專利名稱：：有效霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的發(fā)酵生產(chǎn)方法，具體地，涉及一種有效霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法。技術(shù)背景吸水鏈毒菌井岡變禾中(Streptomyceshygroscopicusvar.jingganggensisYen)是1973年上海農(nóng)藥研究所在井岡山地區(qū)篩選到的一種可以產(chǎn)生有效霉素(又名井岡霉素)的菌株。它發(fā)酵生產(chǎn)的有效霉素由于具有高效、無毒、易于推廣等特點(diǎn)，在我國獲得了成功的開發(fā)和迅速的推廣，已經(jīng)成為在亞洲水稻產(chǎn)區(qū)運(yùn)用最為廣泛的一種抗水稻真菌病害農(nóng)用抗生素。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，有效霉素包括A、B、C、D、E、F、G、H八個(gè)組分，其中抗菌活性最強(qiáng)的A組分占約70%。其化學(xué)名稱為N-((lS)-(l,4,6/5)-3-羥甲基-4,5,6-三羥基-2-還乙烯基)-(0--0-吡喃葡糖基-(1—3)-(lS)-(l，2,4/3,5)-2,3,4-三羥基-5-羥甲基環(huán)己胺；英文名為validamycinA或者jinggangmycinA;其化學(xué)分子式如下其相對(duì)分子量為515.5,無固定熔點(diǎn)，在135'C分解。1970年Iwasa探索了有效霉素的發(fā)酵條件，在37°C發(fā)酵5天可獲得35000u/ml的生物效價(jià)。1977年上海農(nóng)藥所探索出適于井岡鏈霉素發(fā)酵生產(chǎn)有效霉素的4(TC高溫發(fā)酵條件，在此溫度下發(fā)酵40小時(shí)獲得3000g/ml的生物效價(jià)。汪世山等利用單因素和多因素實(shí)驗(yàn)研究了吸水鏈霉菌井岡變種7-11菌株工業(yè)生產(chǎn)的最佳碳氮比，優(yōu)化了培養(yǎng)基，并且較為詳細(xì)的研究了發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)有效霉素發(fā)酵的影響。發(fā)酵后的菌渣是良好的蛋白質(zhì)來源。發(fā)酵液經(jīng)過壓濾回收菌渣可以烘干后用作詞料蛋白添加劑，或直接用作魚飼料。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，目前有效霉素的工業(yè)生產(chǎn)中采用的發(fā)酵溫度為39°C~40°C，采用72~96小時(shí)較長(zhǎng)周期可在發(fā)酵過程中逐步積累最終達(dá)到較高產(chǎn)量，也有采用40'C下經(jīng)過4050小時(shí)周期發(fā)酵，但是產(chǎn)量只能達(dá)到上述發(fā)酵終產(chǎn)量的60%左右(汪世山，喻子牛，陳守文等，吸水鏈霉菌井岡霉素發(fā)酵中氮源及碳氮比的優(yōu)選，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，20(6):554-556)。如果采用長(zhǎng)周期發(fā)酵，一些次生代謝產(chǎn)物往往在菌體營(yíng)養(yǎng)缺乏或者經(jīng)過一系列分化過程之后才開始大量合成，目前井岡鏈霉菌所產(chǎn)生的這些次生代謝物還不完全明確，因此發(fā)酵周期過長(zhǎng)會(huì)積累大量的次生代謝物。同時(shí)，目前工業(yè)生產(chǎn)常利用離子交換法從發(fā)酵液中直接提取有效霉素，并制成水劑或者通過噴霧千燥作為粉劑使用。發(fā)酵液直接濃縮制劑的田間使用，或者利用離子交換法提取后產(chǎn)生的廢液都會(huì)將這些代謝物排放到環(huán)境中，帶來潛在的環(huán)境污染。而在40'C下進(jìn)行生產(chǎn)則需要的發(fā)酵周期較長(zhǎng)，在發(fā)酵末期胞內(nèi)蛋白含量已大幅下降，發(fā)酵液中可被利用的蛋白量也已大幅下降。因此如何能夠在較短發(fā)酵周期內(nèi)獲得較高的有效霉素產(chǎn)量，同時(shí)具體蛋白量仍然可以保持較高水平是本領(lǐng)域進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)有效霉素所亟待解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種有效霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法。由于有效霉素產(chǎn)量對(duì)溫度響應(yīng)存在閾值現(xiàn)象，因此本發(fā)明采用高于閾值溫度的較高發(fā)酵溫度的方法來有效提高發(fā)酵生產(chǎn)速率和胞內(nèi)蛋白含量。本發(fā)明的方法在獲得較高的有效霉素產(chǎn)量以及發(fā)酵菌體蛋白含量的同時(shí)，發(fā)酵周期縮短了一半，提高了設(shè)備利用率，顯著減少能耗；而且由于發(fā)酵周期的縮短，發(fā)酵液所含的其他代謝產(chǎn)物少，若直接濃縮成制劑施用可以減少對(duì)環(huán)境的污染。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明包括以下步驟(1)菌種活化與平板培養(yǎng)將冷凍保存的有效霉素產(chǎn)生菌的孢子懸浮液融化，然后將孢子懸液涂布在固體培養(yǎng)基平板上；涂布完畢后置于3(TC培養(yǎng)5到6天后取平板表面覆蓋的孢子，制成孢子懸浮液；(2)種子培養(yǎng)將活化的孢子懸浮液，按照每1升種子培養(yǎng)基中接入2001孢子懸浮液的比例接種到種子培養(yǎng)基中，接種后于42。C下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)20個(gè)小時(shí)；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，按照每1升發(fā)酵培養(yǎng)基中接入100ml種子培養(yǎng)液的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后于42。C下培養(yǎng)；對(duì)42。C下的短周期發(fā)酵，滿36小時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。所述步驟(1)中的固體培養(yǎng)基是指YMS固體培養(yǎng)基，其組成部分的質(zhì)量百分比為酵母提取物0.39%，固體可溶性淀粉0.39%，麥芽糖0.96%,瓊脂1.93%，CoCl*6H200.0005%，去離子水96.33%。所述步驟(2)中的種子培養(yǎng)基的組成部分的質(zhì)量百分比為玉米粉2.81%，黃豆餅粉2.07%，酵母提取物0.94%，氯化鈉0.19%，磷酸二氫鉀0.08%，去離子水93.91%。所述步驟(3)中的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成部分的質(zhì)量百分比為玉米粉7.92%，黃豆餅粉3.52%，酵母提取物0.44%，氯化鈉0.09%，磷酸二氫鉀0.09%,去離子水87.94%。本發(fā)明利用在高于閾值溫度時(shí)發(fā)酵終產(chǎn)量差異小的規(guī)律，使用高于閾值溫度的較高發(fā)酵溫度的方法來有效提高有效霉素的發(fā)酵生產(chǎn)速率和胞內(nèi)蛋白含量。本發(fā)明利用42'C作為發(fā)酵溫度，36小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)后積累絕對(duì)含量約10g/L的有效霉素，而目前報(bào)道的4(TC下發(fā)酵36小時(shí)時(shí)有效霉素的積累絕對(duì)含量約為8g/L。使用本發(fā)明中的的發(fā)酵方法可以縮短發(fā)酵時(shí)間，獲得更高的相對(duì)效價(jià)。顯著降低能耗。同時(shí)，由于發(fā)酵周期縮短，減少了菌體蛋白在長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵過程中的消耗，因此能夠在保證有效霉素產(chǎn)量的同時(shí)，增加綜合效益。具體實(shí)施方式以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1:1.實(shí)驗(yàn)材料采用的菌種吸水鏈霉菌5008菌株(Streptomyceshygroscopicusvar.jingganggensis5008)2.實(shí)驗(yàn)步驟(1)菌種活化與平板培養(yǎng)取凍存的甘油孢子懸液密集的在YMS平板均勻涂布。接種完畢后置于30'C培養(yǎng)56天可以青色或者灰色的孢子。往產(chǎn)孢豐滿的平板加入34ml的無菌水，同時(shí)以棉簽輕輕刮動(dòng)平板表面覆蓋的孢子，將其懸浮于無菌水中。(2)種子培養(yǎng)將不銹鋼彈簧巻曲成環(huán)狀，置于250ml三角瓶中，然后裝入50ml種子培養(yǎng)基，滅菌。待培養(yǎng)基冷卻后，吸取孢子懸浮液IOl加入搖瓶中，進(jìn)行接種。接種后，將搖瓶分別至于28。C,30。C,35。C溫度下220轉(zhuǎn)培養(yǎng)，20個(gè)小時(shí)。每個(gè)溫度設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。(3)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵搖瓶為250ml，放入彈簧后裝入發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，滅菌。轉(zhuǎn)接時(shí)，首先將三個(gè)平行的種子搖瓶混合在一起，而后用5ml移液管吸取5ml的種子轉(zhuǎn)移到發(fā)酵搖瓶，培養(yǎng)自28°C,30°C,35'C的種子各接種9個(gè)搖瓶。置于相應(yīng)的溫度條件下，220轉(zhuǎn)培養(yǎng)。在滿36，60，％小時(shí)取3個(gè)搖瓶進(jìn)行各種檢測(cè)。(4)有效霉素產(chǎn)量檢測(cè)發(fā)酵液離心除去菌體后，加入等體積的氯仿強(qiáng)烈震蕩，隨后12000g離心10分鐘除去蛋白沉淀。上清液用0.2m濾膜過濾后用HPLC進(jìn)行分析。色譜條件5mM/L，pH=7.0，磷酸鹽緩沖液色譜純甲醇=98:2(體積比)，流速lml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，EclipseXDB-184.6mmxl50mm分析柱，控制柱溫25。C，保留時(shí)間約為5min。通過有效霉素標(biāo)準(zhǔn)品作比標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。(見表l)表1HPLC方法檢測(cè)28'C-35'C的培養(yǎng)溫度下，不同培養(yǎng)時(shí)間的有效霉素的產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表中NA表示HPLC法沒有測(cè)得產(chǎn)量有效霉素。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析在本實(shí)施例中，28'C到3(TC溫度增加2'C，發(fā)酵終產(chǎn)量提高了0.12g/L。當(dāng)從30。C到35r，溫度增加5'C，產(chǎn)量提高0.9g/L左右。隨著溫度從28'C開始提高，觀察到發(fā)酵效價(jià)隨之提高。實(shí)施例2:選擇35°C,37"C，和40'C進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。實(shí)施步驟和結(jié)果如下1.采用的菌種同實(shí)施例12.菌種活化與平板培養(yǎng)方法同實(shí)施例l3.種子培養(yǎng)接種后將搖瓶分別至于35'C,37°C，4CTC溫度下培養(yǎng)，20個(gè)小時(shí)。其余同實(shí)施例1。4.發(fā)酵培養(yǎng)35°C,37°C,40'C培養(yǎng)獲得的種子，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，分別置于對(duì)應(yīng)的35°C,37'C,4(TC溫度條件下，220轉(zhuǎn)培養(yǎng)。在84小時(shí)取3個(gè)搖瓶進(jìn)行各種檢測(cè)。其佘方法步驟同實(shí)施例1。4.發(fā)酵過程檢測(cè)(l)檢測(cè)有效霉素產(chǎn)量，方法同實(shí)施例l(結(jié)果見表2)。表2HPLC方法檢測(cè)35"-4(TC的培養(yǎng)溫度下，不同培養(yǎng)時(shí)間的有效霉素<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析在本實(shí)施例中，在35"C和37'C之間存在一個(gè)巨大的產(chǎn)量躍升，溫度只提高了2'C，而84小時(shí)發(fā)酵終產(chǎn)量從0.92g/L飛升到10.05g/L。這說明在35'C和37'C之間存在一個(gè)溫度閾值，當(dāng)控制培養(yǎng)溫度超過這個(gè)閾值，環(huán)境溫度通過特異性機(jī)制作用于有效霉素合成途徑，導(dǎo)致了其產(chǎn)量躍升。(2)菌體蛋白量的檢測(cè)考察菌渣中蛋白含量，評(píng)估菌渣作為蛋白原料的利用價(jià)值取lml發(fā)酵液5000g,5min離心后除去上清液收集菌體到2ml小離心管中，洗滌之后懸浮。用溶菌酶處理樣品和用水代替溶菌酶作為空白一起放入到37°C水浴種保溫孵育1小時(shí)，加入10%的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液到樣品中一進(jìn)步裂解細(xì)胞。高速離心后，吸取上清液根據(jù)濃度情況稀釋100200倍到測(cè)定范圍內(nèi)利用標(biāo)準(zhǔn)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度(見表3)。表335'C-40'C培養(yǎng)溫度下菌體蛋白含量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析在本實(shí)施例中，隨著發(fā)酵溫度的提高，發(fā)酵終止時(shí)菌體蛋白含量隨著發(fā)酵溫度升高而降低，特別是在當(dāng)溫度從37'C升高到4(TC，發(fā)酵終止時(shí)的蛋白量幾乎下降了一倍，這表明采用4(TC發(fā)酵84小時(shí)后的菌渣綜合利用價(jià)值較低。實(shí)施例3:選擇高于溫度響應(yīng)閾值的發(fā)酵溫度37'C,4(TC，和42'C進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。實(shí)施步驟和結(jié)果如下1.采用的菌種同實(shí)施例l2.菌種活化與平板培養(yǎng)方法同實(shí)施例l3.種子培養(yǎng)接種后將搖瓶分別至于37'C,40°C,42"C溫度下培養(yǎng)，20個(gè)小時(shí)。其余同實(shí)施例1。4.發(fā)酵培養(yǎng)37°C,4(TC,42'C培養(yǎng)獲得的種子，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，分別置于對(duì)應(yīng)的37°C,40'C,42'C溫度條件下，220轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)。在12，24，36，60，96小時(shí)取3個(gè)搖瓶進(jìn)行各種檢測(cè)，42'C溫度條件滿36小時(shí)即結(jié)束發(fā)酵。其余方法步驟同實(shí)施例l。4.發(fā)酵過程檢測(cè)檢測(cè)指標(biāo)包括殘?zhí)呛蚿H，有效霉素產(chǎn)量，胞內(nèi)蛋白含量。殘?zhí)遣捎脴?biāo)準(zhǔn)硫酸-苯酚法測(cè)定，pH以pH計(jì)測(cè)定。其余方法同實(shí)施例2。5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)殘?zhí)呛蚿H檢測(cè)結(jié)果(見表4和表5):表437'C-42'C下不同培養(yǎng)時(shí)間的殘?zhí)橇?lt;table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表537'C-42'C下不同培養(yǎng)時(shí)間的pH值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析殘留糖濃度在36小時(shí)較高，可以進(jìn)一步的優(yōu)化培養(yǎng)基，增加速效碳源的比例來增加糖的利用率。而pH值差別不大，對(duì)下游處理不會(huì)造成影響。(2)有效霉素產(chǎn)量檢測(cè)結(jié)果(見表6):利用HPLC測(cè)定有效霉素含量，方法同例1。表637'C-42t:下不同培養(yǎng)時(shí)間的有效霉素產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析:在本實(shí)施例中，42'C發(fā)酵前期的有效霉素合成速度快，在36小時(shí)積累10.14g/L的有效霉素，達(dá)到4(TC發(fā)酵96小時(shí)產(chǎn)量12.56g/L的80.P/。；而4(TC發(fā)酵在36小時(shí)積累8.74g/L有效霉素，只有其96小時(shí)產(chǎn)量12.56的69.5%。采用較高溫度42'C發(fā)酵，發(fā)酵周期大為縮短。若考慮工業(yè)發(fā)酵能耗問題，每小時(shí)耗電為1個(gè)單位，則發(fā)酵96小時(shí)消耗96單位電力，獲得100%的相對(duì)效價(jià)。若采用42'C，36小時(shí)，則72單位電力可供2批發(fā)酵，獲得160%以上的相對(duì)效價(jià)，可顯著降低了能耗。(3)菌體蛋白量的檢測(cè)取lml發(fā)酵液5000g，5min離心后除去上清液收集菌體到2mlEP管中，洗滌之后懸浮。用溶菌酶處理樣品和用水代替溶菌酶作為空白一起放入到37'C水浴種保溫孵育1小時(shí)，加入10%的SDS到樣品中一進(jìn)步裂解細(xì)胞。高速離心后，吸取上清液根據(jù)濃度情況稀釋100~200倍到測(cè)定范圍內(nèi)利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。(見表7)表737'C-42'C下不同培養(yǎng)時(shí)間的菌體蛋白量<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析-在本實(shí)施例中，菌體蛋白在37C發(fā)酵過程中最高，但是37T:發(fā)酵的有效霉素產(chǎn)量明顯低于4(TC和42'C，因此并不適合用于生產(chǎn)。在40'C和42t:發(fā)酵時(shí)，36小時(shí)的蛋白含量為5.5g/L左右。在40'C發(fā)酵到96小時(shí)，則菌體蛋白含量只剩下2.7g/L，大量的有價(jià)值的蛋白被消耗，減少了菌渣作為蛋白質(zhì)源的綜合利用價(jià)值。因此，若使用42。C的高溫36小時(shí)短周期發(fā)酵，則能夠在保證有效霉素產(chǎn)量和生產(chǎn)率的同時(shí)，增加了綜合利用效益。權(quán)利要求1.一種有效霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將冷凍保存的有效霉素產(chǎn)生菌的孢子懸浮液融化，然后將孢子懸液涂布在固體培養(yǎng)基平板上，涂布完畢后置于30℃培養(yǎng)5到6天后取平板表面覆蓋的孢子，制成孢子懸浮液；(2)將活化的孢子懸浮液，按照每1升種子培養(yǎng)基中接入2001孢子懸浮液的比例接種到種子培養(yǎng)基中，接種后于42℃下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)20個(gè)小時(shí)；(3)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，按照每1升發(fā)酵培養(yǎng)基中接入100ml種子培養(yǎng)液的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后于42℃下培養(yǎng)，對(duì)42℃下的短周期發(fā)酵，滿36小時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。2、如權(quán)利要求1所述的有效霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征是，步驟(1)中所述的固體培養(yǎng)基的組成成分的質(zhì)量百分比為酵母提取物0.39%，固體可溶性淀粉0.39%，麥芽糖0.96%，瓊脂1.93%，CoCl*6H200.0005%，去離子水96.33%。3、如權(quán)利要求1所述的有效霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征是，步驟(2)中所述的種子培養(yǎng)基的組成成分的質(zhì)量百分比為玉米粉2.81%，黃豆餅粉2.07%，酵母提取物0.94%，氯化鈉0.19%，磷酸二氫鉀0.08%，去離子水93.91%。4、如權(quán)利要求1所述的有效霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征是，步驟(3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分的質(zhì)量百分比為玉米粉7.92%，黃豆餅粉3.52%，酵母提取物0.44%,氯化鈉0.09%，磷酸二氫鉀0.09%，去離子水87.94%。全文摘要本發(fā)明涉及一種生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的有效霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括如下步驟(1)菌種活化與平板培養(yǎng)；(2)種子培養(yǎng)；(3)發(fā)酵培養(yǎng)。通過采用42℃較高溫度發(fā)酵的方法，可縮短發(fā)酵周期約一半，而仍保持較高的發(fā)酵效價(jià)，故有效霉素的發(fā)酵生產(chǎn)率獲得大幅度提高，同時(shí)發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體蛋白含量比常規(guī)發(fā)酵高70％左右。本發(fā)明的方法縮短了有效霉素生產(chǎn)的發(fā)酵周期，提高了設(shè)備利用率，降低單位能耗，同時(shí)提高了菌體蛋白的含量，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12R1/55GK101298623SQ20081003956公開日2008年11月5日申請(qǐng)日期2008年6月26日優(yōu)先權(quán)日2008年6月26日發(fā)明者廖悅喬,鐘建江申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)