專利名稱：一種棉花超氧化物歧化酶及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種棉花超氧化物歧化酶及其編碼基因與應用。
背景技術：
我國人多地少，糧棉生產爭地的矛盾歷來突出，因此如何使糧棉生產協調發(fā)展，改革耕作制度，提高復種指數是一條重要的技術途徑。我國迫切需要更多適應不同地理環(huán)境的品質優(yōu)良、豐產性好的短季棉新品種。目前短季棉育種中存在的突出問題是許多短季棉品種早熟早衰品質產量不佳，因此解決早熟早衰問題是短季棉育種的關鍵問題之一。棉花早衰主要是棉花自身的生理生化機制引起的。在棉花生長后期，提供合適光、溫濕度，有些品種仍然早衰，顯然早衰是由其內在因素決定的；對短季棉品種的研究表明(喻樹迅，黃禎茂，姜瑞云等。清除活性氧酶類對棉花早熟不早衰特性的遺傳影響[J]。棉花學報，1999，11(2)100-105 Shu-XunYU，Mei-Zhen SONG，Shu-Li FAN etal.Biochemical Genetics of Short-seasonCotton Cultivars that Express Early Maturity Without Senescence[J].Journalof integrative plant biology.2005，47(3)334-342)品種是否早衰和后期棉葉內的活性氧自由基清除酶SOD、POD、CAT等活性有關，從SOD酶活性分析顯示早熟不早衰品種前期SOD酶活性高于其它類型；后期SOD酶活性明顯高于其它類型且下降緩慢，曲線變化平穩(wěn)，說明在不早衰類型中，SOD酶在整個生育期中能及時高效清除有害自由基，起著重要的保護作用。SOD酶是影響棉花早衰的重要酶成分之一，克隆SOD酶基因并進一步研究該酶在短季棉早熟不早衰機理中的作用是研究棉花早熟不早衰的重要手段之一。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種棉花超氧化物歧化酶及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的棉花超氧化物歧化酶，來源于棉花，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且可催化超氧自由基(O2·-)發(fā)生歧化反應的蛋白質。
反應方程
其中，序列表中的序列1由215個氨基酸殘基組成。
所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
上述棉花超氧化物歧化酶編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。
上述棉花超氧化物歧化酶的編碼基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
高嚴謹條件是指雜交溫度為49℃，在0.1×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №1由1043個脫氧核苷酸組成，自5′端第98-745位脫氧核苷酸為編碼序列。
含有本發(fā)明基因的表達載體、細胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明的棉花超氧化物歧化酶的編碼基因可用現有的方法構建到現有的植物表達載體中，可在其轉錄超始核苷酸前加上包括組成型啟動子、增強啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子、發(fā)育階段特異性啟動子在內的任何一種啟動子。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(BAR基因、GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素，卡那霉素等)。攜帶有本發(fā)明的棉花超氧化物歧化酶的編碼基因基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉化植物細胞或組織。
實驗表明本發(fā)明的棉花超氧化物歧化酶基因在原核表達載體中可表達具有活性的超氧化物歧化酶。本發(fā)明的棉花超氧化物歧化酶基因可用于遺傳轉化微生物生產商用SOD酶蛋白，可用于藥物/化妝品/食品加工等領域。本發(fā)明還為轉基因棉花改良提供了一個優(yōu)質基因。本發(fā)明的棉花超氧化物歧化酶基因轉入棉花中，可延緩棉花早衰。


圖1為pET-SOD載體構建過程圖2為本發(fā)明的棉花超氧化物歧化酶基因表達蛋白的PAGE圖譜具體實施方式
實施例中的方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、本發(fā)明棉花超氧化物歧化酶基因的獲得利用其它植物的同源酶蛋白的氨基酸序列設計一對兼并引物JM-15’-GCACGGCTGGCACCTC(A/C)A(C/T)GA(A/G)T(A/T)(C/T)GG-3’，JM-25’-CGAGGTCGTCCTCCGTC(T/G)C(A/G)T(A/G)(A/T/C/G)AC(A/T/C/G)AC-3’。在針刺葉片，37℃暗處理5小時誘導陸地棉(中棉所36)花葉片表達超氧化物歧化酶基因，提取葉片總RNA，RT-PCR得到基因的cDNA，利用兼并引物擴增得到保守性的基因中間片段，PCR擴增程序先95℃預變性4min，然后95℃1min，35℃2min，72℃1min，30循環(huán)；最后72℃延伸10min，PCR產物1.0％瓊脂糖凝膠檢測，回收膠得到特異中間片段。
以得到的特異中間片段為模板，設計一對嵌套引物chl sp15’-AATGCGGTTGTTGGAAGAGC-3’；chl sp25’-GGTTGTTGGAAGAGCATTTG-3’。采用RACE技術，進行PCR擴增，擴增程序為先95℃預變性4min，94℃30sec，58℃30sec，72℃2min 36個循環(huán)最后72℃延伸10min，PCR產物1.0％瓊脂糖凝膠檢測，回收膠后，測序(上海生物工程技術有限公司)得到基因3′序列。
以得到的特異中間片段為模板，設計一條反轉錄引物chl-RT5’-(P)TTCCAACAACCG-3’，和兩對嵌套引物chl s15’-AATGCGGTTGTTGGAAGAGC-3’chl s25’-TTGTAGTTTATGAGACGGAG-3’；chl a15’-ATTGTTGCCTCTGCCACTCC-3’chl a25’-GTTGCCTCTGCCACTCCATC-3’進行PCR擴增，反應程序為先95℃預變性4min，94℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min 36個循環(huán)；最后72℃延伸10min，PCR產物1.0％瓊脂糖凝膠檢測，回收膠后，測序(上海生物工程技術有限公司)得到基因的5′序列；利用序列軟件拼接三段，得到全長基因序列；在起始密碼子和終止子處設計一對引物，ZY-15′-GTCGCGGATCCATGGCTGCCCCATATTTTCC-3′(BamHI)，ZY-25′-GCGACAAGCTTTATACCGGAGTCAAGCC-3′(HindIII)，以cDNA為模板，反應程序為先95℃預變性4min，94℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min 36個循環(huán)最后72℃延伸10min；PCR擴增體系為10x Buffer 5ul，d NTP(2.5Mm)4ul，ZY-1(20mM)1ul，ZY-2(20mM)1ul，cDNA 1ul，Taq酶2.5U，ddH2O補足50ul。PCR產物1.0％瓊脂糖凝膠檢測，擴增得到基因序列全長，經測序，得到棉花超氧化物歧化酶的基因，測序證明該基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，自5′端第98-745位為其編碼序列，編碼序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
實施例2、本發(fā)明棉花超氧化物歧化酶基因的表達及其表達蛋白的功能驗證。
載體pET 21a(+)購于novagen公司，表達菌株BL21(DE3)購自北京鼎國生物技術有限公司；將實施例1中引物ZY-1和ZY-2擴增得到的棉花超氧化物歧化酶的基因，用BamHI和HindIII酶切后插入到pET 21a(+)的BamHI和HindIII酶切位點之間，經過測序，得到含有具有序列表中序列1的核苷酸序列的棉花超氧化物歧化酶的基因的載體pET-SOD。
將pET-SOD轉化BL21(DE3)受體菌株，篩選得到轉入pET-SOD的菌株，命名為BLpET-SOD，對BLpET-SOD進行過夜培養(yǎng)，然后按1∶50的體積比稀釋轉入LB培養(yǎng)液，培養(yǎng)4小時，取1毫升培養(yǎng)液，所得到的菌體懸浮于0.2毫升的Laemmli緩沖液(0.0625M Tris-HCl pH 6.8，2％ SDS，10％ glycerol，5％ 2-mercaptoethanol，0.001％ bromophenol blue)中，100℃加熱5分鐘后離心，取30微升的上清液在12％的SDS-PAGE中進行電泳分析，蛋白質經考馬斯亮藍R250染色，脫色后鑒定。同時以轉空載質粒pET 21a(+)的BL21(DE3)作為對照。
結果如圖2所示，圖2中，泳道M為標準分子量，從上到下依次為97.2kDa，66.4kDa，44.3kDa，29.0kDa，20.1kDa和14.3kDa，泳道1為不含質粒菌株BL21(DE3)，泳道2為轉空載質粒pET 21a(+)的菌株，泳道3為BLpET-SODIPTG誘導表達4小時，泳道4為BLpET-SOD IPTG誘導表達3小時，泳道5為BLpET-SOD IPTG誘導表達2小時，泳道6為BLpET-SOD IPTG誘導表達1小時。表明經過IPTG誘導后，重組質粒pET-SOD表達一條大約25kDa的條帶(箭頭示)，與預期的表達目標蛋白一致，IPTG誘導表達4小時的表達量最高。pET 21a(+)載體的N端有T7·Tag序列，產生的融合蛋白被其編碼的部分只有11個氨基酸，加上酶切位點編碼的部分總共16個氨基酸，基因完整的閱讀框架為645bp，編碼215個氨基酸，可表達理論上為27.26kDa的蛋白，加上表達系統(tǒng)的融合蛋白部分，預期表達產物29.0kDa，SDS-PAGE圖譜顯示在分子量29.0kDa左右有一條明顯蛋白差異帶，說明已經表達目標蛋白。
采用酶溶法提取表達蛋白進行SOD酶活的測定，取10ul的BLpET-SOD在3ml LB液體培養(yǎng)基中，進行過夜培養(yǎng)12小時，然后取1ml稀釋轉入50ml LB培養(yǎng)液，培養(yǎng)4小時。同時以轉pET 21a(+)菌株進行上述同樣處理做為對照。
將BLpET-SOD培養(yǎng)液和轉pET 21a(+)菌株培養(yǎng)液分別在4℃，8000g離心15分鐘，棄上清，收集菌體，稱重。按3ml/g濕菌體加入裂解液(50mmol/lTris-HCl，pH 8.0；1mmol/lEDTA；0.1mol/lNaCl)懸浮沉淀。按3ul/g濕菌體的比例加入50mmol/l的蛋白酶抑制劑PMSF，按100ul/g濕菌體的比例加入溶菌酶(10mg/ml)，攪拌20分鐘，在攪拌同時按每克菌4mg脫氧膽酸的比例加入脫氧膽酸。4℃，8000g離心15分鐘，吸取上清液轉入透析袋在透析液中透析過夜，分別得到轉pET 21a(+)大腸桿菌BL21(DE3)酶液和轉pET-SOD大腸桿菌BL21(DE3)酶液。吸取酶液，進行SOD酶活測定實驗。
采用氯化硝基四氮唑藍(NBT)光化還原法測定SOD活力，一個酶活單位(U)定義為SOD抑制NBT光還原相對百分率為50％時的酶量作為一個酶活力單位(U)。具體方法如下取7支試管統(tǒng)一編號，1-2號試管每管加4ml反應液(由0.05M，pH7.8磷酸緩沖液；13mM Met；0.075mM NBT和0.1mM EDTA配成)+10ul轉pET 21a(+)大腸桿菌BL21(DE3)酶液+100ul(160mmol/l)核黃素；3-4號試管每管加4ml反應液+10ul轉pET-SOD大腸桿菌BL21(DE3)酶液+100ul(160mmol/l)核黃素；5-7號試管以磷酸緩沖液代替酶液做空白對照，每管加4ml反應液+10ul磷酸緩沖液+100ul(160mmol/l)核黃素。除7號試管置于暗處外，其余均為25℃、光照強度4000LX，照光15分鐘，然后立即遮光停止反應。于560nm用7號試管液調零，測定OD560。以5和6號試管液光密度的平均值作為還原率100％，分別計算1-2號試管液和3-4號試管液的抑制NBT光還原的相對百分率的平均值，得出轉pET21a(+)大腸桿菌BL21(DE3)上清液的SOD酶活為0.3615U/kg，轉pET-SOD大腸桿菌BL21(DE3)酶液的SOD酶活為0.4256U/kg。轉pET-SOD大腸桿菌BL21(DE3)酶液的SOD酶活比轉pET 21a(+)大腸桿菌BL21(DE3)上清液的SOD酶活提高17％，證明克隆的棉花超氧化物歧化酶基因已經表達，本發(fā)明的棉花超氧化物歧化酶具有較高的SOD酶活性。
序列表<160>2<210>1<211>1043<212>DNA<213>棉屬陸地棉(Gossypium.hirsutum)<400>1aaaacagcca cccacatcct tggctcccgt tatccccctc caaaatcctc actttcactc 60ccttcacaaa cctgaaaagc tgcggcaata gcagccaatg gctgccccat attttccacg120aacaaccccg tcccacctcg ctctctcttt tccatcctca actaaccctt caaacccacc180ggttcttctc tcctcatttc gtggggtctc tcttaagctc cctcgtcaat ccctctccct240tgctgccact attcccaaga agcccttttc tgtgtttgct gttaccaaga aagctgtcgc300tgttcttaaa ggtaattcgg aagttgaagg cgttgtcacg ttgacccagg aaaatgatgg360tcctacaact gtgaatgttc gaattactgg tcttactcct gggcctcatg gcttccacct420acatgagtat ggtgacacaa cgaatgggtg catgtctaca ggagcacatt tcaatcctaa480caatatgaca catggtgctc ctgaggatga agtacgccat gcgggtgacc tgggaaacat540aattgctaat gctgatggag tggcagaggc aacaattgtg gacaatcaga taccactaag600tggccccaat gcggttgttg gaagagcatt tgtggttcat gagcttgagg atgatcttgg660aaagggtgga catgaactta gtctaaccac tgggaatgct ggcggaagat tggcatgtgg720tgttgttggc ttgactccgg tataaatctt atcgatgaaa ccagtttggt gttgtgctat780ttgttggttg gatttggcag cttcttttat agagccgcat gtgatgttgc tttcaatgtt840gatagcgtgt tatatgagat tgtgcagaca agtatttagt cgaataacat ttgtagacct900ttgttatgtc attattctca acccaataaa aaattagcac atggcttgtg aacctgtaga960ctgtaaaact tgcctttttg agcttatgaa attttatggt gctgctggtc atcaggaaaa 1020aaaaaaaaga aaaaaaaaaa aaa 1043<210>2<211>215
<212>PRT<213>棉屬陸地棉(Gossypium.hirsutum)<400>2Met Ala Ala Pro Tyr Phe Pro Arg Thr Thr Pro Ser His Leu Ala Leu1 5 10 15Ser Phe Pro Ser Ser Thr Asn Pro Ser Asn Pro Pro Val Leu Leu Ser20 25 30Ser Phe Arg Gly Val Ser Leu Lys Leu Pro Arg Gln Ser Leu Ser Leu35 40 45Ala Ala Thr Ile Pro Lys Lys Pro Phe Ser Val Phe Ala Val Thr Lys50 55 60Lys Ala Val Ala Val Leu Lys Gly Asn Ser Glu Val Glu Gly Val Val65 70 75 80Thr Leu Thr Gln Glu Asn Asp Gly Pro Thr Thr Val Asn Val Arg Ile85 90 95Thr Gly Leu Thr Pro Gly Pro His Gly Phe His Leu His Glu Tyr Gly100 105 110Asp Thr Thr Asn Gly Cys Met Ser Thr Gly Ala His Phe Asn Pro Asn115 120 125Asn Met Thr His Gly Ala Pro Glu Asp Glu Val Arg His Ala Gly Asp130 135 140Leu Gly Asn Ile Ile Ala Asn Ala Asp Gly Val Ala Glu Ala Thr Ile145 150 155 160Val Asp Asn Gln Ile Pro Leu Ser Gly Pro Asn Ala Val Val Gly Arg165 170 175Ala Phe Val Val His Glu Leu Glu Asp Asp Leu Gly Lys Gly Gly His180 185 190Glu Leu Ser Leu Thr Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg Leu Ala Cys Gly195 200 205Val Val Gly Leu Thr Pro Val210 21權利要求
1.一種棉花超氧化物歧化酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且可催化超氧自由基發(fā)生歧化反應的蛋白質。
2.權利要求1所述棉花超氧化物歧化酶的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于所述棉花超氧化物歧化酶編碼基因的編碼序列為自序列1的5′端第98-745位脫氧核苷酸。
4.根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述棉花超氧化物歧化酶的編碼基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.含有權利要求2或3或4所述基因的表達載體。
6.根據權利要求5所述的表達載體，其特征在于所述表達載體為pET-SOD。
7.含有權利要求2或3或4所述基因的細胞系。
8.含有權利要求2或3或4所述基因的宿主菌。
9.權利要求2或3或4所述的基因在培育抗早衰植物中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于所述植物為棉花。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種棉花葉綠體超氧化物歧化酶及其編碼基因與應用。該棉花葉綠體超氧化物歧化酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與具有超氧化物歧化酶功能的蛋白質。該基因在原核表達載體中可表達具有活性的超氧化物歧化酶。本發(fā)明的棉花葉綠體超氧化物歧化酶基因轉入棉花中，可延緩棉花早衰。
文檔編號C12N15/63GK1869209SQ20061008097
公開日2006年11月29日 申請日期2006年5月26日 優(yōu)先權日2006年5月26日
發(fā)明者喻樹迅, 胡根海, 范術麗, 宋美珍 申請人:中國農業(yè)科學院棉花研究所