱坐標(biāo)代表SYBRGreen I熒光染料結(jié)合到GAPDH目標(biāo)片段的雙鏈DNA后，進(jìn)入溶解曲線擴(kuò)增階段，隨溫度升高，被ROX標(biāo)準(zhǔn)化后的SYBR Green I熒光信號(hào)值即Rn的導(dǎo)數(shù)值，峰值指在所對(duì)應(yīng)的溫度下Rn急劇降低的拐點(diǎn)處的導(dǎo)數(shù)值，
[0033]圖3-1.禾谷縊管蚜GAPDH內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(無翅成蚜)；
[0034]其中:橫坐標(biāo)代表對(duì)cDNA模板不同稀釋濃度下的量化值，從左到右表示cDNA濃度按梯度依次升高；縱坐標(biāo)代表在這些稀釋濃度下擴(kuò)增GAPDH，Rn超過閾值，開始進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期的循環(huán)數(shù)，即定量循環(huán)數(shù)Cq，曲線擬合方程為y= - 3.416X+30.936 (相關(guān)系數(shù)R2=L 000)，代表擴(kuò)增效率E為96.216%。
[0035]圖3-2.禾谷縊管蚜GAPDH內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(有翅成蚜)；
[0036]其中:橫坐標(biāo)代表對(duì)cDNA模板不同稀釋濃度下的量化值，從左到右表示cDNA濃度按梯度依次升高；縱坐標(biāo)代表在這些稀釋濃度下擴(kuò)增GAPDH，Rn超過閾值，開始進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期的循環(huán)數(shù)，即定量循環(huán)數(shù)Cq，曲線擬合方程為y= - 3.453X+30.962 (相關(guān)系數(shù)R2=0.999)，代表擴(kuò)增效率E為94.814%。
[0037]圖4-1.禾谷縊管蚜GAPDH內(nèi)參基因的擴(kuò)增曲線(無翅成蚜)；
[0038]其中:橫坐標(biāo)代表qPCR擴(kuò)增GAPDH時(shí)的循環(huán)數(shù)；縱坐標(biāo)代表在對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)下的Rn值。
[0039]圖4-2.禾谷縊管蚜GAPDH內(nèi)參基因的擴(kuò)增曲線(有翅成蚜)；
[0040]其中:橫坐標(biāo)代表qPCR擴(kuò)增GAPDH時(shí)的循環(huán)數(shù)；縱坐標(biāo)代表在對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)下的Rn值。
[0041]圖5.BYDV-PAV CP基因在有翅成蚜中的相對(duì)表達(dá)量；
[0042]其中:橫坐標(biāo)代表有翅成蚜取食帶毒植株的時(shí)間間隔，從左到右時(shí)間依次增長(zhǎng)；縱坐標(biāo)代表BYDV-PAV CP基因相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量，柱狀圖和誤差線代表每個(gè)時(shí)間間隔處3個(gè)重復(fù)樣品的相對(duì)表達(dá)量平均值M和平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(土SE)。
[0043]圖6.BYDV-PAV CP基因在無翅成蚜中的相對(duì)表達(dá)量；
[0044]其中:橫坐標(biāo)代表無翅成蚜取食帶毒植株的時(shí)間間隔，從左到右時(shí)間依次增長(zhǎng)；縱坐標(biāo)代表BYDV-PAV CP基因相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量，柱狀圖和誤差線代表每個(gè)時(shí)間間隔處3個(gè)重復(fù)樣品的相對(duì)表達(dá)量的平均值M和平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(土SE)。【具體實(shí)施方式】
[0045]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。
[0046]實(shí)施例1.禾谷縊管蚜GAPDH基因的克隆
[0047]1.1.禾谷縊管蚜總RNA提取:
[0048]采用TRIzol (Amion, USA)法提取禾谷縊管蚜(無翅成蚜)的總RNA，具體方法如下:
[0049]根據(jù)研磨樣品時(shí)所用的工具不同(使用無RNase/DNase的進(jìn)口產(chǎn)品)，RNA的提取過程為:將約0.05~0.1g新鮮樣品或冰凍的禾谷縊管蚜在液氮中充分研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移入液氮冷凍過的1.5mL離心管中，然后加入lmLTRIzol，劇烈搖晃混勻，冰上靜置5min ；4°C, 12, OOOrpm離心IOmin ;吸取上清到新的1.5mL離心管中，加入200 μ I氯仿,用力搖15s,冰上靜置5min。4°C, 12，OOOrpm離心IOmin ;將上層上清轉(zhuǎn)入到新的離心管,加入400 μ L氯仿上清,劇烈搖晃混勻,冰上靜置SminafC, 12, OOOrpm離心IOmin ;將上清轉(zhuǎn)入新的離心管，加入與上清等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，4°C過夜沉淀；4°C，12，OOOrpm離心15min，去上清；加入ImL預(yù)冷的75%乙醇(滅菌的DEPC水配制)，洗滌沉淀。4°C，12，OOOrpm離心5min重復(fù)上述洗漆步驟，以徹底洗干凈鹽分；棄上清，4°C, 12，OOOrpm離心lmin,用槍頭盡量吸出上清。在通風(fēng)廚中，開口朝上，干燥5~lOmin。用50 μ L滅菌的DEPC水溶解。將I μ L原始樣品稀釋10倍或100倍后，取5 μ L進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA樣品的完整性檢測(cè)。并取I μ L RNA用NanoDrop-2000紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品的純度和濃度值。合格樣品置于_70°C冰箱保存待用。
[0050]1.2.PCR擴(kuò)增引物序列
[0051]GADPH 的上游引物(SEQ ID N02):5' -ATGTCAAACATTGGTATCAATGGATTTGG-3'；
[0052]GADPH 的下游引物(SEQ ID N03):5' -TTTAATCCTTAGATTGCATGTACTTGAT-3'。
[0053]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0054]1.3.反轉(zhuǎn)錄(RT)
[0055]以蚜蟲總RNA(濃度在0.05~I μ g/μ L)為模板，利用目標(biāo)基因的下游引物來合成第一鏈cDNAJSyL反轉(zhuǎn)錄體系設(shè)置和反應(yīng)過程按以下步驟:首先加入DEPC ddH207yL，下游引物(5 μ Μ) 0.5 μ L，總RNAl μ L，短暫離心混勻后，75°C溫浴IOmin,迅速置于冰上5min。DEPCddH203.5 μ L, dNTPs (2.5mM) 5 μ L, 5 X RT reaction buffer5 μ L, M-MLV (200U/ μ 12 μ L，Recombinant RNase Inhibitor (RRI, 40U/ μ L) I μ L?；旌衔锒虝弘x心混勻后，42°C溫浴 Ih,95°C失活5min，迅速置于冰上。所得到的第一鏈cDNA立即進(jìn)行PCR或_20°C保存。
`[0056]1.4.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
[0057]以RT得到的第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有PCR均采用以下25 μ L反應(yīng)體系:ddH2017y L，10ΧΕΧ Taq PCR buffer2.5 μ L, dNTPs (2.5mM) 2 μ L，上游引物(5 μ Μ)
0.25 μ L,下游引物(5 μ Μ) 0.25 μ L，ExTaq0.5 μ L, cDNA2.5 μ L。PCR 反應(yīng)程序設(shè)置為:94°C預(yù)變性3min，然后30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性45sec，56°C退火lmin，和72°C延伸lmin，循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行72°C補(bǔ)充延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)檢測(cè)目的片段(圖1)。[0058]1.5.目的基因的獲得
[0059]對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收，純化后的DNA片段連接到pMD18T simple vector載體上，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，經(jīng)過PCR檢測(cè)的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，得到GAPDH的核苷酸序列(具體序列見SEQ ID N0.1)。
[0060]實(shí)施例2.GAPDH基因在禾谷縊管蚜兩種不同蟲態(tài)中的特異性RT-qPCR的檢測(cè)
[0061]2.1.樣品制備
[0062]分別以禾谷縊管蚜的兩種不同蟲態(tài)(有翅成蚜和無翅成蚜)提取的總RNA為模板，具體提取方法詳見實(shí)施例1中1.1所述。
[0063]2.2.qPCR擴(kuò)增弓丨物合成
[0064]qPCR 擴(kuò)增上游引物(SEQ ID N04):5/ -ACTACTGTTCACGCTACCACCG-3'；
[0065]qPCR 擴(kuò)增下游引物(SEQ ID N05):5/ -GCTGCTTCCTTGACCTTACCTT-3'。
[0066]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(PAGE純化法)。
[0067]2.3.熒光定量 PCR (RT-qPCR)
[0068]利用兩步法來進(jìn)行RT-qPCR,在 7500real time PCR 儀(Applied Biosystems)運(yùn)行。RT部分利用北京天根(TIANGEN)公司的試劑盒FastQuant RT Kit (with gDNase),以蟲牙蟲材料提取的總RNA為 模板，以試劑盒中自帶的引物混合物(包括Oigo dT Primer和Random6mers)為引物進(jìn)行RT反應(yīng)，來獲取第一鏈cDNA。再利用基于SYBR Green I染料的qPCR來檢測(cè)目標(biāo)基因，所用反應(yīng)體系和程序參考TIANGEN公司的SuperReal PreMixPlus(SYBR Green)試劑盒的說明書。PCR反應(yīng)體系為20 μ L，其中2X SuperReal PreMixPluslOy L,上下游定量引物 10ymol/L 各 0.6μ L，模板 cDNA (IOng/μ L) 2 μ L, 50XROXReference Dye0.4 μ L，用滅菌雙蒸水補(bǔ)齊至20 μ L，其余按照說明書進(jìn)行。定量PCR擴(kuò)增采用兩步法，即在95°C預(yù)變性15min之后，先運(yùn)行40個(gè)循環(huán)的95°C 10sec,59.2°C 32sec，72°C 32sec，再運(yùn)行溶解曲線階段的 95°C 15sec，60°C lmin,95°C 30sec,60°C 15sec。得到熔解曲線(melting curve)(圖 2_1、2_2)、定量循環(huán)數(shù)(quantification cycle, Cq)(圖 3-1、3-2)和擴(kuò)增曲線(amplification plot)(圖4_1、4_2)用于后期分析。
[0069]2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0070]本發(fā)明按照定量PCR反應(yīng)程序?qū)?0ng含量的禾谷縊管蚜的無翅成蚜和有翅成蚜基因組RNA樣品進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，并結(jié)合溶解曲線來判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。一般理想的熔解曲線應(yīng)該是單峰型曲線，如果出現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上的峰，說明有引物二聚體等非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生。從引物的溶解曲線分析得出，無翅成蚜和有翅成蚜基本都呈現(xiàn)單峰性曲線，且峰值都高于引物二聚體的峰(750C左右)，在80°C處開始起峰，830C處峰值最高，85~86°C之間落峰，說明本發(fā)明涉及的定量擴(kuò)增引物(SEQ ID No4和5)擴(kuò)增條帶單一，特異性強(qiáng)，沒有非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)。本發(fā)明從兩組不同蟲態(tài)(無翅成蚜和有翅成蚜)的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線可以看出，該對(duì)引物在模板的不同稀釋濃度下進(jìn)行擴(kuò)增，DNA數(shù)量都經(jīng)歷了典型的擴(kuò)增過程(包括基線、指數(shù)增長(zhǎng)期、線性期和平臺(tái)期)，說明該對(duì)引物可以用于擴(kuò)增無翅成蚜和有翅成蚜兩種蟲態(tài)體內(nèi)的GAPDH基因。標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程分別為I二 - 3.416x+30.936 (相關(guān)系數(shù)R2=1.000)，和y= — 3.453x+30.962(相關(guān)系數(shù)R2=0.999)，根據(jù)公式擴(kuò)增效率E=10H/#W)-1，得出該對(duì)引物對(duì)無翅成蚜和有翅成蚜兩種蟲態(tài)體內(nèi)GAPDH基因的擴(kuò)增效率E分別為
[0071]96.216%和94.814%。說明該對(duì)引物的擴(kuò)增效率很高，已接近100%。[0072]實(shí)施例3.作為檢測(cè)蚜蟲體內(nèi)大麥黃矮病毒(BYDV-PAV) CP基因相對(duì)表達(dá)的內(nèi)參基因
[0073]3.1.樣品制備
[0074]無毒的禾谷縊管蚜有翅成蚜和無翅成蚜取食感染BYDV-PAV的燕麥植株，在取食時(shí)間間隔為12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h時(shí)分別取樣。每個(gè)取食時(shí)間間隔處，每種翅型的蚜蟲取8頭，合在一起作為一個(gè)樣品提取RNA。整體實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。所有樣品的RNA提取方法詳見實(shí)施例1中1.1所述。
[0075]3.2.CP基因的qPCR擴(kuò)增引物合成
[0076]qPCR 擴(kuò)增上游引物(SEQ ID N06):5/ -CGGGGCTGAGGTATTCGTAT-3'；
[0077]qPCR 擴(kuò)增下游引物(SEQ ID N07):5/ -AGGACTTTGAGGCGGATTTG-3'。
[0078]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(PAGE純化法)。
[0079]3.3.RT-qPCR 擴(kuò)增
[0080]GAPDH基因的RT-qPCR擴(kuò)增方法見實(shí)施例2中2.3所述，每個(gè)樣品的GAPDH Cq值(Cqre)用于相對(duì)定量分析。CP基因的RT-qPCR擴(kuò)增使用引物對(duì)Q CP F和Q CP R，其他試劑的使用和RT-qPCR的反應(yīng)程序與GAPDH基因的RT-qPCR擴(kuò)增方法完全一致，每個(gè)樣品的CP Cq值(Cqtogrt)用于相對(duì)定量分析。
[0081 ] 3.4.BYDV-PAV CP基因的相對(duì)表達(dá)量
[0082]每個(gè)樣品中CP基因的相對(duì)表達(dá)量(Relative Quantification,RQ)使用一下系列公式進(jìn)行計(jì)算得到。
[0083]Δ Cqtarget=HiinCq`


target

-SampleCqtarget I
[0084]Qm = ￡tara/Cq零
[0085]Δ Cqre=minCqre-sampIeCqre 3
[0086]Qii: - ^ACqre ^
r ? 紹⑶-get
[0087]RU --— ,

5
[0088]其中E，=E+1
[0089]通過上述公式計(jì)算，有翅成蚜在不同時(shí)間間隔內(nèi)取食帶毒植株，體內(nèi)的BYDV-PAVCP基因相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量如圖5 ;無翅成蚜在不同時(shí)間間隔內(nèi)取食帶毒植株，體內(nèi)的BYDV-PAV CP基因相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量如圖6。
[0090]3.5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0091]隨著蚜蟲(禾谷縊管蚜無翅成蚜或有翅成蚜)在帶毒燕麥上取食時(shí)間間隔的增長(zhǎng)，BYDV-PAV CP基因的相對(duì)表達(dá)量也逐漸增加，并且都在取食時(shí)間間隔為72h之后開始呈波動(dòng)狀態(tài)。這種情況與BYDV植物病毒在蚜蟲體內(nèi)的積累和循環(huán)方式相一致:在飼毒初期(一般在蚜蟲飼毒48h左右就可以傳毒)，BYDV逐漸積累于蚜蟲的腸道，然后穿過腸道壁進(jìn)入血淋巴和(副)唾液腺，此階段病毒在蚜蟲體內(nèi)都呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；飼毒后期(48h之后接著飼毒)，部分BYDV隨蚜蟲的唾液會(huì)再分泌到植物之內(nèi)，此階段病毒含量略降低；蚜蟲繼續(xù)取食帶毒植株，病毒含量又會(huì)增加，如此循環(huán)下去。最終表明，GAPDH基因在禾谷縊管蚜體內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定，可作為定量蚜蟲體內(nèi)植物病毒的內(nèi)參基因。
【權(quán)利要求】
1.禾谷縊管蚜GAPDH基因片段，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
2.一種禾谷縊管蚜GAPDH基因的部分序列的克隆方法，提取禾谷縊管蚜基因組總RNA，采用引物GAPDH進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，以產(chǎn)物第一鏈cDNA作為模板、以引物對(duì)GAPDH F/GAPDHR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到陽(yáng)性克隆，最后經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。其中引物序列為: GAPDH F:5/ -ATGTCAAACATTGGTATCAATGGATTTGG-3'；
GAPDH R:5/ -TTTAATCCTTAGATTGCATGTACTTGAT-3/ 。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克隆方法，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下:94°C 3min、94°C 45s,58°C lmin、72°C lmin30 個(gè)循環(huán)、72°C延長(zhǎng) 10min，4°C保存。
4.一種qPCR擴(kuò)增GAPDH基因部分序列的方法，抽提禾谷縊管蚜基因組總RNA，以試劑盒自帶混合引物為為引物進(jìn)行RT反應(yīng)，然后以產(chǎn)物第一鏈cDNA作為模板進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，熒光染料為SYBR Green I，其中定量PCR擴(kuò)增中的禾谷縊管蚜的定量引物，其序列為: QGAPDH F:5/ -ACTACTGTTCACGCTACCACCG-3'； QGAPDH R:5/ -GCTGCTTCCTTGACCTTACCTT-3'。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，所述定量PCR擴(kuò)增采用兩步法，即在95°C預(yù)變性15min之后，先運(yùn)行40個(gè)循環(huán)的95°C 10sec,59.2°C 32sec，72°C 32sec，再運(yùn)行溶解曲線階段的95°C 15sec,60°C lmin,95°C 30sec,60°C 15sec。
6.權(quán)利要求1所述的禾谷縊管蚜GAPDH基因片段`作為內(nèi)參基因應(yīng)用于禾谷縊管蚜功能基因或介體內(nèi)黃矮病毒基因表達(dá)定量PCR檢測(cè)的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103820463SQ201410088745
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】劉艷, 武科科, 王錫鋒 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所