專利名稱：：T細胞群的制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及制備在醫(yī)療領域中有用的T細胞群的方法。
背景技術：
：一個活的生物體主要通過免疫應答來保護機體免受異物的侵襲。免疫系統(tǒng)是由各種各樣的細胞及其產生的可溶性因子構成。其中，白細胞，特別是淋巴細胞，起著關鍵作用。淋巴細胞分為B淋巴細胞(以下，稱作B細胞)和T淋巴細胞(以下，稱作T細胞)兩種主要類型，這兩種細胞都特異性識別抗原并作用于此，從而保護有機體。T細胞在末梢中，具有CD(分化群)4標志的CD4T細胞和具有CD8標志的CD8T細胞占大部分。CD4T細胞的大部分被稱為輔助T細胞(以下稱為TH),與輔助抗體生成或誘導各種免疫應答有關，根據(jù)由抗原刺激生成的細胞因子種類不同分為Thl型和Th2型。CD8T細胞的大部分分化為通過抗原刺激顯示細胞毒活性的細胞毒性T細胞(Tc:細胞毒性T淋巴細胞，別名殺傷T細胞，以下稱為CTL)。例如在癌的病態(tài)中，作為除外科手術、化學療法、放射線療法的第四種療法，近年來人們對免疫療法給予極大關注。免疫療法是利用人本身所具有的免疫力，因此，患者的肉體的負擔與其它療法相比較輕。免疫療法已知有導入通過各種方法擴大培養(yǎng)得到的經離體UxWvo)誘導的CTL或末梢血淋巴細胞等衍生的淋巴因子活化細胞、NKT細胞、Y5T細胞等的療法；以及導入有望進行體內的抗原特異性CTL誘導的樹突細胞的療法或肽疫苗療法；Thl細胞療法；以及將有望獲得各種效果的基因離體導入到這些細胞中，再將其導入體內的免疫基因療法等。纖連蛋白是存在于動物血液中、培養(yǎng)細胞表面、組織的細胞外基質中的分子量為25萬的巨大糖蛋白，已知具有各種功能，其結構域結構分為七部分(以下參照圖1),在其氨基酸序列中含有三種類似的序列，這些序列的重復構成了完整序列。三種類似的序列被稱為I型、II型、III型，其中，III型由71-96個氨基酸殘基構成，這些氨基酸殘基的一致率為17-40%。纖連蛋白中存在14個III型的序列，其中第8、第9、第10(以下分別稱為ni畫8、in-9、ni-io)含在細胞結合結構域中，第12、第13、第14(以下分別稱為111-12、111-13、m-i4)含在肝素結合結構域中。另夕卜111-10中含有VLA(遲現(xiàn)抗原)-5結合區(qū)域，該核心序列是RGDS。另外，在肝素結合結構域的C末端一側存在被稱為IIICS的區(qū)域。在IIICS中存在含有25個氨基酸、與VLA-4具有結合活性的被稱為CS-1的區(qū)域(例如非專利文獻1-3)。免疫療法中，在導入離體誘導的CTL或末梢血淋巴細胞等通過IL-2與抗CD3抗體的作用擴大培養(yǎng)得到的淋巴因子活化細胞的療法中，在將體外誘導的抗原特異性CTL擴大培養(yǎng)時，對于如何保持細胞毒活性、如何在體外高效地擴大培養(yǎng)淋巴細胞等問題，本發(fā)明人已經對使用纖連蛋白或其片段得到的效果進行了深入的研究(例如專利文獻1-3)。近年來有人報導，在免疫療法中使用的T淋巴細胞，與已經最終分化的效應T細胞相比，施用處于尚未分化狀態(tài)的幼稚T細胞或中央型記憶T細胞，在被施用的生物體中有望獲得高很多的治療效果(例如非專利文獻4、5)。并且，在有望進行體內誘導抗原特異性CTL的樹突細胞導入療法或肽疫苗療法等中，例如在癌癥進展中的患者體內，由于可被CTL誘導的幼稚T細胞少，因此大多無法獲得充分的效果。非專利文獻1:DeaneF.Momer著，1988年發(fā)行，F(xiàn)IBRONECTIN,ACADEMICPRESSINC.，1-8頁非專利文獻2:KimizukaF.等9人，J.Biochem.,1991年，Vol.110,No.2,284-291頁非專利文獻3:HanenbergH.等6人，HumanGeneTherapy,1997年,Vol.8,No.18，2193-2206頁非專利文獻4:GattinoniL.等10人，J.Clin.Inwest.，2005年，VoU15,No.6，1616-1626頁非專利文獻5:BenigniF等11人，J.Immunol.，2005年，Vol.175,No.2739-748頁專利文獻l:國際公開第03/016511號手冊專利文獻2:國際公開第03/080817號手冊專利文獻3:國際公開第2005/019450號手冊
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供施用于生物體有效的T細胞群的制備方法。本發(fā)明的第1發(fā)明涉及表達CD45RA,且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的T細胞群的制備方法，其特征在于該方法包含在纖連蛋白、其片段或它們的混合物的存在下，將含有T細胞的細胞群進行培養(yǎng)的步驟。本發(fā)明的第1發(fā)明中，包含培養(yǎng)步驟的總培養(yǎng)天數(shù)例如4-14天。另外，在纖連蛋白、其片段或它們的混合物存在下進行的培養(yǎng)，例如至少在培養(yǎng)開始時實施，并且優(yōu)選該培養(yǎng)至少實施1天或以上。在本發(fā)明的第1發(fā)明中，在纖連蛋白、其片段或它們的混合物存在下進行培養(yǎng)的步驟例如在CD3配體的存在下實施。另外，CD3配體例如抗CD3抗體。本發(fā)明的第l發(fā)明中，纖連蛋白片段可以是包含至少一個序列表中序列號1~8中所示氨基酸序列的多肽(m),或者是包含至少一個在上述任一氨基酸序列中l(wèi)或多個氨基酸發(fā)生置換、缺失、插入或者附加所得的氨基酸序列、并與上述多肽(m)具有同等功能的多肽(n)。另外，纖連蛋白的片段例如含有序列表中SEQIDN0.1-3和5-8所示氨基酸序列中任意的多肽。本發(fā)明的第l發(fā)明中，還可進一步例舉包含將表達選自CD45RA、CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的細胞進行分離的步驟的制備方法。并且在本發(fā)明的第1發(fā)明中，可進一步例舉包含向細胞群導入外源基因的步驟的制備方法。該制備方法中，外源基因的導入可使用反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、慢病毒載體或猿猴病毒載體。本發(fā)明的第2發(fā)明涉及由本發(fā)明的第l發(fā)明的方法獲得的、表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的T細胞群。本發(fā)明的第3發(fā)明涉及含有T細胞群作為有效成分的藥物，其中所述T細胞群是由本發(fā)明的第l發(fā)明的方法獲得的、表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的T細胞群。本發(fā)明的第4發(fā)明涉及包含疾病的治療方法或預防方法，該方法包含將有效量的T細胞群施用于受試體的步驟，其中所述T細胞群是由本發(fā)明的第l發(fā)明的方法獲得的、表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的T細胞群。本發(fā)明的第5發(fā)明涉及T細胞群在藥物制備中的應用，其中，T細胞群是由本發(fā)明的第1發(fā)明的方法獲得的、表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的T細胞群。本發(fā)明的第6發(fā)明涉及T細胞群的制備方法，其特征在于該制備方法包含以下步驟通過選自具有呈遞抗原的能力的細胞、呈遞了抗原的細胞、抗原、CD3配體、CD28配體、細胞因子、趨化因子和具有生成細胞因子的能力的細胞的至少一種刺激因子對T細胞群施加刺激的步驟，其中T細胞群是由本發(fā)明的第l發(fā)明的方法獲得的、表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的T細胞群。本發(fā)明的第7發(fā)明涉及由本發(fā)明的第6發(fā)明的方法得到的T細胞群。本發(fā)明的第8發(fā)明涉及含有T細胞群作為有效成分的藥物，其中，該T細胞群由本發(fā)明的第6發(fā)明的方法獲得。本發(fā)明的第9發(fā)明涉及疾病的治療方法或預防方法，該方法包含對受試體施用有效量的由本發(fā)明的第6發(fā)明的方法獲得T細胞群的步驟。本發(fā)明的第IO發(fā)明涉及由本發(fā)明的第6發(fā)明的方法得到的T細胞群在藥物制備中的應用。本發(fā)明的第ll發(fā)明涉及藥物，該藥物含有以下述兩種制劑(a)含有T細胞群作為有效成分的制劑，其中，所述T細胞群由本發(fā)明的第1發(fā)明的方法獲得、表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種；以及(b)含有選自下述的刺激因子作為有效成分的制劑，其中，所述刺激因子選自具有呈遞抗原的能力的細胞、呈遞了抗原的細胞、抗原、CD3配體、CD28配體、細胞因子、趨化因子和具有生成細胞因子的能力的細胞的至少一種；上述制劑作為包含于所述藥物中的不同制劑可同時或分別施用。本發(fā)明的第12發(fā)明涉及疾病的治療方法，其特征在于包含下述(a)和(b)的步驟(a)將T細胞群施用于患者的步驟，其中，所述T細胞群是由本發(fā)明的第1發(fā)明的方法獲得的、表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的T細胞群；(b)將選自具有呈遞抗原的能力的細胞、呈遞了抗原的細胞、抗原、CD3配體、CD28配體、細胞因子、趨化因子和具有生成細胞因子的能力的細胞的至少一種刺激因子施用于患者的步驟。有益效果根據(jù)本發(fā)明的制備方法，可以提供表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的T細胞群。由該制備方法得到的細胞群中，表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的T細胞比例高，在通過細胞醫(yī)療治療疾病中極為有用。實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明發(fā)現(xiàn)通過含有在纖連蛋白、其片段或它們的混合物(以下稱為本發(fā)明的有效成分)存在下進行培養(yǎng)的步驟，可以獲得高比例含有表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的T細胞的細胞群，從而完成了本發(fā)明。本說明書中，表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28中的至少一種的T細胞群是指高比例含有表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28中的至少一種的T細胞的T細胞群。這里，高比例是指在除本發(fā)明的有效成分存在與否之外，在同等條件下實施培養(yǎng)時，在本發(fā)明的有效成分存在時培養(yǎng)得到的T細胞群中表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28中的至少一種的T細胞比例比本發(fā)明的有效成分非存在下的情形高。與本發(fā)明的有效成分的不存在時的情形比較，優(yōu)選為高出5%或以上、更優(yōu)選10%或以上的T細胞群。所得細胞群中的表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28中的至少一種的T細胞的比例才艮據(jù)各種環(huán)境因素、例如提供末梢血單核細胞(PBMC)等T細胞制備中使用的細胞的人的個體差異，或身體狀況等而變動，因此，上述"高比例"無法由一定的數(shù)值規(guī)定。另外，由本發(fā)明的制備方法得到的T細胞群是指含有T細胞的細胞群，也可以含有T細胞以外的細胞、例如NK細胞等其它淋巴細胞或淋巴細胞以外的血細胞系成分。以下具體說明本發(fā)明。(1)本發(fā)明中使用的纖連蛋白及其片段本說明書中記載的纖連蛋白及其片段可以是天然獲得的，或者是人工合成的均可。纖連蛋白及其片段例如可根據(jù)RuoslahtiE.，等人.，J.Biol.Chem.第256巻，第14號，第7277-7281頁(1981)的公開，由天然存在的物質以基本上純的形態(tài)制備。這里，本說明書中記載的基本上純的纖連蛋白或纖連蛋白片段是指基本上不含有它們在天然狀態(tài)下與纖連蛋白一起存在的其它蛋白質。上述纖連蛋白及其片段可分別單獨或者將多種混合，用于本發(fā)明。已知纖連蛋白存在很多剪接變種，本發(fā)明中使用的纖連蛋白只要表達本發(fā)明的所需的效果，可以使用任何變種。例如，來自血漿的纖連蛋白已知其存在于上游的細胞結合結構域的被稱為ED-B的區(qū)域、存在于細胞結合結構域和肝素結合結構域之間的被稱為ED-A的區(qū)域缺失，上述的來自血漿的纖連蛋白也可用于本發(fā)明?？稍诒景l(fā)明中使用的纖連蛋白片段、以及該片段制備中相關的有用信息可由KimidukaR，等人，J.Biochem.,第110巻，284-291頁(1991);KornbrihrrA.R.,等人.EMBOJ.,第4巻，第7號，1755-1759頁(1985);SekiguchiK.,等人.，Biochemistry,第25巻，第17號，4936-4941頁(1986)等獲得。另外，編碼纖連蛋白的核酸序列或纖連蛋白的氨基酸序列在Genbank登錄號NM—002026、NP—002017中公開。本發(fā)明中，纖連蛋白片段例如含有至少一個構成III-8(序列表中SEQIDNO.l所示的氨基酸序列)、III-9(序列表中SEQIDN0.2所示的氨基酸序列)、III-10(序列表中SEQIDN0.3所示的氨基酸序列)、III-ll(序列表中SEQIDN0.4所示的氨基酸序列)、111-12(序列表中SEQIDNO.5所示的氨基酸序列)、111-13(序列表中SEQIDNO.6所示的氨基酸序列)、III-14(序列表中SEQIDN0.7所示的氨基酸序列)、以及CS-1(序列表中SEQIDNO.8所示的氨基酸序列)的任何區(qū)域的氨基酸序列的多肽(m)(參照圖1)，或者是包含至少一個在上述任一氨基酸序列中l(wèi)或多個氨基酸發(fā)生置換、缺失、插入或者附加所得的氨基酸序列、并與上述多肽(m)具有同等功能的多肽(n)。片段的長度例如氨基酸數(shù)目優(yōu)選20-1000,更優(yōu)選100-800。本說明書中，多個是包含數(shù)個的概念，優(yōu)選2-12個，更優(yōu)選2-10個，進一步優(yōu)選2-8個，以下也同樣。該片段可優(yōu)選采用具有細胞粘附活性和/或肝素結合活性的片段。細胞粘附活性可采用公知的方法測定本發(fā)明中使用的片段(該細胞結合結構域)與細胞的結合來調查。例如，上述方法包含WilliamsD.A.,等人,Nature,第352巻，第438-441頁(1991)。該方法是測定細胞與固定在培養(yǎng)板上的片段的結合的方法。肝素結合活性可使用公知的方法，測定本發(fā)明中使用的片段(其肝素結合結構域)與肝素的結合來調查。例如，在上述的WilliamsD.A.,等人的方法中，使用肝素、例如標記肝素替代纖連蛋白的片段例如選自C-274(序列表中SEQIDN0.9所示的氨基酸序列)、H-271(序列表中SEQIDNO.IO所示的氨基酸序列)、H-296(序列表中SEQIDNO.ll所示的氨基酸序列)、CH-271(序列表中SEQIDN0.12所示的氨基酸序列)、CH-296(序列表中SEQIDN0.13所示的氨基酸序列)、C-CS1(序列表中SEQIDN0.14所示的氨基酸序列)、CH-296Na(序列表中SEQIDNO.15所示的氨基酸序列)的多肽。上述CH-271、CH-296、CH-296Na、C-274、C-CSl的各片,殳是具有細胞結合結構域的多肽，該細胞結合結構域具有與VLA-5結合的活性。C-CSl、H-296、CH國296、CH-296Na是具有CS誦l的多肽，CS-1具有與VLA-4結合的活性。H-271、H-296、CH-271、CH-296和CH-296Na是具有肝素結合結構域的多肽。CH-296Na是含有來自血漿的纖連蛋白中的由細胞結合結構域至CS-1的多肽。本發(fā)明中，也可以使用上述各結構域變異后的片段。纖連蛋白的肝素結合結構域由三個III型序列(III-12、111-13、m-14)構成。含有缺失了上述III型序列中的一個或兩個的肝素結合結構域的片段也可用于本發(fā)明。例如有纖連蛋白的細胞結合部位(VLA-5結合區(qū)域、Prol239-Serl515)與一個III型序列結合而成的片段CHV-89(序列表中SEQIDNO.16所示的氨基酸序列)、CHV-90(序列表中SEQIDN0.17所示的氨基酸序列)、CHV-92(序列表中SEQIDNO.18所示的氨基酸序列)、或者與兩個III型序列結合而成的片段CHV-179(序列表中SEQIDNO.19所示的氨基酸序列)、CHV-181(序列表中SEQIDNO.20所示的氨基酸序列)。CHV-89、CHV-90、CHV-92含有111-13、111-14、111-12,CHV-179含有111-13和111-14，CHV-181含有111-12和111-13。上述各片段中進一步附加氨基酸而成的片段也可用于本發(fā)明。該片段例如可通過在上述各片段上附加所需的氨基酸來制備。例如，H-275-Cys(序列表中SEQIDN0.21所示的氨基酸序列)是具有纖連蛋白的肝素結合結構域、且在C末端具有半胱氨酸殘基的片段。本發(fā)明中使用的片段只要是可獲得本發(fā)明所需效果即可，可以含有下述多肽與含有上述例舉的天然纖連蛋白的氨基酸序列的至少一部分的片段具有同等功能、具有在構成該片段的多肽的氨基酸序列中有1或多個氨基酸置換、缺失、插入或附加的氨基酸序列。氨基酸的置換等優(yōu)選在可以保持原本的多肽的功能的范圍內可使該多肽的物理化學性狀等變化的程度。例如，氨基酸的置換等優(yōu)選為基本上不改變原本的多肽所具有的性質(例如疏水性、親水性、電荷、pK等)的范圍內的保守性的置換。例如，氨基酸的置換是l.甘氨酸、丙氨酸；2.纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；3.天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；4.絲氨酸、蘇氨酸；5.賴氨酸、精氨酸；6.苯丙氨酸、酪氨酸各組內的置換，氨基酸的缺失、附加、插入優(yōu)選為多肽中與其對象部位周邊的性質具有類似的性質的氨基酸在基本上不改變對象部位周邊性質的范圍內的缺失、附加、插入。通過基因工程學獲得本發(fā)明中使用的片段時，例如在以大腸桿菌等作為宿主制備時，由于來自大腸桿菌的甲疏氨酸肽酶等的影響，可能使N末端的甲硫氨酸缺失，上述多肽也可在本發(fā)明中使用。即，序列表中SEQIDN0.15和21中的多肽的N末端曱碌u氨酸缺失的多肽也可應用于本發(fā)明。氨基酸的置換等可以是起因于種間或個體差異而天然產生，也可以是人工誘發(fā)。人工誘發(fā)只要可通過公知的方法進行即可，沒有特別限定，例如通過公知的方法，制備在編碼來自天然的纖連蛋白的上迷區(qū)域或規(guī)定片段的核酸中有1或多個堿基置換、缺失、附加或插入得到的規(guī)定的核酸，使用該核酸，可以制備與來自天然纖連蛋白的上述區(qū)域或規(guī)定片段具有同等功能、含有構成該片段等的多肽的氨基酸序列上具有置換等的氨基酸序列的多肽。本說明書中，"具有同等功能"是指使用多肽得到的T細胞群中，表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28中的至少一種的T細胞比例比作為對照的、在多肽非存在下得到的T細胞群高。上述作用可按照后述實施例1、2、6的方法等適當確認。含有具氨基酸置換等的多肽的片段優(yōu)選具有細胞粘附活性和/或肝素結合活性，還優(yōu)選具有CS-1結構域。細胞粘附活性和肝素結合活性可按照它們的上述活性測定方法進行評價。作為含有具氨基酸的置換等的多肽的片段，例如在兩種不同的結構域之間插入一個或以上的氨基酸作為接頭所得的片段也可用于本發(fā)明。對于纖連蛋白，與上述片段同樣，下述多肽可在本發(fā)明中使用該多肽具有在其多肽的氨基酸序列上有1或多個氨基酸置換、缺失、插入或附加的氨基酸序列，在使用該多肽得到的T細胞群中，表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28中的至少一種的T細胞的比例比作為比較對照的多肽非存在下得到的T細胞群高。作為在本發(fā)明中使用的纖連蛋白或其片段，只要可獲得本發(fā)明所需的效果，可以使用下述多肽與上述例舉的天然纖連蛋白或含有其氨基酸序列的至少一部分的片段具有同等功能、與構成該纖連蛋白或構成其片段的多肽的氨基酸序列具有50%或以上同源性的多肽、優(yōu)選具有70%或以上同源性的多肽、更優(yōu)選具有90%或以上同源性的多肽、進一步優(yōu)選具有95%或以上同源性的多肽。同源性的計算例如可采用DNASISProVer.2.6(TAKARABIO(抹)制備)。本發(fā)明中，最優(yōu)選使用的纖連蛋白的片段有氨基酸序列中含有111-8(序列表中SEQIDNO.l所示的氨基酸序列)、111-9(序列表中SEQIDN0.2所示的氨基酸序列)、111-10(序列表中SEQIDN0.3所示的氨基酸序列)、111-12(序列表中SEQIDN0.5所示的氨基酸序列)、111-13(序列表中SEQIDNO.6所示的氨基酸序列)、III-14(序列表中SEQIDN0.7所示的氨基酸序列)和CS-1(序列表中SEQIDN0.8所示的氨基酸序列)的全部，即，含有肝素結合結構域、細胞結合結構域和CH-1的多肽，進一步優(yōu)選上述CH-296,或者與CH-296具有同等功能、具有在構成該片段的多肽的氨基酸序列上有1或多個氨基酸置換、缺失、插入或附加的氨基酸序列的多肽。除此之外，如實施例18所示，本發(fā)明中優(yōu)選使用的纖連蛋白的多肽可以是H-296、CH-271、H-271、C-CS1或與它們具有同等功能、具有在構成該片段的多肽的氨基酸序列上有1或多個氨基酸的置換、缺失、插入或附加的氨基酸序列的多肽。本說明書中的纖連蛋白片段例如可根據(jù)美國專利第5198423號說明書的記載，由基因重組體制備重組纖連蛋白片段的形式。例如，上述H-271(SEQIDNO.10)、H-296(SEQIDNO.ll)、CH-271(SEQIDN0.12)、CH-296(SEQIDN0.13)各片段以及獲得它們的方法在該專利說明書中有詳細記載。另外，對于CH-296Na(SEQIDN0.15)及其制備方法在國際公開第2005/019450號說明書中有記載。上述C-274(SEQIDN0.9)片段可通過美國專利第5102988號說明書記載的方法獲得。并且C-CS1(SEQIDN0.14)片段可通過日本特許第3104178號說明書記載的方法獲得。上述CHV-89(SEQIDN0.16)、CHV-90(SEQIDN0.17)、CHV-179(SEQIDN0.19)的各片段可通過日本特許第2729712號說明書記載的方法獲得。CHV-181(SEQIDNO.20)片段可按照國際公開第97/18318號說明書中記載的方法獲得。CHV-92(SEQIDN0.18)片段可參照日本特許第2729712號說明書和國際公開第97/18318號手冊，根據(jù)在該文獻中記載的質粒構建典型的質粒，使用該質粒、通過遺傳工程學獲得。這些片段或可由這些片段常規(guī)誘導的片段可使用以下述保藏號保藏在千305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所特許生物寄托中心的的微生物制備，或者按照公知的方法將各微生物所保有的質粒進行改變制備；FERMBP-2264(保有編碼H-271的質粒的大腸桿菌；保藏日1989年1月30曰)、FERMBP-2800(保有編碼CH-296的質粒的大腸桿菌；保藏日1989年5月12日)、FERMBP-2799(保有編碼CH-271的質粒的大腸桿菌；保藏日1989年5月12曰)、FERMBP-7420(保有編碼H-296的質粒的大腸桿菌；保藏日1989年5月12曰)、FERMBP-1915(保有編碼CH-274的質粒的大腸桿菌；保藏日1988年6月17曰)、FERMBP-5723(保有編碼C-CS1的質粒的大腸桿菌；保藏日1990年3月5日)、FERMBP-10073(編碼CH-296Na的質粒；保藏日2004年7月23曰)、FERMP-12182(保有編碼CHV-89的質粒的大腸桿菌；保藏日1991年4月8日)、FERMP-12183(保有編碼CHV-179的質粒的大腸桿菌；保藏日1991年4月8曰)。纖連蛋白是巨大的糖蛋白，因此制備天然起源的蛋白質并使用，這在工業(yè)上以及藥物制造上并不容易。另外，纖連蛋白是多功能蛋白，因此，根據(jù)其使用狀況，可能發(fā)生起因于與本發(fā)明的方法顯示效果的區(qū)域不同的區(qū)域的問題。基于該情況，本發(fā)明中，從容易獲得、使用、安全角度考慮，優(yōu)選纖連蛋白片段，進一步優(yōu)選使用上述得到的重組纖連蛋白片段。從實現(xiàn)高的擴大培養(yǎng)率的角度考慮，也優(yōu)選使用上述纖連蛋白片段。本發(fā)明中使用的纖連蛋白片段的分子量沒有特別限定，優(yōu)選1-200kD,更優(yōu)選5-190kD,進一步優(yōu)選10-180kD。該分子量例如可通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定。構成本發(fā)明的纖連蛋白片段的多肽的氨基酸序列中，構成來自天然的纖連蛋白片段的多肽的氨基酸序列之外的氨基酸序列部分只要是不妨礙本發(fā)明所需效果的表達即可，并沒有特別限定。(2)T細胞群的制備方法以下對本發(fā)明的T細胞群的制備方法進行具體說明。本發(fā)明是制備高比例含有T細胞的細胞群的方法，其中，所述T細胞表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28中的至少一種，優(yōu)選表達CD45RA且表達選自CD62L和CCR7的至少一種。本發(fā)明的方法的特征在于在上述纖連蛋白、其片段或它們的混合物的存在下，培養(yǎng)含有T細胞的細胞群。CD45RA、CD62L、CCR7、CD27、CD28均為淋巴細胞的細胞表面抗原標志，已知在幼稚T細胞等未分化的細胞中表達。即，在通過本發(fā)明的制備方法獲得的細胞群中高比例含有的、表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28中的至少一種的T細胞從細胞表面抗原標志的表現(xiàn)型來看，可分類為分化成記憶T細胞之前的未分化細胞，即，幼稚T細胞樣細胞。如上述非專利文獻4和5記載，幼稚T細胞施用于生物體時的生物體內的存活率、細胞增殖效果、向腫瘤聚集的效果、腫瘤特異性效應細胞生成率高，在細胞醫(yī)療領域中有用。并且，如后述實施例3所示，由本發(fā)明的制備方法獲得的T細胞群通過用抗CD3抗體或抗CD28抗體給予刺激，可以形成較多生產IL-2的活化T細胞。如后述實施例4所示，由本發(fā)明的制備方法得到的T細胞群與趨化因子CCL21反應，顯示趨化性，因此也具有向淋巴結轉移的能力。另外，如后述實施例5-8所示，通過對該T細胞群施加抗原刺激，可以誘導具有抗原特異性細活性的CTL。并且如后述實施例9所示，該T細胞群與在纖連蛋白、其片段或它們的混合物非存在下制備的T細胞群相比，在少量IL-2存在下或非存在下的存活性高，可以預想在生物體內的存活性也高。實際上，在后述實施例ll中，將由本發(fā)明的制備方法得到的T細胞群施用于NOD/scid小鼠時，與施用在纖連蛋白、其片段或它們的混合物非存在下制備的T細胞群的情況相比，T細胞與脾臟的結合率高，存活率也高，并且在該實施例中，所施用的T細胞群也引起GVHD反應，因此也顯示具有高細胞毒活性的細胞被誘導。由此，由本發(fā)明的制備方法得到的T細胞群不僅作為細胞表面抗原標志的表現(xiàn)型，也具有適合幼稚T細胞所具有的在細胞醫(yī)療領域中應用的功能。但是另人吃驚的是，如實施例7-(4)、(8)-(2)、15-(4)和16-(2)所示，實施從按照上述方法制備的T細胞群中進一步分離表達選自后述的CD45RA、CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的細胞群的步驟，所得到的T細胞群與由PBMC得到的幼稚T細胞或本發(fā)明的有效成分非存在下得到的顯示同樣表現(xiàn)型的T細胞相比，所誘導的CTL的細胞毒活性高，特異性抗原識別能力也高。即，實施上述分離操作后得到的T細胞群，其在分化成CTL時的細胞毒活性與通常的幼稚T細胞相比顯著高，是在該點與幼稚T細胞不同、含有具更有效的特征的新型的幼稚T細胞樣細胞的細胞群。由上述本發(fā)明的制備方法得到的T細胞群的高的治療效果同樣有望在CD8+、CD4+的任意的幼稚T細胞樣細胞中獲得。并且，如上述專利文獻2所述，通過在纖連蛋白、其片段或它們的混合物的存在下對T細胞進行擴大培養(yǎng)，可以實現(xiàn)非常高的增殖率，由此，本發(fā)明的方法得到的T細胞群極為適合在細胞醫(yī)療領域中應用。本發(fā)明的制備方法中使用的含有T細胞的細胞群例如PBMC、幼稚T細胞、記憶T細胞、造血干細胞、臍帶血單核細胞等。只要是血細胞系細月包即可，均可應用于本發(fā)明。這些細胞可以4吏用由生物體采集的、或者經由生物體外經培養(yǎng)獲得的、例如將由本發(fā)明的方獲得的T細胞群直接或者冷凍保存等的任意形式。還可使用例如對由生物體獲得的、在上述T細胞群的制備中使用的細胞進行各種分離操作而得的細胞群，例如將PBMC等細胞分離成CD8+或CD4+細胞所得的任意的細胞群。在本發(fā)明的T細胞群的制備方法中，可以使用含有上述細胞的材料、例如末梢血、臍帶血等血液，或者從血液中除去紅細胞或血漿等成分所得，骨髓液等。本發(fā)明的T細胞群的制備方法優(yōu)選將總培養(yǎng)天數(shù)定為4-14天。即，總培養(yǎng)天數(shù)為4-14天時，所得T細胞群中表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的T細胞比例高，極為適合應用于細胞醫(yī)療領域?？偱囵B(yǎng)天數(shù)低于4天時，無法獲得可滿足通常的免疫療法中使用的細胞數(shù)。本發(fā)明中，總培養(yǎng)天數(shù)更優(yōu)選5-14天，進一步優(yōu)選7-14天。在本發(fā)明的T細胞群的制備方法中，特別優(yōu)選在總培養(yǎng)期間的至少初期階段、在本發(fā)明的有效成分存在下實施培養(yǎng)，更優(yōu)選至少在培養(yǎng)開始時、在本發(fā)明的有效成分存在下實施培養(yǎng)。在本發(fā)明的有效成分存在下進行的培養(yǎng)可以是培養(yǎng)期間的整個期間，也可以是任意的部分期間。即，只要T細胞的制備步驟的一部分包含上述步驟即可，均包含在本發(fā)明中。優(yōu)選在本發(fā)明的有效成分的存在下進行的培養(yǎng)是由培養(yǎng)開始時至少實施1天或以上，更優(yōu)選3天或以上，進一步優(yōu)選4天或以上。本發(fā)明中，纖連蛋白、其片段或它們的混合物在培養(yǎng)基中的濃度沒有特別限定，例如優(yōu)選0.001-500pg/mL,特別優(yōu)選0.01-500嗎/mL。本發(fā)明中，從有效的進行T細胞對TCR-CD3復合物的刺激、使細胞增殖的角度考慮，優(yōu)選在纖連蛋白、其片段或它們的混合物的存在下進行的培養(yǎng)是在CD3配體的存在下進行。本發(fā)明中，CD3配體只要是與CD3具有結合活性的物質即可，沒有特別限定，例如有抗CD3抗體，特別優(yōu)選例舉抗CD3單克隆抗體，例如有OKT3。CD3配體在培養(yǎng)基中的濃度沒有特別限定，例如，使用抗CD3單克隆抗體時，例如優(yōu)選0.001-100嗎/mL，特別優(yōu)選0.01-100fxg/mL。本發(fā)明中，還可以根據(jù)需要添加CD28配體等其它的輔助刺激因子，導入輔助刺激。例如有抗CD28抗體、CD80、B7-l、B7-2等。本發(fā)明的T細胞群的制備方法中使用的培養(yǎng)基沒有特別限定，可以使用將T細胞擴大培養(yǎng)所必需的成分混合而制備的公知的培養(yǎng)基，例如可適當選擇市售的培養(yǎng)基使用。這些培養(yǎng)基除其原本的構成成分之外，還可以含有細胞因子類、適當?shù)牡鞍踪|、其它的成分。細胞因子類例如有IL-2、IL-7、IL-12、IFN-y等，優(yōu)選使用含有IL-2的培養(yǎng)基。IL-2的培養(yǎng)基中的濃度沒有特別限定，例如優(yōu)選0.01-lxi()Su/mL,更優(yōu)選O.l-lxlO4U/mL。適當?shù)牡鞍踪|例如有抗IL-4抗體。除此之外還可以添加凝集素等淋巴細胞刺激因子。該成分在培養(yǎng)基中的濃度只要是可獲得所需效果即可，沒有特別限定。培養(yǎng)中，可以在培養(yǎng)基中添加血清或血漿。在這些培養(yǎng)基中的添加量沒有特別限定，例如0容量％-20容量％,還可以根據(jù)培養(yǎng)階段改變所使用的血清或血漿的量。例如，可將血清或血漿濃度分階段減少使用。作為血清或血漿的來源，可以是自身(與所培養(yǎng)的細胞的來源相同)或非自身(是指與培養(yǎng)的細胞的來源不同)的任意來源，從安全性的角度考慮，可優(yōu)選使用來自自身的。本發(fā)明的T細胞群的制備通常是在本發(fā)明的上述有效成分存在下、在含有規(guī)定成分的培養(yǎng)基中進行。本發(fā)明中所使用的培養(yǎng)開始時的細月包數(shù)沒有特別限定，例如優(yōu)選1個細J包/mL-lxl()8個細J包/mL，更優(yōu)選1個細胞/mL-5xl(^個細胞/mL,進一步優(yōu)選1個細胞/mL-2x107個細胞/mL。培養(yǎng)條件沒有特別限定，可以采用通常的細胞培養(yǎng)所采用的條件。例如可以在37。C、5%(302的條件下培養(yǎng)。還可以以適當?shù)臅r間間隔加入新鮮的培養(yǎng)基稀釋細胞培養(yǎng)液，或者更換培養(yǎng)基，或者更換細胞培齊用為材。本發(fā)明的T細胞群的制備方法中所使用的細胞培養(yǎng)用器材沒有特別限定，例如可使用培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)袋、大型培養(yǎng)箱、生物反應器等。培養(yǎng)袋可以使用細胞培養(yǎng)用C02透氣性培養(yǎng)袋。工業(yè)化制備大量的T細胞時，可以使用大型培養(yǎng)箱。培養(yǎng)可以在開放系統(tǒng)或封閉系統(tǒng)的任意系統(tǒng)中實施，從所得T細胞的安全性的角度考慮，優(yōu)選在封閉系統(tǒng)中進行培養(yǎng)。將本發(fā)明的有效成分或CD3配體、其它輔助刺激因子、在上述培養(yǎng)基中含有的適當?shù)牡鞍踪|、細胞因子類、其它成分溶解于培養(yǎng)基中，使其共存，除此之外還可以固定在適當?shù)墓滔?、例如培養(yǎng)孤、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)袋等細胞培養(yǎng)用器材(包括開放系統(tǒng)和封閉系統(tǒng))、或者珠、膜、玻片等細胞培養(yǎng)用載體上使用。這些固相材料只要可用于細胞培養(yǎng)即可，沒有特別限定。該成分例如固定在上述器材上時，在將培養(yǎng)基放入該器材時，優(yōu)選相對于放入器材的培養(yǎng)基量使一定量的各成分固定，使其與將該成分溶解于培養(yǎng)基中使用時所需的濃度為同樣的比例，該成分的固定量只要可獲得所需效果即可，沒有特別限定。上述載體可以在細胞培養(yǎng)時浸泡到細胞培養(yǎng)用器材中的培養(yǎng)液中使用。將上述成分固定在上述載體上時，將該載體放入培養(yǎng)基時，優(yōu)選相對于放入器材的培養(yǎng)基量使一定量的各成分固定，使其與將該成分溶解于培養(yǎng)基中使用時所需的濃度為同樣的比例，該成分的固定量只要是可獲得所需效果即可，沒有特別限定。本發(fā)明的有效成分或CD3配體、其它輔助刺激因子固定在固相上的方法沒有特別限定，例如在適當?shù)木彌_液中，使這些物質與固相接觸來固定。纖連蛋白的片段與固相固定時，可按照國際公開第97/18318號說明書、以及國際公開第00/09168號說明書記載的方法實施固定。如果將上述各種成分或本發(fā)明的有效成分固定在固相上，則通過本發(fā)明的方法獲得T細胞群后，只將該T細胞群與固相分離即可以容易地將有效成分等與該T細胞群分離，可以防止有效成分混入到該T細胞群中。本發(fā)明的制備方法也可包含以下步驟在本發(fā)明的有效成分存在下進行培養(yǎng)，將所得T細胞群進一步分離出至少表達選自CD45RA、CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的T細胞群。即，如上所述，在本發(fā)明的有效成分存在下培養(yǎng)得到的T細胞群中，高比例含有表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的T細胞，再通過實施表達選自CD45RACD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一個的表面抗原標志的細胞的分離操作，由此可以以更高的效率獲得幼稚T細胞樣細胞或更高比例含有幼稚T細胞樣細胞的T細胞群。這種情況下，所分離的T細胞可以例舉表達CD45RA的細胞，優(yōu)選表達CD45RA且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的細胞，更優(yōu)選表達CD45RA和CD62L的細胞、表達CD45RA和CCR7的細胞，但并不限于此。分離操作沒有特別限定，例如可使用細胞分選儀、》茲珠、柱等，通過公知的方法分離。例如分離表達CD45RA和CCR7的細胞時，可按照后述實施例3-(3)的記載實施。對由本發(fā)明的方法制備的T細胞進行克隆，由此可以保持穩(wěn)定的T細胞。使用由本發(fā)明的方法得到的T細胞群、進一步通過本發(fā)明的方法或公知的方法培養(yǎng)，可以獲得新的T細胞群。使用由本發(fā)明的方法得到的T細胞群，按照公知的方法例如與后述實施例5-8同樣的方法施加抗原刺激等，由此可以制備抗原特異性CTL。由本發(fā)明的方法得到的T細胞群中，高比例含有表達上述未分化的T細胞——表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的T細胞，但根據(jù)培養(yǎng)中所使用的細胞種類，在該T細胞群中也包含具有細胞毒活性的T細胞。該T細胞群的細胞毒活性可通過公知的體外實驗進行評價，由本發(fā)明得到的T細胞群高比例含有上述的未分化的幼稚T細胞樣細胞，因此，由本發(fā)明的制備方法得到的T細胞群在上述評價系統(tǒng)中未必顯示高的細胞毒活性。可施用由本發(fā)明的方法制備的T細胞群的疾病并沒有特別限定，例如有癌癥、白血病、惡性腫瘤、肝炎，或流感、HRV等病毒、細菌、真菌感染性疾病，例如結核、MRSA、VRE、深層真菌病。還如后所述，如果進一步導入外源基因，則有望對各種基因疾病獲得療效。由本發(fā)明的方法制備的T細胞群也可用于以預防骨髓移植或放射線照射后的感染、緩解白血病再發(fā)為目的供體淋巴細胞輸注等。本發(fā)明還提供T細胞群，該T細胞群由上述本發(fā)明的T細胞群制備方法得到，表達CD45RA、且表達選自CD62LCCR7、CD27和CD28的至少一種。本發(fā)明又提供含有該T細胞群作為有效成分的藥物(治療藥)。含有該T細胞群的上述治療藥適用于免疫療法。在免疫療法中，用于患者治療的T細胞可通過例如注射或點滴等靜脈、動脈、皮下、腹腔內等的施用方法施用于患者。該治療藥在上述疾病或供體淋巴細胞輸注的應用中非常有用。該治療藥可按照制藥領域公知的方法，例如以本發(fā)明的方法制備的該T細胞群作為有效成分，與公知的適合非口服施用的有機或無機載體、賦形劑、穩(wěn)定劑等混合，制成點滴劑、注射劑。治療藥中的本發(fā)明的T細胞群的含量、治療藥的給藥量、與該治療藥相關的各種條件可4艮據(jù)7>知的免疫療法適當確定。例如藥物中本發(fā)明的T細胞群的含量沒有特別限定，例如優(yōu)選lxlO、lxl()H個細胞/mL,更優(yōu)選lxl04-lxl01G個細胞/mL，進一步優(yōu)選lxl05-l><109個細胞/mL。本發(fā)明的藥物的施用量沒有特別限定，例如成人每天優(yōu)選1><106-^1012個細胞/天，更優(yōu)選lxl0、5x1011個細胞/天，進一步優(yōu)選lxl()8-2xl0"個細胞/天?？梢詫⑼ㄟ^該治療藥進行的免疫療法與公知的藥物施用的藥物治療或放射線治療、外科手術治療等治療結合使用。本發(fā)明的T細胞群的制備方法中，可進一步包含向該T細胞中導入外源基因的步驟。即，本發(fā)明的一個方案提供進一步包含向T細胞導入外源基因的步驟的T細胞群的制備方法。"外源基因"是指向基因導入對象T細胞中人工導入的基因，也包含與基因導入對象T細胞為同種來源的基因。通過進行本發(fā)明的T細胞的制備方法，所培養(yǎng)的T細胞的增殖能力增強，通過將本發(fā)明的T細胞的制備方法與基因導入步驟組合使用，有望使基因的導入效率提高。外源基因的導入方法沒有特別限定，可通過公知的基因導入方法選擇適當?shù)姆椒ㄊ褂??；驅氲牟襟E可在T細胞群制備時、在任意時刻實施。例如，在T細胞群制備的同時或中途、或在該步驟之后實施，這從作業(yè)效率的角度考慮優(yōu)選。作為上述基因的導入方法中，使用病毒載體的方法、不使用該病毒載體的方法均可用于本發(fā)明。這些方法的詳細內容已經在很多文獻中有公開發(fā)表。上述病毒載體沒有特別限定，例如可使用通常基因導入方法中所使用的公知的病毒載體，例如可使用反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、猿猴病毒載體、痘苗病毒載體或仙臺病毒載體等。特別優(yōu)選的病毒載體是反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、慢病毒載體或猿猴病毒載體。上述病毒載體優(yōu)選復制功能缺失，在感染的細胞中無法自主復制。另外，在導入基因時也可以使用RetroNectin(注冊商標，TAKARABIO制備)等使基因導入效率提高的物質。反轉錄病毒載體以及慢病毒載體可以使插入到該載體中的外源基因穩(wěn)定地整合到導入了該載體的細胞的染色體DNA中，可用于基因治療等目的。該載體對于分裂、增殖中的細胞的感染效率高，因此優(yōu)選在本發(fā)明的制備步驟中進行基因導入。不使用病毒載體的基因導入方法例如可以采用脂質體法、配體-聚賴氨酸等載體的方法，或者使用磷酸鈣法、電穿孔法、基因槍法等。但這并不限定本發(fā)明。這種情況下，可以向質粒DNA、直鏈狀DNA或RNA中導入要摻入的外源基因。本發(fā)明中，導入到T細胞中的外源基因沒有特別限定，可以選擇希望導入到上述細胞中的任意的基因。上述基因例如除編碼蛋白質(例如酶、細胞因子類、受體類等)的基因之外，還可使用反義核酸或siRNA(小分子干擾RNA)、編碼核酶的基因。還可以同時導入可進行導入基因的細胞的選擇的適當?shù)臉酥净?。上述外源基因例如可以插入到載體或質粒等中使用，在適當?shù)膯幼涌刂葡卤磉_。另外，為了實現(xiàn)效率高的基因轉錄，載體內可以存在與啟動子或轉錄起始位點協(xié)同的其它調節(jié)因素、例如增強子序列或終止子序列。另外，為了通過同源重組將外源基因插入到作為導入對象的T細胞的染色體中，可以使外源基因配置在側翼序列之間，該側翼序列由該基因在該染色體中的所需的目標插入位點的兩側的堿基序列中分別具有同源性的堿基序列形成。所導入的外源基因可以是天然基因，也可以是人工制備的基因，或者是起源不同的DNA分子通過連接等公知方法結合而成。并且，根據(jù)其目的還可以具有在天然序列中導入變異的序列。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以將編碼與癌癥等患者治療中所使用的藥物的抗性相關的酶的基因導入到T細胞中，使該T細胞具有抗藥性。如果使用上述T細胞，則可以將免疫療法與藥物療法組合，因此可以獲得更高的治療效果?？顾幮曰蚶缬卸嗨幠退幓颉Ａ硪环矫?，與上述方案相反，將對特定的藥物具有感受性的基因導入到T細胞中，可以使該藥物具有感受性。這種情況下，通過施用該藥物，可以除去移植到生物體后的T細胞。具有對藥物的感受性的基因例如有胸苷激酶基因。其它的要導入的基因還有編碼識別標記靶細胞表面抗原的TCR的基因，編碼嵌合受體的基因、該嵌合受體具有靶細胞表面抗原的抗體中的抗原識別部位、且含有TCR胞內區(qū)(CD3等)。本發(fā)明還提供疾病的治療方法或預防方法，該方法包含將有效量的由上述方法得到的T細胞群施用于受試體。本說明書中的受試體沒有特別限定，優(yōu)選要施用由本發(fā)明的方法制備的T細胞群的上述疾病的患者。本說明書中，有效量是指在將上述T細胞群施用上述受試體時，與未施用該T細胞群的受試體相比，可發(fā)揮治療或預防效果的該T細胞群的量。具體的有效量根據(jù)給藥形式、給藥方法、使用目的和受試體的年齡、體重、癥狀等適當設定，不能一概而論，優(yōu)選與上述藥物同樣。施用方法也沒有特別限定，例如與上述藥物同樣，可通過點滴或注射等施用。本發(fā)明還提供上述T細胞群在藥物制備中的應用。該藥物的制備方法與上述藥物同樣進行。另外，對于施用該藥物的疾病也沒有特別限定，與上述藥物的同樣。本發(fā)明通過用刺激因子對T細胞群給予刺激，可制備活化的T細胞群，其中，T細胞群由上述本發(fā)明的制備方法得到，表達CD45RA且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種；所述刺激因子是選自可具有呈遞抗原的能力的細胞、呈遞了抗原的細胞、抗原、CD3配體、CD28配體、細胞因子、趨化因子和具有生成細胞因子的能力的細胞的至少一種。本發(fā)明還進一步提供由上述制備方法得到的T細胞群。上述得到的活化的T細胞群與由上述制備方法得到的T細胞群同樣，可作為藥物的有效成分使用。這里，通過刺激因子進行的刺激只要是通過刺激因子使由上述本發(fā)明的制備方法得到的T細胞群活化即可，沒有特別限定，例如可在由本發(fā)明的制備方法得到的T細胞群和刺激因子共存下進行培養(yǎng)。本說明書中，具有呈遞抗原的能力的細胞只要是通常作為抗原呈遞細胞使用的細胞即可，沒有特別限定，例如有樹突細胞、y5T細胞、單核細胞、B細胞、T細胞、巨嗟細胞、成纖維細胞、朗格漢斯細胞、含有其中至少一種細胞的細胞群，特別優(yōu)選樹突細胞、YST細胞、T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞、含有其中至少一種細胞的細胞群。對于待施用的患者來說，具有可呈遞該抗原的能力的細胞的來源可以是自身或非自身，優(yōu)選使用來自自身的。本說明書中，具有可呈遞抗原的能力的細胞是指具有可呈遞抗原的能力，但不呈遞抗原的細胞。本說明書中，呈遞了抗原的細胞可以使用在具有可呈遞上述抗原的能力的細胞中人工附加適當抗原所得的細胞，或者是由生物體采集時已經呈遞了抗原的細胞。呈遞了抗原的細胞可與后述實施例5-(5)所述方法同樣地制備并使用。本說明書中，"呈遞了抗原的細胞"的文字含義并不包含"具有呈遞抗原的能力的細胞"。本說明書中，抗原只要是在抗原呈遞細胞上呈遞肽、被T細胞識別、可高效活化T細胞即可，沒有特別限定，例如有肽、糖肽、腫瘤細胞提取物、胂瘤細胞超聲波提取物和肺瘤細胞熱水處理物、病毒、細菌、蛋白質等。這里，CD3配體、CD28配體的具體例子例如上述的CD3配體或CD28配體。如后述實施例3所示，通過抗CD3抗體和抗CD28抗體對T細胞群施加共刺激，可以制備具有細胞因子生成能力的活化的淋巴細胞群，其中，上述T細胞群由本發(fā)明的制備方法獲得，表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種。本說明書中，細胞因子只要是作用于T細胞并可活化即可，沒有特別限定，例如例如IL-2、IFN-y、TGF-P、IL-15、IL-7、IFN-a、IL-12、CD40L、IL-27等，從使細胞性免疫增強的角度考慮，特別優(yōu)選IL-2、IFN-y、IL-12。本說明書中，趨化因子只要是作用于T細胞并顯示游走活性即可，沒有特別限定，例如有RANTES、CCL21、MIPla、MIP1卩、CCL19、CXCL12、IP-IO、MIG。本說明書中，具有生成細胞因子的能力的細胞只要是具有可生成上述細胞因子的能力的細胞即可，沒有特別限定，例如，從使細胞性免疫增強的角度考慮，優(yōu)選使用Thl細胞。由上述本發(fā)明的制備方法得到的T細胞群高比例含有未分化、未經受抗原刺激的幼稚T細胞樣細胞，因此，這里所使用的刺激因子特別優(yōu)選使用具有可呈遞抗原的能力的細胞、呈遞了抗原的細胞、和/或抗原。例如，如后述實施例5-(5)、6-(8)、7-(2)、8-(1)、14-(7)和15誦(2)所示，通過對由上述本發(fā)明的制備方法得到的T細胞群施加抗原刺激，可誘導細胞毒活性極高、抗原識別能力也高的有用的抗原特異性CTL。另外，該培養(yǎng)除上述刺激因子之外，還可以在上述纖連蛋白、其片段或它們的混合物、或T細胞培養(yǎng)中使用的公知成分的存在下實施培養(yǎng)。這樣制備的T細胞群可形成治療效果高、極為有用的T細胞群。本發(fā)明還提供疾病的治療方法或預防方法，該方法包含向受試體施用有效量的由上述方法得到的活化的T細胞群。本發(fā)明也提供上述活化的T細胞群在藥物制備中的應用。該藥物的制備方法與上述藥物的同樣進行。可施用該藥物的疾病沒有特別限定，與上述藥物同樣。并且，本發(fā)明還提供一種藥物，該藥物包含以下述兩種制劑(a)含有T細胞群作為有效成分的制劑，其中，所述T細胞群由上述本發(fā)明的方法獲得、表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種；以及(b)含有刺激因子作為有效成分的制劑，其中，所述刺激因子選自具有呈遞抗原的能力的細胞、呈遞了抗原的細胞、抗原、CD3配體、CD28配體、細胞因子、趨化因子和具有生成細胞因子的能力的細胞的至少一種；上述制劑作為包含于所述藥物中的不同制劑可同時或分別施用。如上所述，由本發(fā)明的方法獲得的T細胞群高比例含有幼稚T細胞樣細胞，因此，將這些刺激因子與該T細胞群同時或者分別施用于患者，可以最大限度地發(fā)揮所施用的T細胞群的效果，可以表達更高的疾病治療效果。這里，作為刺激因子，本發(fā)明中優(yōu)選^f吏用可施加抗原刺激的因子、即，可用作疫苗使用的因子，例如優(yōu)選具有可呈遞抗原的能力的細胞、呈遞了抗原的細胞、抗原、CD3配體、CD28配體、細胞因子、趨化因子以及具有生成細胞因子的能力的細胞的至少一種，更優(yōu)選使用具有呈遞抗原的能力的細胞，呈遞了抗原的細胞或抗原。該藥物中的(a)含有T細胞群作為有效成分的制劑，其中，所述T細胞群由上述本發(fā)明的方法獲得、表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種；可以與上述含有該T細胞群作為有效成分的藥物同樣地制備并制成制劑。表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的T細胞群的含量或施用量、施用形式并沒有特別限定，例如可以與含有上述的由本發(fā)明的制備方法獲得的T細胞群的藥物同樣。該藥物中的(b)含有刺激因子作為有效成分的制劑，其中，所述刺激因子選自具有呈遞抗原的能力的細胞、呈遞了抗原的細胞、抗原、CD3配體、CD28配體、細胞因子、趨化因子和具有生成細胞因子的能力的細胞的至少一種；例如可以使用將該刺激因子與適當?shù)妮d體組合制成制劑所得。另外，選自具有呈遞抗原的能力的細胞、呈遞了抗原的細胞、抗原、CD3配體、CD28配體、細胞因子、趨化因子和具有生成細胞因子的能力的細胞的至少一種的刺激因子的具體例子例如可以使用上述所例舉的刺激因子。例如，作為刺激因子，使用具有呈遞抗原的能力的細胞、呈遞了抗原的細胞、抗原或具有生成細胞因子的能力的細胞時，可以與適當?shù)狞c滴用或注射用的藥物載體組合制成制劑，但并不限于此。使用抗原肽時，例如可以與適當?shù)淖魟┙M合使用，但并不限于此。使用細胞因子或趨化因子時，可以按照公知的方法摻入到脂質體中制成制劑。該刺激因子在制劑中的含量可根據(jù)所使用的刺激因子的種類適當選擇，例如，刺激因子使用具有可呈遞抗原的能力的細胞、呈遞了抗原的細胞、或具有生成細胞因子的能力的細胞時，例如可優(yōu)選lxl0、lxl(^個細胞/mL,更優(yōu)選lxl()3-lxl08個細胞/mL,進一步優(yōu)選lxl0、lx107個細胞/mL,但并不限于此。另外，該刺激因子的施用形式可根據(jù)所使用的刺激因子的種類適當選擇，例如可通過靜脈內施用、動脈內施用、皮下施用、腹腔內施用、口服施用等施用，但并不限于此。施用量只要是治療或改善患者疾病的有效量即可，沒有特別限定，例如施用具有呈遞抗原的能力的細胞時，例如可優(yōu)選Ixl03-lxl0u個細胞/天，更優(yōu)選lxlO、lxlO"個細胞/天，進一步優(yōu)選&104-1><109個細胞/天；施用抗原肽時，例如優(yōu)選0.001-100mg/天，更優(yōu)選0.003-30mg/天，特別優(yōu)選0.01-10mg/天。作為施用(b)的制劑的優(yōu)選例子，例如優(yōu)選將具有可呈遞抗原的能力的細胞與抗原組合，以(b)的制劑的形式施用。例如，優(yōu)選將樹突細胞與抗原肽組合施用。這種情況下，對于具有呈遞抗原的能力的細胞或抗原制劑中含量或施用量可按照上述實施。該藥物中，(a)的制劑和(b)的制劑的施用可同時或者分別施用于患者，這里，"同時"是指以分別的制劑的形式、在時間上同時施用于患者，或者是在施用于患者之前，將(a)的制劑和(b)的制劑混合施用。例如，將(a)的制劑和(b)的制劑以點滴劑的形式施用時，在施用之前將這些制劑混合施用于患者的方案也包含在本發(fā)明中。另外"分別"是指在時間上分別施用(a)的制劑和(b)的制劑，(a)的制劑和(b)的制劑的施用間隔只要是在患者體內，對于(a)的制劑中所含的T細胞群可施加(b)的制劑中所含的刺激因子的刺激即可，沒有特別限定，優(yōu)選在施用了(a)的制劑之后再施用(b)的制劑。對于施用次數(shù)也沒有特別限定，可以分別為一次或者分多次施用。本發(fā)明還提供疾病的治療方法，該疾病的治療方法包含以下步驟(a)將T細胞群施用于患者的步驟，其中所述T細胞群由上述本發(fā)明的方法獲得、表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種；以及(b)將刺激因子施用于患者的步驟，其中所述刺激因子選自具有呈遞抗原的能力的細胞、呈遞了抗原的細胞、抗原、CD3配體、CD28配體、細胞因子、趨化因子和具有生成細胞因子的能力的細胞的至少一種。如上所述，該治療方法可以發(fā)揮極高的治療效果。這里，刺激因子可以使用可施加抗原刺激的因子，即，可作為疫苗使用的因子，例如，優(yōu)選使用選自具有呈遞抗原的能力的細胞、呈遞了抗原的細胞、抗原、CD3配體、CD28配體、細胞因子、趨化因子和具有生成細胞因子的能力的細胞的至少一種，本發(fā)明更優(yōu)選使用具有呈遞抗原的能力的細胞、呈遞了抗原的細胞或抗原。該治療方法中，(a)將由本發(fā)明的方法得到的T細胞群施用于患者的步驟沒有特別限定，例如可采用與上述的藥物施用方法同樣的施用量、施用形式實施，另外，對于(b)將刺激因子施用于患者的步驟，其中所述刺激因子選自具有呈遞抗原的能力的細胞、呈遞了抗原的細胞、抗原、CD3配體、CD28配體、細胞因子、趨化因子和具有生成細胞因子的能力的細胞的至少一種；也沒有特別限定，例如可采用與上述藥物同樣的施用量、施用形式實施。上述(a)的步驟和(b)的步驟的施用間隔可與上述含有(a)的制劑和(b)的制劑的藥物同樣進行，即，只要是在患者體內，對于由(a)的步驟施用的T細胞群可施加由(b)的步驟所施用的刺激因子的刺激即可，沒有特別限定，可以同時或者分別進行，優(yōu)選在(a)的施用步驟之后進行(b)的施用步驟。對于施用次數(shù)也沒有特別限定，可以分別為一次或分多次進行施用。實施例以下給出實施例，進一步具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些記載的任何限定。實施例1CD45RA+CD62L+T細胞的分析(1)PBMC的分離和保存由知情同意的健康人供體收集血液成份，然后將所采集的血液用磷酸緩沖生理鹽水(以下稱為PBS)稀釋2倍，鋪在Ficoll-paque(7*t'>弋厶^4才廿4工》只制備)上，以600xg離心20分鐘。通過移液管回收中間層的末梢血單核細胞(以下稱為PBMC)并清洗。采集的PBMC懸浮于含有由90%FBS(Cambrex制備)/10。/。DMSO的保存液，或者由含有8%人血清白蛋白(Baxter制備，以下稱為HSA)的CP-1(極東制藥社制備)和RPMI1640培養(yǎng)基(、>/7制備)等量混合液形成的保存液中，在液氮中保存。在T細胞擴大培養(yǎng)時，將這些保存的PBMC在37'C的水浴中迅速融解，用含有10pg/mLDnase(力A匕'才少厶制備)的RPMI1640清洗，然后通過臺盼藍染色法計算存活細胞數(shù)，供給各實驗。(2)抗人CD3抗體和CH-296片段的固定將抗人CD3抗體和CH-296片段固定在在以下實驗中使用的培養(yǎng)器材上。即，向12孔細胞培養(yǎng)板(、夕卜〉.f、少軒〉/》制備)中各添加1.9mL含有抗人CD3抗體(\》七乂77—7公司制備)(終濃度為5叫/mL)的PBS。此時，CH-296添加組的終濃度為25昭/mL。將這些培養(yǎng)器材在室溫下溫育5小時，使用之前一直保存在4°C下。在即將使用時由這些培養(yǎng)材料中吸引除去含有抗體.CH-296的PBS,然后用PBS將各孔清洗2次，用RPMI1640培養(yǎng)基清洗1次，供給各實驗。(3)T細胞群的擴大培養(yǎng)將實施例l-(l)中制備的PBMC懸浮于含有1%人AB型血清(Cambrex制備)的AIM-V(Invitrogen制備，以下簡稱為1%AIM-V)中，濃度為lxl(^個細胞/mL,制備細胞液，然后按照2mL/孔向實施例1-(2)中制備的固定有抗人CD3抗體的板、或固定有抗人CD3抗體和CH-296的板中添加1%AIM-V,分別以1mL/孔添加上述細胞液。添加IL-2(7°口口4軒乂力^f口》制備)，終濃度為1000U/mL，將這些板在5%C02、在37。C下培養(yǎng)(培養(yǎng)第0天)。培養(yǎng)開始第4天以后，使用1%AIM-V,在未進行任何固定的新的12.5cm2細胞培養(yǎng)瓶(《夕卜>f、7^〉卩乂公司制備)中進行傳代培養(yǎng)，添加終濃度為500U/mL的IL-2(培養(yǎng)液量6mL)。即，在培養(yǎng)開始第4天以0.05xl(^個細胞/mL傳代，在第7天以0.1xl(^個細胞/mL傳代，在第10天以0.15xl(^個細胞/mL傳代。培養(yǎng)開始后第7、10、14天，通過臺盼藍染色法計測存活細胞數(shù)，與培養(yǎng)開始時的細胞數(shù)比較，計算擴大培養(yǎng)率。結果如表l所示。[表1]表1放大率(倍率)培養(yǎng)第7天培養(yǎng)第10天培養(yǎng)第14天對照(未固定CH-296)xl4x257x2491CH-296x38x315x4387如表1所示，在T細胞擴大培養(yǎng)初期，在使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材的組中，與對照組比較，在任何培養(yǎng)時期其T細胞群的擴大培養(yǎng)率均高。(4)各培養(yǎng)時期下的CD45RA+CD62L+T細胞的分析將在實施例l-(3)的各培養(yǎng)時期下制備的細胞用PBS、含有1%牛血清白蛋白(以下稱為BSA)的PBS(以下記為1。/。BSA/PBS)清洗。將細胞懸浮于1%BSA/PBS中，添加FITC標記小鼠IgGl/RDl標記小鼠IgGl/PC5標記小鼠IgGl(BeckmanCoulter公司制)作為負對照。同樣地添加FITC標記小鼠抗人CD62L抗體(少夕'^制備)/RDl標記小鼠抗人CD45RA抗體(BeckmanCoulter公司制)。添加各抗體后，在水上培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng)后將細胞用1。/。BSA/PBS清洗，再次懸浮于PBS中。將該細胞供給流式細胞儀(CytomicsFC500:BeckmanCoulter制備)，計算CD45RA+CD62L+T細胞的比例。結果如表2所示。[表2]表2CD45RA+CD62L+T細胞比例(％;)培養(yǎng)第7天培養(yǎng)第10天培養(yǎng)第14天對照(未固定CH-296)29.139.837.5CH-29648.973.851.3如表2所示，使用固定有CH-296片段的培養(yǎng)容器的組中，與對照組比較，培養(yǎng)中的T細胞中的CD45RA+CD62L+T細胞群在培養(yǎng)第7天、第10天、第14天中均得到高的結果。由這些結果可知，通過在擴大培養(yǎng)初期使CH-296片段共存，7-14天內的擴大培養(yǎng)使T細胞群中CD45RA+CD62L+T細胞群比例升高，同時可以擴大培養(yǎng)T細胞。實施例2CD45RA+CCR7+T細胞的分析(l)T細胞群的擴大培養(yǎng)將實施例l-(l)中制備的PBMC懸浮于含有3%人AB型血清的AIM-V(以下簡稱為3%AIM-V),濃度為lxl()6個細胞/mL，制備細胞液，然后以2mL/孔將3%AIM-V添加到實施例l-(2)中制備的固定有抗人CD3抗體的板、或固定有抗人CD3抗體和CH-296的板中，分別以1mL/孔添加上述細胞液。添加IL-2，終濃度為1000U/mL，將這些板在5%C02、在37。C下培養(yǎng)(培養(yǎng)第0天)。培養(yǎng)開始第4天，各組均用含有1%人AB型血清的AIM-V稀釋(液量6mL),濃度為0.075><106個細胞/mL,將培養(yǎng)液轉移至未進行任何固定的12.5cn^細胞培養(yǎng)瓶中，添加IL-2，終濃度為500U/mL。血清濃度可以假設將由30mL采血得到的PBMC用IOL培養(yǎng)基培養(yǎng)來確定。繼續(xù)培養(yǎng)，在第7天，使用含有0.05%人AB型血清的AIM-V進行稀釋，濃度為0.25x106個纟田胞/mL，將所得培養(yǎng)液(液量12.6mL)轉移到未進行任何固定的新的25cm2細胞培養(yǎng)瓶(《夕卜乂.f、^矢7乂》制備)中。添加IL-2,終濃度均為500U/mL。培養(yǎng)開始后第11天，使用含有與第7天相同血清濃度的人AB型血清等AIM-V稀釋細胞液，濃度為1.04xl(^個細胞/mL(液量12.6mL),然后分別轉移到未進行任何固定的25cn^細胞培養(yǎng)瓶中。在各組中添加IL-2，終濃度為500U/mL。培養(yǎng)開始后第14天，通過臺盼藍染色法計測存活細胞數(shù)，與培養(yǎng)開始時的細胞數(shù)進行比較，計算擴大培養(yǎng)率。結果如表3所示。[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>如表3所示，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，在使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材的組中，與對照組相比，T細胞的擴大培養(yǎng)率高。目前，已經表明，CH-296片段適合用于T細胞擴大培養(yǎng)，但該實施例表明，CH-296片段適用于14天T細胞擴大培養(yǎng)。(2)培養(yǎng)后的CD8+T細胞和CD8T細胞亞群中的CD45RA+CCR7+T細胞的分析將實施例2-(l)中制備的細胞用PBS、P/。BSA/PBS清洗。將細胞懸浮于含有1%BSA的PBS中，添加FITC標記小鼠IgGl/RDl標記小鼠IgGl/PC5標記小鼠IgGl+ECD標記小鼠IgGl(BeckmanCoulter制備)作為負對照。同樣，添加RD1標記小鼠抗人CD45RA抗體/FITC標記小鼠抗人CCR7抗體(R&DSYSTEMS公司制備)/ECD標記小鼠抗人CD8抗體(BeckmanCoulter制備)。添加各抗體后，在冰上培養(yǎng)30分鐘。中途每隔IO分鐘緩慢攪拌。培養(yǎng)后，將細胞用1。/。BSA/PBS清洗，再次懸浮于PBS。將該細胞供給流式細胞儀，根據(jù)CD8的染色性分類為CD8+T細胞區(qū)和CD8T細胞區(qū)。對于各細胞群計算CD45RA+CCR7+T細胞的比例。結果如表4和表5所示。[表4]<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>[表5]表5<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>如表4所示，在使用固定有CH-296片段的培養(yǎng)容器的組中，與對照組比較，可得到培養(yǎng)中的T細胞中CD45RA+CCR7+T細胞群高的結果。該現(xiàn)象在對CD8T細胞、即，大部分為CD4+T細胞的細胞群進行分析時也同樣(表5)。這些結果表明，在14天的擴大培養(yǎng)初期，通過使CH-296片段共存，可以提高T細胞的CD45RA+CCR7+T細胞群的比例，同時可以擴大培養(yǎng)T細胞群。實施例3使用CH-296擴大培養(yǎng)的T細胞群中CD45RA+CCR7+T細胞和CD45RA-CCR7T細胞的細胞因子生成性的分析(l)T細胞群的擴大培養(yǎng)將實施例l-(l)中制備的PBMC懸浮于含有0.5%人AB型血清和0.2%HSA的GT-T503培養(yǎng)基(TAKARABIO制備，以下記為0.5。/oGT-T503)中，濃度為0.25x106個細胞/mL,制備細胞液，然后以0.5mL/孔將0.5%GT-T503添加到實施例l-(2)中制備的固定有抗人CD3抗體的板、或固定有抗人CD3抗體和CH-296的板中，以1mL/孔添加上述細胞液。添加IL-2,終濃度為1000U/mL,將這些板在5%C02、在37。C下培養(yǎng)(培養(yǎng)第0天)。培養(yǎng)開始第4天，使用0.5%GT-T503將各組的培養(yǎng)液稀釋為約8倍，將6mL稀釋液轉移到未進行任何固定的12.5cmS的細胞培養(yǎng)瓶中，添加IL-2，終濃度為500U/mL。繼續(xù)培養(yǎng)，在第7天，用0.5。/oGT-T503將各組的培養(yǎng)液稀釋為約4.2倍，將12.6mL稀釋液轉移到未進行任何固定的新的25cm2細胞培養(yǎng)瓶中。添加IL-2,終濃度均為500U/mL。培養(yǎng)開始第10天，使用含有0.2%HSA的GT-T503培養(yǎng)基，將各組的細胞培養(yǎng)液稀釋為約2倍，將12.6mL稀釋液分別轉移到未進行任何固定的新的25cm2細胞培養(yǎng)瓶中。在各組中添加IL-2,終濃度為500U/mL。培養(yǎng)開始后第14天，通過臺盼藍染色法計測存活細胞數(shù)，與培養(yǎng)開始時的細胞數(shù)比較，計算擴大培養(yǎng)率。結果如表6所示。[表6]表6放大率(倍率)對照(未固定CH-296)xl72CH-296x581如表6所示，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材的組(以下為CH-296組)中，與對照組比較，T細胞群的擴大培養(yǎng)率高。(2)CD45RA+CCR7+T細胞的分析將實施例3-(l)中制備的細胞按照與實施例l-(4)同樣的方法，用各抗體染色，進行分析?？贵w的組合如下。即，用FITC標記小鼠IgGl/RDl標記小鼠IgGl/PC5標記小鼠IgGl和RD1標記小鼠抗人CD45RA抗體/FITC標記小鼠抗人CCR7抗體進行染色。將它們通過流式細胞儀進行分析，計算CD45RA+CCR7+T細胞的比例。結果如表7所示。[表7]表7CD45RA+CCR7+T細胞(％)對照(未固定CH-296)21.2CH-29663.7如表7所示，在CH-296組中，與對照組比較，得到了培養(yǎng)中的T細胞群中CD45RA+CCR7+T細胞群高的結果。(3)由T細胞群擴大培養(yǎng)后的細胞分離CD45RA+CCR7+T細胞和CD45RA-CCR7T細胞按照與實施例2-(2)同樣的方法，對實施例3-(l)中制備的細胞進行染色，然后將細胞用1%BSA/PBS清洗，懸浮于GT-T503培養(yǎng)基中。將該細胞用Moflo(Dako制備)分選為CD8+T細胞的CD45RA+CCR7+T細胞和CD45RA-CCR7T細胞，同樣，分選出CD8—T細胞、即，大部分為CD4+T細胞的CD45RA+CCR7+T細胞和CD45RA—CCR7T細胞。還將同樣的分選前的染色細胞供給流式細胞儀，根據(jù)CD8的染色性分類為CD8+T細胞區(qū)和CD8-T細胞區(qū)，對于各細胞群計算CD45RA+CCR7+T細胞的比例。結果如表8和表9所示。[表8]表8CD8+T細胞<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>[表9]表9CD8T細胞(CD4+T細胞)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>如表8所示，對于CD8+T細胞，在CH-296組中，與對照組相比，可得到培養(yǎng)后的T細胞群中CD45RA+CCR7+T細胞群的比例高的結果。該現(xiàn)象在對CD8T細胞、即，大部分為CD4+T細胞的細胞群進行分析時也同樣(表9)。(4)抗人CD3抗體和抗人CD28抗體的固定將抗人CD3抗體和抗人CD28抗體固定在以下的實驗中使用的培養(yǎng)器材上。即，向96孔細胞培養(yǎng)板(BeckmanCoulter制備)中添加各80pL含有抗人CD3抗體(2pg/mL)的乙酸緩沖液(pH5.3)，再分別添加804L含有抗人CD28抗體(Dako制備)(20pg/mL)的乙酸緩沖液?？谷薈D3抗體的終濃度為1昭/mL，抗人CD28抗體的終濃度為10昭/mL。將這些培養(yǎng)器材在室溫下培養(yǎng)5小時，在使用之前一直保存在4。C下。在即將使用之前，從這些器材中吸引除去含有抗體的乙酸緩沖液，將各孔用PBS清洗兩次，用GT-T503培養(yǎng)基清洗一次，用于實驗。(5)細胞的刺激已知幼稚T細胞或中央型記憶T細胞在體內受到抗原刺激時較多生成IL-2。還已知效應記憶T細胞受到抗原刺激時較多生成IFN-y或IL-4。為了確認在實施例3-(3)中得到的各細胞組分是否保持這些功能，測定用抗CD3抗體和抗CD28抗體刺激時生成細胞因子的能力。將在實施例3-(3)中得到的各細胞群回收，然后懸浮于0.5%GT-T503中，計測細胞數(shù)。向實施例3-(4)中制備的固定有抗人CD3抗體和抗人CD28抗體的板、向各孔中添加細胞，濃度為2xl()S個細胞/0.2mL，在5%C02、在37。C下培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后回收培養(yǎng)上清，用于ELISA法的細胞因子測定實驗。(6)通過ELISA法測定細胞因子的生成如實施例3-(3)所示，在CH-296組中，與對照組相比，可得到CD45RA+CCR7+T細胞比例高的結果。為了確認該CD45RA+CCR7+T細胞群是否可保持幼稚T細胞樣細胞的性質，對T細胞群擴大培養(yǎng)后分離的CD45RA+CCR7+T細胞和CD45RA-CCR7T細胞的細胞因子生成性進行評價。IL-2、IFN-y的生成是使用ELISA發(fā)育試劑盒(R&DSYSTEMS公司制備)，IL-4的生成是使用READY-SET-GO!人白細胞介素-4(eBioscience制備)進行測定。對照組和CH-296組中各細胞因子的生成結果分別如表10和表11所示。[表10]表10<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>如表10、ll所示，在對照組和CH-296組中，可見IL-2的生成。在各組中，均為CD8T細胞比CD8+T細胞的生成量多，CD45RA+CCR7+T細l包比CD45RA—CCR7T細胞的生成量多。由此顯示，T細胞群擴大培養(yǎng)得到的CD45RA+CCR7+T細胞群具有幼稚T細胞樣細胞的性質。另一方面，對于IFN-y和IL-4中，在對照組和CH-296組中，均為在CD45RA-CCR7T細胞中優(yōu)先生成，顯示CD45RA—CCR7T細胞群是維持效應記憶功能的細胞群。實施例4使用CH-296擴大培養(yǎng)的T細胞群的趨化性分析(1)抗人CD3抗體和CH-296片段的固定按照與實施例l-(2)同樣的方法進行。含有抗人CD3抗體(終濃度為5嗎/mL)的PBS分別添加0.45mL。(2)T細胞群的擴大培養(yǎng)培養(yǎng)開始第4天，稀釋為約14倍，將10mL稀釋液添加到25cm2細胞培養(yǎng)瓶(3—->/制備)中，在培養(yǎng)開始第8天，稀釋為約2倍，將10mL稀釋液添加到25cm2細胞培養(yǎng)瓶(-一-》夕、、制備)中，培養(yǎng)開始第11天，將10mL含有0.2%HSA的GT-T503培養(yǎng)基添加到各培養(yǎng)瓶中，除此之外按照實施例3-(l)進行。擴大培養(yǎng)率的結果如表12所示。[表12]表12<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>如表12所示，T細胞群擴大培養(yǎng)初期，使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材的組(以下稱為CH-296組)中，與對照組比較，T細胞群的擴大培養(yǎng)率高。(3)CD45RA+CCR7+T細胞的分析按照與實施例3-(2)同樣的方法，計算實施例4-(2)中制備的細胞中CD45RA+CCR7+T纟田月包的比例。結果如表13所示。[表13]表13CD45RA+CCR7+T細胞(％)對照(未固定CH-296)31.5CH-29656.8如表13所示，CH-296組與對照組比較，可得到培養(yǎng)中的T細胞群中CD45RA+CCR7+T細胞群高的結果。(4)趨化性的分析在CH-296組中，與對照組比較，可得到CD45RA+CCR7+T細胞群比例高的結果。幼稚T細胞或中央型記憶T細胞(七>卜，A乂乇卩一)等CCR7陽性細胞與趨化因子CCL21反應，顯示趨化性。這些細胞是由血管向淋巴結遷移中重要的事件，這確認了擴大培養(yǎng)后得到的細胞是否對CCL21具有趨化性。將實施例4-(2)得到的細胞離心，除去上清，然后懸浮于含有0.5%BSA的RPMI1640培養(yǎng)基(以下記為反應培養(yǎng)基)中，濃度為5xl(^個細胞/mL。向孔培養(yǎng)板(Transwell聚碳酸酯24孔5pm孔徑、3—->夕'制備)的下層添加600含有終濃度為1嗎/mL的CCL21(R&DSYSTEMS公司制備)的反應培養(yǎng)基，在上層添加制備的lOOiiL細胞懸浮液。在37。C下培養(yǎng)2小時，然后測定遷移到下層的細胞數(shù)和上層所殘留的細胞數(shù)。趨化的細胞的比例按下式(l)計算[數(shù)1]趨化的細胞比例(％)=(遷移至下層的細胞數(shù))+(殘留在上層的細胞數(shù)+遷移至下層的細胞數(shù))xl00該結果如表14所示。[表14]表14遷移的細胞的比例(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>如表14所示，在對照組和CH-296組中均確認了與CCL21反應、顯示趨化性的細胞，CH-296組的比例。即，在T細胞群擴大培養(yǎng)時，通過使用CH-296,可以較多獲得具有向淋巴結遷移的能力的細胞。實施例5由使用CH-296擴大培養(yǎng)的細胞群誘導抗MART-1CTL(1)抗人CD3抗體和CH-296片段的固定按照與實施例4-(l)同樣的方法進行。(2)T細胞群的擴大培養(yǎng)按照與實施例4-(2)同樣的方法進行。擴大培養(yǎng)率的結果如表15所示。[表15]表15<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>如表15所示，在擴大培養(yǎng)初期，在使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材的組(以下為CH-296組)中，與對照組比較，擴大培養(yǎng)率高。(3)CD45RA+CCR7+、CD45RA+CD62L+T細胞的分析通過與實施例l-(4)同樣的方法，將實施例5-(2)中制備的細胞用各抗體染色，進行分析。抗體的組合如下。即，通過FITC標記小鼠IgGl/RDl標記小鼠IgGl(均為Dako制備)、RDl標記小鼠抗人CD45RA抗體/FITC標記小鼠抗人CCR7抗體以及RD1標記小鼠抗人CD45RA抗體/FITC標記小鼠抗人CD62L抗體(以后的抗人CD62L抗體由eBioscience制備)進行染色。將它們通過流式細胞儀進行分析，計算CD45RA+CCR7+、CD45RA+CD62L+T細胞的比例。結果如表16所示。[表16]表16對照(未固定CH-296)CH-296CD45RA+CD62L+T細胞(％)60.276.9CD45RA+CCR7+T細胞(％)47.175.0如表16所示，CH-296組與對照組比較，在各細胞表面標志均顯示高的數(shù)值。(4)培養(yǎng)細胞的保存實施例5-(2)中制備的培養(yǎng)第14天的細胞懸浮于保存液中，在液氮中保存，其中，所述保存液含有90%FBS/10%DMSO或8%HSA的CP-1與RPMI1640培養(yǎng)基的等量混合液。在CTL誘導時，將這些保存培養(yǎng)細胞在37。C的水浴中快速融解，用含有10pg/mLDNase的RPMI1640培養(yǎng)基清洗，通過臺盼藍染色法計算存活細胞數(shù)，供給各實驗。(5)抗腫瘤相關抗原(MART-1)特異性CTL的誘導使用實施例5-(4)中制備的細胞，進行抗腫瘤相關抗原(T細胞黑素瘤相關抗原，MART-1)特異性CTL的誘導?？鼓[瘤相關抗原(MART-1)特異性CTL的誘導可將PlebanskiM.等人.，Eur.J.Immunol"第25巻、第6號、第1783-1787頁(1995)的方法進行部分改變來實施。即，使用實施例l-(l)中制備的PBMC作為抗原呈遞細胞，在作為抗原肽的40pg/mL來自黑素瘤抗原MART-1的表位肽(序列表中SEQIDN0.22的來自黑素瘤抗原MART-1的HLA-2.1結合性肽)，具備含3嗎/mL^微球蛋白(Scrips制備)的5%人AB型血清、0.1mMNEAA混合液、1mM丙酮酸鈉、2mML-谷氨酰胺(均為Cambrex制備)、100|ig/mL硫酸鏈霉素(明治制果制備)的RPMIIMO培養(yǎng)基(以下簡稱為5HRPMI)中，在37。C下、在5。/。C02培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2小時。培養(yǎng)結束后照射X射線(1.42C/kg),用5HRPMI制備成3-4xl()6個細胞/mL。另一方面，將實施例5-(4)中制備的培養(yǎng)細胞懸浮于5HRPMI中，濃度為2xl()6個細胞/mL,在24孑L細胞培養(yǎng)板(BectonDickenson制備)中分別添加0.5mL/孔。向各孔中各添加0.5mL/孔按照上述方法制備的抗原呈遞細胞，添加IL-7(R&DSYSTEMS公司制備)和KLH(力/L匕'才少厶制備)，終濃度分別為25ng/mL、5昭/mL。將板在5%(:02培養(yǎng)箱、在37。C下培養(yǎng)。培養(yǎng)開始后第1天，將1mL含有60U/mLIL-2的5HRPMI添加到各孔中。培養(yǎng)開始后第4天，將培養(yǎng)上清除去一半，然后將1mL含有60U/mLIL-2的5HRPMI添加到各孔中。第7天，與上述同樣地制備抗原呈遞細胞，然后照射X射線(1.42C/kg)，制備成4xl(^個細胞/mL，向新的24孔細胞培養(yǎng)板中各添加0.5mL/孔。將培養(yǎng)1周的反應細胞(kX水y夕'一細胞)(一部分細胞是將細胞毒活性測定中直接繼續(xù)培養(yǎng))懸浮于5HRPMI,濃度為1.8-2.(^106個細胞/mL,向同樣的板中添加0.5mL/孔，再加入終濃度為25ng/mL的IL-7,進行再刺激。培養(yǎng)開始第8天，將lmL含有60U/mL的IL-2的5HRPMI添加到各孔中。培養(yǎng)開始的第ll天，使各孔內的細胞懸浮后，分成兩個孑L,每孔為半量，向各孔中添加1mL含有60U/mLIL-2的5HRPMI,繼續(xù)培養(yǎng)至第15天。(6)擴大培養(yǎng)率的測定對于實施例5-(5)所得的細胞，在培養(yǎng)開始第7天、第14天，通過臺盼藍染色法計測存活細胞數(shù)，與培養(yǎng)開始時的細胞數(shù)比較，計算擴大培養(yǎng)率。結果如表17所示。[表17]培養(yǎng)天數(shù)對照(未固定CH-296)CH-296第7天xl.5xl.9第14天x6.0x8.4如表17所示，在由CH-296組誘導的CTL群中，與對照組比較，CTL群的擴大培養(yǎng)率高。即，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，由使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材的培養(yǎng)細胞進行CTL誘導，可獲得更多的CTL群。(7)細胞毒活性的測定實施例5-(5)中制備的誘導開始后第15天的CTL的細胞毒活性是按照使用鈣熒光素-AM的細胞毒活性測定法[LichtenfelsR.等人、J.Immunol.Methods,第172巻、第2號、第227-239頁(1994)]進行評價。即，將與表位肽共培養(yǎng)一晚、或在表位肽非存在下進行培養(yǎng)的保持HLA-A2.1細胞林T2細胞(ATCCCRL-1992)懸浮于含有5%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，濃度為lxl(^個細胞/mL,然后添加4丐焚光素-AM(同仁化學研究所制備)，終濃度為25在37。C下培養(yǎng)1小時。將細胞用不含有鈣熒光素-AM的培養(yǎng)基清洗，制備鈣熒光素標記靶細胞。鈣熒光素標記耙細胞與30倍量的K562細胞(匕工一^:/廿4工>義研究資源戸>夕JCRB0019)混合，作為細胞毒活性測定用細胞。K562細胞用于排除混入到反應細胞中的NK細胞導致的非特異性毒活性。實施例5-(5)中制備的CTL作為效應細胞，用5HRMPI梯度稀釋，濃度為3xl0S-3xl()G個細胞/mL，然后向96孔細胞培養(yǎng)板的各孔中分注100pL/孔，以100[xL/孔向其中添加細胞毒活性測定用細胞，該細胞毒活性測定用細胞制備成lxlO"mL的鉤焚光素標記靶細胞。此時，效應細胞(E)與釣焚光素標記靶細胞(T)的比以E/T表示，對E/T比30、10、3進行測定。加入了上述細胞懸浮液的板在400xg中離心1分鐘，然后在5。/oC02培養(yǎng)箱內、在37。C下培養(yǎng)4小時。然后由各孔中采集100nL培養(yǎng)上清，通過熒光板讀板儀(《^卜一^K制備)(激發(fā)485nm/測定538或535nm)測定釋放到培養(yǎng)上清中的鈣熒光素的量。"特異性細胞毒活性(％)"按照下式(2)計算[數(shù)2]特異性細胞毒活性(％)={(各孔的測定值-最小釋放量)/(最大釋放量-最小釋放量)}><100上式中，最小釋放量是指只含有細胞毒活性測定用細胞的孔的鈣熒光素釋放量，表示來自鈣熒光素標記靶細胞的鈣熒光素自然釋放量。最大釋》文量表示在細胞毒活性測定用細胞中加入0.1%表面活性劑TritonX-100(NakalaiTesque制備)、完全破壞細胞時的4丐熒光素釋放量。細胞毒活性測定結果如表18所示。[表18]表18乾細胞.E/T細胞毒活性(%)對照(未固定CH-296)CH-296T230<0<010<0<03<0<0T2+MART-l肽3062.087.21029.160.丄3■9.22.6,3如表18所示，由CH-296組誘導的CTL群中，與對照組比較，CTL群的特異性細胞毒活性高。即，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材的培養(yǎng)細胞可被誘導為特異性細胞毒活性更高的CTL群。實施例6CH-296初期刺激后使用透氣性培養(yǎng)袋擴大培養(yǎng)的細胞群的同種異型(Allogeneic)MLR以及抗MART-1CTL的誘導(1)抗人CD3抗體和CH-296片段的固定將抗人CD3抗體和CH-296固定在以下實驗中使用的培養(yǎng)器材中。即，在75cm2細胞培養(yǎng)瓶(BectonDickenson制備)中各添加9mL含有抗人CD3抗體(終濃度5pg/mL)的PBS。此時，CH-296添加組是添加CH-296,終濃度為25pg/mL。將這些培養(yǎng)器材在室溫下培養(yǎng)5小時，使用之前一直保存在4°C下。即將使用時，由這些培養(yǎng)器材中吸引除去含有抗體CH-296的PBS，將各培養(yǎng)瓶用PBS清洗2次，用RPMI培養(yǎng)基清洗1次，用于實驗。(2)T細胞群的擴大培養(yǎng)將實施例l-(l)中制備的PBMC懸浮于0.5%GT-T503中至濃度為0.5xl06個細胞/mL制備細胞液，然后向已添加了21mL/培養(yǎng)瓶0.5%GT-T503的實施例6-(l)中制備的固定有抗人CD3抗體的培養(yǎng)瓶、述細胞液。添加IL-2，終濃度為1000U/mL,將這些培養(yǎng)瓶在5%C02、在37。C下培養(yǎng)(培養(yǎng)第0天)。培養(yǎng)開始第4天，將14mL各組的培養(yǎng)液和186mL0.5%GT-T503轉移到未進行任何固定的透氣性培養(yǎng)袋(200cm2，TAKARABIO制備，商品編號KB610)。再添加IL-2,終濃度為500U/mL。繼續(xù)培養(yǎng)，在第8天除去100mL各組的培養(yǎng)液，將100mL殘留在袋中，使用0.5%GT-T503稀釋為2倍，使袋內的細胞稀釋液為200mL。添加IL-2,終濃度均為500U/mL。培養(yǎng)開始后第11天，添加200mL含有0.2%HSA的GT-T503培養(yǎng)基，將各組的細胞培養(yǎng)液稀釋為2倍。再在各組中添加IL-2，終濃度為500U/mL。培養(yǎng)開始后第14天，通過臺盼藍染色法計測存活細胞數(shù)，與培養(yǎng)開始時的細胞數(shù)比較，計算擴大培養(yǎng)率。該結果如表19所示。[表19]表19放大率(倍率)對照(未固定CH-296)x225CH-296x333如表19所示，與對照組比較，使用透氣性培養(yǎng)袋培養(yǎng)時，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材的組(以下為CH-296組)中T細胞群的擴大培養(yǎng)率高。(3)通過透氣性培養(yǎng)袋培養(yǎng)的T細胞群中CD45RA+CCR7+、CD45RA+CD62L+、CD45RA+CD27+、CD45RA+CD28+、CD27+CD28+、CD45RA+CCR7+CD62L+T細胞的分析按照與實施例l-(4)同樣的方法，將實施例6-(2)中制備的細胞用各抗體染色，進行分析?？贵w的組合如下。即，用FITC標記小鼠IgGl/RDl標記小鼠IgGl/PC5標記小鼠IgGl、RD1標記小鼠抗人CD45RA抗體/FITC標記小鼠抗人CCR7抗體、RD1標記小鼠抗人CD45RA抗體/PC5標記小鼠抗人CD62L抗體(BeckmanCoulter制備)、RD1標記小鼠抗人CD45RA抗體/FITC標記小鼠抗人CD28抗體(eBioscience制備)、RD1標記小鼠抗人CD45RA抗體/PC5標記小鼠抗人CD27抗體(BeckmanCoulter制備)、以及RD1標記小鼠抗人CD45RA抗體/FITC標記小鼠抗人CCR7抗體/PC5標記小鼠抗人CD62L抗體進行染色。將它們通過流式細胞儀進行分析，計算CD45RA+CCR7+、CD45RA+CD62L+、CD45RA+CD27+、CD45RA+CD28+、CD27+CD28+、CD45RA+CCR7+CD62L+T細胞的比例。結果如表20所示。[表20]表20<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>如表20所示，CH-296組與對照組比較，其細胞表面標志均顯示高值。已知CD27或CD28在幼稚T細胞等未分化的細胞中表達率高，通過它們的標志進行分析，表明在培養(yǎng)初期使CH-296與其作用，可以提高培養(yǎng)中的T細胞群的幼稚T細胞樣細胞群比例。(4)同種異型MLR使用實施例6-(2)中制備的細胞進行同種異型MLR。即，將按照與實施例l-(l)同樣的方法制備的來自同種異型供體(非自身供體與實施例6-(2)中使用的供體不同的供體)的PBMC照射X射線(0.88C/kg)，用5HRPMI制備成2xl06個細胞/mL(刺激細胞)。另一方面，將實施例6-(2)中制備的培養(yǎng)細胞懸浮于5HRPMI中，濃度為2xl(^個細胞/mL(反應細胞)。向24孔細胞培養(yǎng)板中各以0.5mL/孔添加刺激細胞和反應細胞。向各孔中添加IL-2，終濃度為500U/mL,然后將板在5%C02培養(yǎng)箱、在37。C下培養(yǎng)。培養(yǎng)開始后第3天，將1mL含有1000U/mLIL-2的5HRMPI添加到各孔中。培養(yǎng)開始第5天，除去一半培養(yǎng)上清，然后向各孔中添加1mL含有1000U/mLIL-2的5HRPMI,第7天，使各孔內的細胞懸浮，分成兩個孔每孔各半量，向各孔中添加1mL含有1000U/mLIL-2的5HRPMI,繼續(xù)培養(yǎng)至第10天。(5)擴大培養(yǎng)率的測定對于在實施例6-(4)中得到的細胞，在培養(yǎng)開始后第7天、第10天，通過臺盼藍染色法計測存活細胞數(shù)，與培養(yǎng)開始時的細胞數(shù)比較，計算擴大培養(yǎng)率。結果如表21所示。[表21]表21<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>如表21所示，使用CH-296組進行同種異型MLR時，與對照組比較，反應后的擴大培養(yǎng)率高。即，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，用使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材得到的培養(yǎng)細胞進行同種異型MLR，則可見更多的同種異型抗原識別細胞增殖。(6)細胞毒活性的測定實施例6-(4)中制備的誘導開始后第IO天的細胞的細胞毒活性按照與實施例5-(7)同樣的方法進行。此時的靶細胞是將用植物凝集素(以下簡稱為PHA)進行10天母細胞化的自身PBMC或非自身PBMC作為鈣熒光素標記靶細胞。細胞毒活性測定時，將30倍量的K562細胞與鈣熒光素標記靶細胞混合。細胞毒活性測定結果如表22所示。[表22]表22<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>如表22所示，由CH-296組進行同種異型MLR時，與對照組相比，反應后的抗原特異性細胞毒活性高。即，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，在使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材得到的培養(yǎng)細胞中，通過同種異型MLR可得到抗原特異性細胞毒活性更強的細胞群。(7)培養(yǎng)細胞的保存實施例6-(2)中制備的培養(yǎng)第14天的細胞按照與實施例5-(4)同樣的方法冷凍保存、融解，供各實驗用。(8)抗腫瘤相關抗原(MART-1)特異性CTL的誘導使用實施例l-(l)和6-(7)中制備的細胞，按照與實施例5-(5)同樣的方法進行抗腫瘤相關抗原(MART-1)特異性CTL的誘導，繼續(xù)培養(yǎng)13天。對于以下的內容進行變更。將實施例6-(7)中制備的培養(yǎng)細胞懸浮于5HRPMI中，濃度為lxl(^個細胞/mL;培養(yǎng)開始第2天，向各孔中添加1mL含有60U/mLIL-2的5HRPMI;培養(yǎng)開始第6天，將反應細胞懸浮于5HRPMI中，濃度為0.3-1.3xl(^個細胞/mL,將抗原呈遞細胞懸浮于5HRPMI中，濃度為1.6xl(^個細胞/mL;培養(yǎng)開始第7天，向各孔中添加1mL含有60U/mLIL-2的5HRPMI;在培養(yǎng)開始第10天，使各孔內的細胞懸浮，分成兩個孔各半量，向各孔中添加lmL含有60U/mLIL-2的5HRPMI。(9)細胞毒活性的測定實施例6-(8)中制備的誘導開始后第13天的CTL的細胞毒活性測定重新設定為E/T的比為90,除此之外按照與實施例5-(7)同樣的方法進行。細胞毒活性的測定結果如表23所示。[表23]表23<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>N.T.:未進行試驗如表23所示，在由CH-296組誘導的CTL群中，與對照組和PBMC組比較，CTL群的特異性細胞毒活性高。即，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材可使培養(yǎng)細胞被誘導為特異性細胞毒活性高的CTL群。實施例7由來自擴大培養(yǎng)細胞的CD45RA+CCR7+CD8+T細胞和CD45RA-CCR7-CD8+T細胞對抗MART-1CTL的誘導(1)CD45RA+CCR7+CD8+T細胞和CD45RA-CCRTCD8+T細胞的分離按照與實施例2-(2)同樣的方法，對實施例l-(l)和實施例6-(7)中制備的細胞進行染色，然后用1%BSA/PBS清洗細胞，懸浮于IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen制備)中。將該細胞供給高速分選儀Moflo，分別分離出CD45RA+CCR7+CD8+組分和CD45RA-CCRTCD8+組分，得到純度為92-99%的組分。(2)抗肺瘤相關抗原(MART-1)特異性CTL的誘導使用實施例7-(l)中制備的細胞，按照與實施例6-(8)同樣的方法進行抗腫瘤相關抗原(MART-1)特異性CTL的誘導，繼續(xù)培養(yǎng)13天。對于以下的內容進行變更。培養(yǎng)開始時將各0.25mL培養(yǎng)開始細胞和抗原呈遞細胞添加到48孔培養(yǎng)板中(BectonDickenson制備)；培養(yǎng)開始第2天，向各孔中添加0.5mL含有60U/mLIL-2的5HRPMI;培養(yǎng)開始第4天，除去一半培養(yǎng)上清，然后向各孔中添加0.5mL含有60U/mLIL-2的5HRPMI。(3)擴大培養(yǎng)率的測定對于實施例7-(2)所得的細胞，在培養(yǎng)開始后第13天，通過臺盼藍染色法計測存活細胞數(shù)，與培養(yǎng)開始時的細胞數(shù)比較，計算擴大培養(yǎng)率。結果如表24所示。[表24]表24培養(yǎng)開始細胞-擴大培養(yǎng)率對照(未固定(:11-296)CH-296CD45RA+CCR7+CD8+T細胞x1.2x7.8CD45RA-CCRTCD8+T細胞x0.8x1.2如表24所示，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，使用CD45RA+CCR7+CD8+T細胞誘導的CTL群中，與對照組比較，CTL群的擴大培養(yǎng)率高，其中所述CD45RA+CCR7+CD8+T細胞是從使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材得到的培養(yǎng)細胞(CH-296組)中分離的。即，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，由CD45RA+CCR7+T細胞進行CTL誘導，可以獲得更多的CTL群。其中，所述CD45RA+CCR7+T細胞在使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材得到的培養(yǎng)細胞中高比例存在。(4)細胞毒活性的測定實施例7-(2)中制備的誘導開始后第13天的CTL的細胞毒活性按照與實施例5-(7)同樣的方法進行。細胞毒活性測定結果如表25所示。[表25]表25<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>N.T.:未進行試一瞼如表25所示，在使用由CH-296組分離的CD45RA+CCR7+CD8+T細胞誘導的CTL群中，與對照組和PBMC組比較，CTL群的特異性細胞毒活性高。并且，與使用CD45RA-CCRJ-CD8+T細胞誘導的CTL群比較，特異性細胞毒活性高。即，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材得到的培養(yǎng)細胞中高比例含有的CD45RA+CCR7+T細胞可以被誘導為特異性細胞毒活性更高的CTL群。實施例8CTL的抗原識別能力測定(1)抗腫瘤相關抗原(MART-1)特異性CTL的誘導使用實施例l-(l)和6-(7)中制備的細胞，按照與實施例6-(8)同樣的方法進行抗腫瘤相關抗原(MART-1)特異性CTL的誘導，繼續(xù)培養(yǎng)14天。(2)抗原識別能力的測定實施例8-(l)中制備的誘導開始后第14天的CTL的抗原識別能力是將ValmoriD.等人、J.Immunol.、第160巻、第1750-1758頁(1998)]的方法進行部分改變實施。即，將T2細胞懸浮于含有5%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，濃度為1x106個細胞/mL,然后添加釣熒光素-AM,終濃度為25在37。C下培養(yǎng)1小時。培養(yǎng)后的細胞用不含有鉤熒光素-AM的培養(yǎng)基清洗，制備成2xl()S個細胞/mL。將釣熒光素標記耙細胞以50^L/孔分別分注到96孔細胞培養(yǎng)板的各孔中。以50jxL/孔向加入了這些細胞的各孔中添加含有0-20抗原肽(來自黑素瘤抗原MART-1的表位肽)的5HRPMI。將上述板在5%(:02培養(yǎng)箱內、在37°C下培養(yǎng)1小時。以50pL/孔向培養(yǎng)后的各孔中添加含有30倍量K562細胞的細胞懸浮液(調節(jié)為6x106個細胞/mL)。將實施例8-(l)中制備的CTL作為效應細胞，用5HRPMI調節(jié)為6xl(^個細胞/mL，然后以50(iL/孔分別添加到板的各孔中。將加入了上述細月包懸浮液的板以400xg離心1分鐘，在5%。02培養(yǎng)箱內、在37°C下培養(yǎng)4小時。然后由各孔采集100jiL培養(yǎng)上清，通過熒光讀板儀(485nm/535nm)測定釋放到培養(yǎng)上清中的釣熒光素量。"特異性細胞毒活性(%)"按照之前的式(2)計算。抗原識別能力測定結果如表26所示。以附加到靶細胞上的肽的濃度為10pM時的細胞毒活性為100,抗原識別能力表示為各附加肽濃度下的細胞毒活性的相對值。[表26]表26附加在把細胞上的肽終濃度(mM)相對于附加肽為IOuM時.始細胞喜活性的相計#<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>如表26所示，在由CH-296組誘導的CTL群中，與對照組和PBMC組比較，附加有更低濃度抗原肽的靶細胞也可被殺傷，CTL群的特異性抗原識別能力高。即，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材得到的培養(yǎng)細胞可以被誘導為特異性抗原識別能力更高的CTL群。實施例9使用CH-296的T細胞群擴大培養(yǎng)的細胞群的存活性實驗(l)T細胞群的擴大培養(yǎng)在抗人CD3抗體和CH-296片段的固定中使用乙酸緩沖液(pH5.3);在培養(yǎng)開始第4天稀釋為約14倍；將6.3mL稀釋液轉移至25cm2培養(yǎng)瓶中；在培養(yǎng)開始第8天稀釋為約2倍；將6.3mL稀釋液轉移至25112培養(yǎng)瓶中；除此之外按照實施例3-(l)進行。結果如表27所示。[表27]表27<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>如表27所示，與對照組比較，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，使用固定有CH-296片段的培養(yǎng)器材的組(CH-296組)可得到高的擴大培養(yǎng)率。(2)CD45RA+CCR7+T細胞、CD45RA+CD62L+T細胞的分析按照與實施例l-(4)同樣的方法，對實施例9-(l)中制備的細胞用各抗體染色，進行分析?？贵w的組合如下。即，用FITC標記小鼠IgGl/RDl標記小鼠IgGl/PC5標記小鼠IgGl、以及FITC標記小鼠抗人CCR7抗體/RDl標記小鼠抗人CD45R抗體/PC5標記小鼠抗人CD62L抗體進行染色。將它們通過流式細胞儀進行分析，計算CD45RA+CCR7+、CD45RA+CD62L+T細胞的比例。結果如表28、表29所示。[表28]表28<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>[表29]表29<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>由表28、表29的結果可知，與對照組比較，在CH-296組中，可得到CD45RA+CCR7+、CD45RA+CD62L+T細胞群高的結果。(3)使用(l)的細胞的銅養(yǎng)細胞進行的培養(yǎng)使用5HRPMI,將實施例9-(l)所得的擴大培養(yǎng)后的細胞制備成2xi()G個細胞/mL，以0.5mL/孔分別添加到24孔細胞培養(yǎng)板中。另夕卜，將實施例l-(l)中制備的自身PBMC懸浮于5HRPMI中，然后照射X射線(0.90C/kg)，再用5HRPMI制備成2xl06個細胞/mL(作為飼養(yǎng)細胞)。將該細胞以0.5mL/孔分別添加到上述24孔細胞培養(yǎng)板中，在5%C02培養(yǎng)箱內、在37。C下培養(yǎng)7天。此期間，不添加任何IL-2等細胞因子進行培養(yǎng)。(4)膜聯(lián)蛋白V+7AAD+細胞的分析回收實施例9-(3)所得的細胞，為了測定引發(fā)編程性細胞死亡的細胞，按照膜聯(lián)蛋白V/7AAD試劑盒(BeckmanCoulter制備)的說明書進行染色。將該細胞供給流式細胞儀，對各細胞群計算膜聯(lián)蛋白V+7AAD+細胞、即，引發(fā)編程性細胞死亡的細胞的比例。結果如表30所示。[表30]表30<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>由表30的結果顯示，與對照組比較，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，在固定有CH-296的培養(yǎng)器材的組中，膜聯(lián)蛋白V+7AAD+細胞群低，編程性細胞死亡細胞的比例低。即，通過在T細胞群擴大培養(yǎng)中使用CH-296片段，例如在IL-2少的環(huán)境下也可以有效地增殖存活性高的細胞。實施例10使用小鼠同系腫瘤模型研究移入T細胞的效果為了確認使用CH-296擴大培養(yǎng)的T細胞對腫瘤的效果，使用小鼠同系腫瘤模型進行實驗。(1)小鼠CH-296的制備序列表中SEQIDN0.23所示的小鼠CH-296是以人CH-296的序列為基礎設計小鼠纖連蛋白片段，按照常規(guī)方法構建質粒，使用該質粒通過基因工程獲得的。即，對保有該質粒的大腸桿菌HB101進行培養(yǎng)，誘導表達。然后將菌體破碎，制備粗蛋白。然后通過陽離子交換柱、陰離子交換柱、凝膠過濾柱純化目標蛋白，無菌過濾后在-80。C下保存，直到使用。(2)由荷癌小鼠制備脾臟淋巴細胞將IMC癌(以下稱為IMC)移植到雌性CDFi小鼠(NipponSLC,Inc.)的腹腔中，制備腹水，每隔7天分別移植到其它的小鼠中進行傳代。采集傳代第7天的腹水，用PBS清洗，然后懸浮于PBS中，濃度為5xl07個細胞/mL。將0.1mL該細胞懸浮液移植到CDFi小鼠的右側腹部皮下，形成實體腫瘤。21天后摘出脾臟，在RPMI1640培養(yǎng)基中用玻片劃碎。使用RPMI1640培養(yǎng)基，將7只小鼠的脾臟匯集，回收到管中，制成45mL，在冰上靜置5分鐘，然后流過40的細胞濾器(BectonDickenson制備)，轉移至新的管中。離心后除去上清，作為溶血操作，是懸浮于2mLACK緩沖液(0.15MNH4C1、0.01MKHC03、0.01mMNa2EDTA、pH7.4)中，再添加2mLACK緩沖液，懸浮后添加RPMI1640培養(yǎng)基，使細胞懸浮液為50mL。離心后除去上清，懸浮于10mLRPMI1640培養(yǎng)基中，通過細胞過濾器轉移到新的管中。添加RPMI1640培養(yǎng)基，使細胞懸浮液為40mL,然后離心除去上清，懸浮于將RPMI1640培養(yǎng)基和含有8%HSA的CP-1等量混合所得的液體中，在使用之前在液氮中保存。(3)抗小鼠CD3抗體和小鼠CH-296片段的固定將抗小鼠CD3抗體和小鼠CH-296片段固定在以下實驗所使用的培養(yǎng)器材中。即，向24孔細胞培養(yǎng)板中各添加400^L含有抗小鼠CD3抗體(R&DSYSTEMS公司制備)(終濃度14[xg/mL)的乙酸緩沖液(pH5.3),在4。C下培養(yǎng)過夜。然后添加實施例10-(l)中制備的小鼠CH-296,終濃度為25嗎/mL，再在室溫下培養(yǎng)5小時。即將使用前，從培養(yǎng)器材中吸引除去含有抗體.小鼠CH-296的乙酸緩沖液，然后將各孔用PBS清洗2次，用RPMI1640培養(yǎng)基清洗1次，供給實驗。(4)通過尼龍纖維純化脾臟淋巴細胞為了提高淋巴細胞的純度，使用尼龍纖維對實施例10-(2)中制備的淋巴細胞進行純化。向10mL注射器(TERUMO公司制備)中填充0.6g尼龍纖維(和光純藥制備)，用PBS平衡，然后在12rC下滅菌20分鐘。將該柱用含有10%FBS(大日本制藥制備)的RPMI1640培養(yǎng)基平衡，在5%0)2培養(yǎng)箱、在37。C下培養(yǎng)1小時。將實施例10-(2)中制備的脾臟淋巴細胞懸浮于2-3mL含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，不超過2xl()8個細胞，加到柱中，然后在5。/。C02培養(yǎng)箱、在37。C下培養(yǎng)1小時。將15mL預先在37。C下保溫的含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基添加到柱中，回收洗脫的細胞。(5)小鼠T細胞群的擴大培養(yǎng)將實施例10-(4)中制備的淋巴細胞懸浮于含有10%FBS、0.1mMNEAA混合液、lmM丙酮酸鈉、502-巰基乙醇(NakalaiTesque制備)的RPMI1640培養(yǎng)基(以下稱為mRPMI培養(yǎng)基)中，濃度為ljx106個細胞/mL，然后以0.7mL/孔將mRPMI培養(yǎng)基添加到實施例10-(3)中制備的固定有抗小鼠CD3抗體和小鼠CH-296的板中，添加0.5mL/孔上述細胞液，在5%(:02培養(yǎng)箱、在37。C下進行培養(yǎng)(培養(yǎng)第0天)。培養(yǎng)第2天，使用mRPMI培養(yǎng)基進行稀釋細胞，濃度為lxl()S個細胞/mL，全量轉移到未進行任何固定的新的75cn^細胞培養(yǎng)瓶中。此時，添加小鼠IL-2(R&DSYSTEMS公司制備)，終濃度為100U/mL;添加小鼠IL-7(R&DSYSTEMS公司制備)，終濃度為10ng/mL。培養(yǎng)第5天使細胞為1.5xl(^個/mL,除此之外與培養(yǎng)第2天同樣地進行傳代。培養(yǎng)第7天回收細胞，供給以下的同系胂瘤模型的實驗。(6)CDFrIMC同系肺瘤模型中，移入的T細胞群與腫瘤的排斥作用的評價麻醉下，與實施例10-(2)同樣地將IMC移植到6周齡的雌性CDF！小鼠右側腹部皮下，實施例10-(5)中制備的細胞懸浮于PBS中，濃度為3xl()8個細胞/rnL，由尾靜脈施用0.1mL(施用第0天)。施用第0天開始4天內連續(xù)腹腔施用小鼠IL-2(3xl(^U/0.2mL)。作為對照，設定不施用于擴大培養(yǎng)的細胞的組。胂瘤的大小是定期測定其長徑和短徑，直至IMC移植后第21天，以腫瘤面積(cm、表示。結果如圖2所示。圖2示出移植IMC的天數(shù)與胂瘤大小的關系。黑三角表示對照組，黑圓圏表示T細胞施用組。如圖2所示，在施用在CH-296存在下培養(yǎng)的細胞的組(T細胞施用組)中，肺瘤的形成得到顯著抑制。實施例11對使用CH-296擴大培養(yǎng)的人T細胞群誘導NOD/scid小鼠中的GVHD的評價(l)T細胞群的擴大培養(yǎng)為了大量制備細胞，改變培養(yǎng)器材。即，向175cn^培養(yǎng)瓶(BectonDickenson制備)中添加21ml含有抗人CD3抗體(終濃度5pig/mL)的PBS。此時，CH-296添加組中添加CH-296，終濃度為25jxg/mL,在室溫下培養(yǎng)5小時。在即將使用之前，由這些培養(yǎng)器材中吸引除去含有抗體.CH-296的PBS，將各培養(yǎng)瓶用PBS清洗2次，用RPMI培養(yǎng)基清洗1次。新鮮的PBMC由健康人供體中采血54mL制備。將PBMC懸浮于含有0.5%自身血漿和0.2%HSA的GT-T503培養(yǎng)基(以下記述為0.5。/。自身血漿GT-T503)中，濃度為0.5x106個細胞/mL，向制備的固定有抗CD3抗體的培養(yǎng)瓶、或固定有抗CD3抗體和CH-296的培養(yǎng)jf瓦中各添加21mL，添加IL-2至終濃度為1000U/mL。將這些培養(yǎng)瓶在5%C02、在37。C下開始培養(yǎng)(培養(yǎng)第0天)。第2天，向培養(yǎng)瓶中各添加49mL0.5%自身血漿GT-T503，添加IL-2，相對于所加的培養(yǎng)基量，終濃度為1000U/mL。培養(yǎng)開始第4天，將42mL各組培養(yǎng)液和158mL0.5%自身血漿GT-T503轉移至未進行任何固定的透氣性培養(yǎng)袋(600cm2,TAKARABIO制備，商品編號KB610)中。再添加IL-2至終濃度為500U/mL,繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)開始第6天，添加400mL0.5%自身血漿GT-T503和IL-2，終濃度為500U/mL(600mL培養(yǎng))。2天后，從600mL培養(yǎng)物中取出一半培養(yǎng)液，添加等量的0.5%自身血漿GT-T503和IL-2(終濃度為500U/mL)(培養(yǎng)第8天)。培養(yǎng)開始笫11天，添加600mL含有0.2%HSA的GT-T503培養(yǎng)基和終濃度為500U/mL的IL-2，繼續(xù)培養(yǎng)至第14天。培養(yǎng)后的細胞懸浮于有含有8%HSA的CP-1和RPMI1640培養(yǎng)基等量混合液形成的保存液中，使用之前一直保存在液氮中。(2)分組在施用于細胞的前一天，測定NOD/scid小鼠(日本CLEA公司)8周齡、雌性10只的體重，分成4組進行。本實施例的組構成如下。A組溶劑+飼養(yǎng)細胞+人IL-2+抗脫唾液酸(asialo)GM1抗體B組PBL+飼養(yǎng)細胞+人IL-2+抗脫唾液酸GM1抗體C組擴大培養(yǎng)后的細胞(未固定CH-296)+飼養(yǎng)細胞+人IL-2+抗asialoGM1抗體D組擴大培養(yǎng)后的細胞(未固定CH-296)+銅養(yǎng)細胞+人IL-2+抗asialoGM1抗體A組和B組為n=2,C組和D組為n=3。(3)抗asialoGM1抗體的施用已知抗asialoGM1抗體處理是在NOD/scid小鼠中除去NK細胞，提高人細胞的粘附能力。在施用擴大培養(yǎng)的細胞的前一天，將20jiL抗asialoGM1抗體(和光純藥制備)稀釋到含有0.4%HSA的生理鹽水(以下簡稱為含0.4。/oHSA生理鹽水)中，腹腔內施用0.4mL。(4)施用細力包的制備和施用將在實施例ll-(l)中冷凍保存的擴大培養(yǎng)細胞和按照與實施例l-(l)融解。末梢血淋巴細胞(以下稱為PBL)濃度是以PBMC中的CD3陽性細胞率為70%進行計算。溶劑使用含4。/。HSA生理鹽水，以PBL的一部分作為銅養(yǎng)細胞，將0.5xl07個細胞/小鼠懸浮在溶劑中，以及PBL和擴大培養(yǎng)后的細胞以1.Ox108個細胞/小鼠懸浮于溶劑中，形成必要的細胞數(shù)，制成用于施用的細胞。施用于細胞之前，將所有小鼠進行X射線照射(0.090C/kg)，將準備的細胞由A組按順序腹腔內施用0.3mL。(5)人IL-2的施用在T細胞擴大培養(yǎng)時使用的人IL-2用含0.4%HSA生理鹽水制備，濃度為2xlO"U/小鼠，再由完成了實施例11-(4)的細胞的施用的小鼠中腹腔內施用0.2mL。人IL-2是由細J包施用日開始每天一次連續(xù)施用四次。(6)施用細胞后的小鼠體重變化體重測定是由施用日至第21天，以適當?shù)拈g隔進行。結果，在施用PBL的B組中，從第8天開始可見體重減少，第13天有一只死亡。在其它的組中，直至第21天仍沒有死亡，全部存活。觀察體重減少率，A組和C組中中途有變動，但第21天時可以保持開始的體重，而在D組中可見稍孩i降低的傾向。在以體重減少為指標的Xeno-GVHD反應中，可見PBL優(yōu)先反應，顯示在固定了CH-296的條件下的擴大培養(yǎng)細胞比非固定條件更有效。(7)脾臟中人T細胞的成活B組以外的組是在施用于細胞開始第21天進行解剖^r查時摘除脾臟，通過流式細胞儀分析脾臟中人CD3陽性細胞的比例。B組中，在第13天有一只死亡，因此該小鼠在死亡后立即摘除脾臟，其余的一只也在第13天進行解剖檢查，摘除脾臟。摘除的脾臟用玻片磨碎，然后通過尼龍網(wǎng)過濾，進行離心操作。除去上清，用ACK緩沖液溶血，用RPMI1640培養(yǎng)基清洗，制備細胞。染色使用FITC標記小鼠抗人CD3抗體(Dako制備)。結果，在第13天，在進行分析的B組中，脾細胞中的CD3陽性率約70%;在第21天，在進行分析的D組中，顯示約59%。在A組中低于1%，在C組可見數(shù)。/。的陽性率。由此可知，在固定有CH-296條件下的擴大培養(yǎng)細胞與非固定條件相比，在脾臟中的成活率高，保持了21天。實施例12添加IL-2、IL-12、IFN-y、抗IL-4抗體的淋巴細胞的擴大培養(yǎng)(1)抗人CD3抗體和CH-296片段的固定與實施例l-(2)同樣進行。在抗人CD3抗體和CH-296片段的固定中使用ACD-液(pH5.0),將ACD-A液對12孔細胞培養(yǎng)板的添加量變更為0.45mL。(2)使用GT-T503培養(yǎng)基進行的T細胞群的擴大培養(yǎng)將實施例l-(l)中制備的PBMC懸浮于0.5%GT-T503中，濃度為0.25xl()6個細胞/mL,然后以0.5mL/孔將0.5%GT-T503添加到實施例12-(1)中制備的固定有抗人CD3抗體的板、或固定有抗人CD3抗體和CH-296的板中，各以lmL/孔添加細胞液，將這些板在5%C02、在37。C下培養(yǎng)(培養(yǎng)第0天)。培養(yǎng)開始第4天，使用0.5%GT-T503將各組的培養(yǎng)液稀釋為約14倍，將6.3mL稀釋液轉移至未進行任何固定的25cm2細胞培養(yǎng)瓶中。繼續(xù)培養(yǎng)，第7天，使用0.5%GT-T503，將各5且》玄^]^收仰7千-7^-VZ1窗,ITmL，^r收^f"，夕玉；^:5ZLT^iml^J疋自"詳斤的25cn^細胞培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)開始后第ll天，使用含有0.2。/。HSA的GT-T503培養(yǎng)基，將各組的細胞培養(yǎng)液稀釋為約2倍，分別將12.6mL稀釋液轉移到未進行任何固定的新的25cm2細胞培養(yǎng)瓶中。IL-2是在培養(yǎng)第O天添加，終濃度為100U/mL。對于IL-2以外的添加物，是在培養(yǎng)第4天添加50U/mLIL-12(R&DSYSTEMS公司制備)、20ng/mLIFN-y(R&DSYSTEMS公司制備)、2pg/mL抗人IL-4抗體(BectonDickenson制備)，在培養(yǎng)第7天和第11天，對于新添加的培養(yǎng)基添加各細胞因子、抗體，達到上述終濃度。培養(yǎng)開始后第14天，通過臺盼藍染色法計測存活細胞數(shù)，與培養(yǎng)開始時的細胞數(shù)比較，計算擴大培養(yǎng)率。結果如表31所示。[表31]表31<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>如表31所示，在T細胞擴大培養(yǎng)初期，使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材的組中，與對照組相比，T細胞群的擴大培養(yǎng)率高。(3)CD45RA+CCR7+T、CD45RA+CD62L+T細胞的分析按照與實施例l-(4)同樣的方法，對實施例12-(2)中制備的細胞用各抗體進行染色，進行分析?？贵w的組合如下進行。即，負對照是用FITC標記小鼠IgGl/RDl標記小鼠IgGl/PC5標記小鼠IgGl+ECD標記小鼠IgGl、RDl標記小鼠抗人CD45RA抗體/FITC標記小鼠抗人CCR7抗體/ECD標記小鼠抗人CD4抗體/PC5標記小鼠抗人CD8抗體、或者RD1標記小鼠抗人CD45RA抗體/FITC標記小鼠抗人CD62L抗體/ECD標記小鼠抗人CD4抗體/PC5標記小鼠抗人CD8抗體進行染色。將該細胞供給流式細胞儀，計算T細胞區(qū)域全體、CD8+T細胞區(qū)域和CD4+T細胞區(qū)域中的CD45RA+CCR7+T細胞、CD45RA+CD62L+T細胞的比例。結果如表32所示。[表32]表32<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>如表32所示，在使用固定有CH-296片段的培養(yǎng)容器的組中，與對照組比較，可得到培養(yǎng)中的T細胞中CD45RA+CCR7+T細胞群和CD45RA+CD62L+T細胞群高的結果。以上表明，在向GT-T503培養(yǎng)基中添加IL-2、IL-12、IFN-y、抗人IL-4抗體的培養(yǎng)中，在擴大培養(yǎng)初期，與CH-296片段共存，由此可以使T細胞的CD45RA+CCR7+或CD45RA+CD62L+T細胞群比例升高，同時可以擴大培養(yǎng)T細胞群。實施例13在CH-296初期刺激后，使用透氣性培養(yǎng)袋由新分離的PBMC擴大培養(yǎng)的細胞群的同種異型MLR(1)由新鮮血液分離PBMC由知情同意的健康人供體實施50mL采血，然后按照與實施例1-(1)同樣的方法，從采集的血液中分離PBMC。將采集的PBMC通過臺盼藍和Turk染色法(Turk染色液，大力，4f只制備)計算細胞數(shù)，不經冷凍保存而直接用于各實驗。(2)抗人CD3抗體和CH-2%片段的固定按照與實施例6-(l)同樣的方法進行。(3)T細胞群的擴大培養(yǎng)將按照實施例13-(1)中制備的PBMC懸浮于0.5%自身血漿GT-T503中，濃度為0.5xl()6個細胞/mL,制備細胞液，然后以21mL/培養(yǎng)瓶將0.5%GT-T503添加到實施例13-(2)中制備的固定有抗人CD3抗體的培養(yǎng)瓶、或固定有抗人CD3抗體和CH-296的培養(yǎng)瓶中，分別以9mL/培養(yǎng)瓶添加上述細胞液。添加IL-2，終濃度為1000U/mL,將這些培養(yǎng)瓶在5。/。C02、在37。C下培養(yǎng)(培養(yǎng)第0天)。培養(yǎng)開始第4天，將21mL各組的培養(yǎng)液和279mLO.5%自身血漿GT-T503轉移到未進行任何固定的透氣性培養(yǎng)袋(300cm2、TAKARABIO制備，商品編號KB610)中。再添加IL-2，終濃度為500U/mL。繼續(xù)培養(yǎng)，第8天除去150mL各組的培養(yǎng)液，將150mL留在袋中，用0.5%自身血漿GT-T503稀釋為2倍，使袋內的細胞稀釋液為300mL。再添加IL-2，終濃度均為500U/mL。培養(yǎng)開始后第11天，添加300mL含有0.2%HSA的GT-T503培養(yǎng)基，將各組細胞培養(yǎng)液稀釋為2倍。再在各組中添加IL-2，終濃度為500U/mL。培養(yǎng)開始后第14天，通過臺盼藍染色法計測存活細胞數(shù)，與培養(yǎng)開始時的細胞數(shù)比較，計算擴大培養(yǎng)率。將該結果表示在表33中。[表33]表33<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>如表33所示，在使用透氣性培養(yǎng)袋進行培養(yǎng)時，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，在使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材的組(以下稱為CH-296組)中，與對照組比較，T細胞群的擴大培養(yǎng)率高。(4)用透氣性培養(yǎng)袋培養(yǎng)的T細胞群中CD45RA+CCR7+、CD45RA+CD62L+、CD45RA+CD27+、CD45RA+CD28+、CD27+CD28+、CD45RA+CCR7+CD62L+T細胞的分析將實施例13-(3)中制備的細胞按照與實施例6-(3)同樣的方法用各抗體染色，進行分析。結果如表34所示。[表34]表34<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>如表34所示，CH-296組與對照組比較，細胞表面標志均顯示高的值。(5)培養(yǎng)細胞的保存通過實施例13-(3)中制備的培養(yǎng)第14天的細胞按照與實施例5-(4)同樣的方法冷凍保存、融解，供給各實驗。(6)同種異型MLR使用實施例13-(5)中制備的細胞，按照與實施例6-(4)同樣的方法進行同種異型MLR。下述內容進行變更。制備成刺激細胞和反應細胞的細胞濃度為1或2xl()e個細胞/mL;培養(yǎng)第5天后將各孔內的細胞懸浮，然后分成兩孔，每孔半量，向各孔中添加1mL含有1000U/mLIL-2的5HRPMI,繼續(xù)培養(yǎng)至第7天。(7)擴大培養(yǎng)率的測定對于實施例13-(6)中得到的細胞，在培養(yǎng)開始后第7天通過臺盼藍染色法計測存活細胞數(shù)，與培養(yǎng)開始時的細胞數(shù)比較，計算擴大培養(yǎng)率。結果如表35所示。表35<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>如表35所示，使用CH-296組進行同種異型MLR時，與對照組相比，反應后的擴大培養(yǎng)率高。即，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材，用所得的培養(yǎng)細胞進行同種異型MLR,則可見有更多的異抗原識別細胞增殖。(8)細胞毒活性的測定實施例13-(6)中制備的誘導開始后第7天的細胞的細胞毒活性按照與實施例6-(6)同樣的方法進行。此時的耙細胞是用PHA進行7天母細胞化的自身PBMC或非自身PBMC作為鈣熒光素標記靶細胞。細胞毒活性測定時，將30倍量的K562細胞與鈣熒光素標記靶細胞混合。將E/T的比設定為90-3。細胞毒活性測定結果如表36所示。[表36]表3662<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>如表36所示，由CH-296組進行同種異型MLR時，與對照組比較,反應后的異抗原特異性細胞毒活性高。即，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，在使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材的培養(yǎng)細胞中，通過同種異型MLR可得到異抗原特異性細胞毒活性更強的細胞群。實施例"CH-296初期刺激時及之后的培養(yǎng)時使用透氣性培養(yǎng)袋擴大培養(yǎng)的細胞群的同種異型MLR以及抗MART-1CTL的誘導(1)抗人CD3抗體和CH-296片段的固定將抗人CD3抗體和CH-296固定在以下實驗中使用的培養(yǎng)器材上。即，向透氣性培養(yǎng)袋(培養(yǎng)面積75cm2、TAKARABIO制備，商品編號KB620)中分別添加9mL含有抗人CD3抗體(終濃度為5jxg/mL)的PBS。此時，CH-296添加組等量添加含有抗人CD3抗體(終濃度5嗎/mL)和CH-296(終濃度25jig/mL)的PBS。將這些培養(yǎng)器材在室溫下溫育5小時，在使用之前一直保存在室溫下。即將使用之前，用注射器從這些培養(yǎng)器材中除去含有抗體.CH-296的PBS,將各袋用PBS清洗2次，用RPMI培養(yǎng)基清洗1次，供給各實驗。(2)T細胞群的擴大培養(yǎng)CH-296刺激時的培養(yǎng)器材不是培養(yǎng)瓶，而是使用實施例14-(1)中制備的袋，除此之外，按照與實施例13-(3)同樣的方法進行。培養(yǎng)開始后第14天的結果如表37所示。[表37]表37放大率(倍率)對照(未固定CH-296)x500CH-296x967如表37所示，通過CH-296進行初期刺激時以及之后的培養(yǎng)時使用透氣性培養(yǎng)袋進行培養(yǎng)，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材的組(以下稱為CH-296組)中，與對照組比較，細胞群的擴大培養(yǎng)率高。(3)CH-296初期刺激時以及之后的培養(yǎng)時，通過透氣性培養(yǎng)袋培養(yǎng)的T細胞群中CD45RA+CCR7+、CD45RA+CD62L+、CD45RA+CD27+、CD45RA+CD28+、CD27+CD28+、CD45RA+CCR7+CD62L+T細胞的分析將實施例14-(2)中制備的細胞按照與實施例6-(3)同樣的方法用各抗體染色，進行分析。結果如表38所示。[表38]表38<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>如表38所示，CH-296組與對照組相比，其細胞表面標志均顯示高的值。(4)同種異型MLR使用實施例14-(2)中制備的細胞，按照與實施例6-(4)同樣的方法進行同種異型MLR。(5)細胞毒活性的測定實施例14-(4)中制備的誘導開始后第10天的細胞的細胞毒活性是新設定成E/T的比為90，除此之外按照與實施例6-(6)同樣的方法進行。細胞毒活性測定結果如表39所示。表39<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>如表39所示，由CH-296組進行同種異型MLR時，與對照組比較，反應后的異抗原特異性細胞毒活性高。即，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，在使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材的培養(yǎng)細胞中，通過同種異型MLR可得到異抗原特異性細胞毒活性更強的細胞群。(6)培養(yǎng)細胞的保存實施例14-(2)中制備的培養(yǎng)第14天的細胞按照與實施例5-(4)同樣的方法進行冷凍保存、融解，供給各實驗。(7)抗腫瘤相關抗原(MART-1)特異性CTL的誘導使用實施例l-(l)和14-(6)中制備的細胞，按照與實施例5-(5)同樣的方法進行抗腫瘤相關抗原(MART-1)特異性CTL的誘導，繼續(xù)培養(yǎng)14天。對以下內容進行變更。將反應細胞懸浮于5HRPMI中，濃度為lx106個細胞/mL,向24孔細胞培養(yǎng)板中各添加0.5mL/孔；培養(yǎng)開始第3天除去一半培養(yǎng)上清，然后向各孔中添加1mL含有60U/mLIL-2的5HRPMI;—周后將培養(yǎng)細胞調節(jié)為1.5-3.0xl()S個細胞/mL,將抗原呈遞細胞調節(jié)為1.0xl(^個細胞/mL，各添加0.5mL/孔；培養(yǎng)開始第10天，除去一半培養(yǎng)上清，然后向各孔中添加1mL含有60U/mLIL-2的5HRPMI。(8)細胞毒活性的測定實施例14-(7)中制備的誘導開始后第14天的CTL的細胞毒活性測定按照與實施例6-(9)同樣的方法進行。細胞毒活性測定結果如表40所示。[表40]表40<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>如表40所示，由CH-296組誘導的CTL群中，與對照組和PBMC組比較，CTL群的特異性細胞毒活性高。即，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材得到的培養(yǎng)細胞可被誘導為特異性細胞毒活性更高的CTL群。實施例15CH-296初期刺激時以及之后的培養(yǎng)時，由來自用透氣性培養(yǎng)袋培養(yǎng)的細胞的CD45RA+CCR7+CD8+T細胞和CD45RA-CCRTCD8+T細胞誘導抗MART-1CTL(1)CD45R+CCR7+CD8+T細胞和CD45RA-CCRTCD8+T細胞的分離將實施例l-(l)和實施例14-(6)中制備的細胞按照與實施例7-(l)同樣的方法分別分離成CD45RA+CCR7+CD8+組分和CD45RA-CCRTCD8+組分，得到純度為93-99%的組分。(2)抗腫瘤相關抗原(MART-1)特異性CTL的誘導使用實施例15-(1)中制備的細胞，按照與實施例14-(7)同樣的方法進行抗腫瘤相關抗原(MART-1)特異性CTL的誘導，繼續(xù)培養(yǎng)14天。對以下內容進行變更。將反應細胞懸浮于5HRPMI中，濃度為lx106個細胞/mL,向48孔細胞培養(yǎng)板中各添加0.25mL/孔；培養(yǎng)開始第1天，向各孔中添加0.5mL含有60U/mLIL-2的5HRPMI;培養(yǎng)開始第3天，除去一半培養(yǎng)上清，然后向各孔中添加0.5mL含有60U/mLIL-2的5HRPMI;—周后將培養(yǎng)細胞調節(jié)為0.2-1.7xl(^個細胞/mL,將抗原呈遞細胞調節(jié)為1.0xl(^個細胞/mL，向24孔細胞培養(yǎng)板中各添加0.5mL/孔；培養(yǎng)開始第10天，除去一半培養(yǎng)上清，然后向各孔中添加1mL含有60U/mLIL-2的5HRPMI。(3)擴大培養(yǎng)率的測定(3)擴大培養(yǎng)率的測定對于實施例15-(2)所得的細胞，在培養(yǎng)開始后第14天，通過臺盼藍染色法計測存活細胞數(shù)，與培養(yǎng)開始時的細胞數(shù)比較，計算擴大培養(yǎng)率。結果如表41所示。[表41]表41培養(yǎng)開始細胞擴大培養(yǎng)率對照(未固定CH-296)CH-296CD45RA+CCRTCD8+T細胞x5.38CD45RA-CCRTCD8+T細胞x3.14x4.96如表41所示，與對照組比較，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，由使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材得到的培養(yǎng)細胞(CH-296組)分離出CD45RA+CCR7+CD8+T細胞，在使用該CD45RA+CCR7+CD8+T細胞誘導的CTL群中CTL群的擴大培養(yǎng)率高。即，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，在使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材得到的培養(yǎng)細胞中高比例含有CD45RA+CCR7+T細胞，由該CD45RA+CCR7+T細胞進行CTL誘導，由此可獲得更多的CTL群。(4)細胞毒活性的測定實施例15-(2)中制備的誘導開始后第14天的CTL的細胞毒活性是設定E/T的比為30-3,除此之外按照與實施例6-(9)同樣的方法進行。細胞毒活性測定結果如表42所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>如表42所示，與對照組和PBMC組比較，使用由CH-296組分離的CD45RA+CCR7+CD8+T細胞誘導的CTL群中CTL群的特異性細胞毒活性高，并且，與使用CD45RA—CCR7-CD8+T細胞誘導的CTL群比較，其特異性細胞毒活性也高。即，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，在使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材得到的培養(yǎng)細胞中，高比例含有的CD45RA+CCR7+T細胞可誘導特異性細胞毒活性更高的CTL群。實施例16CTL的抗原識別能力的測定(1)抗腫瘤相關抗原(MART-1)特異性CTL的誘導使用實施例l-(l)和實施例14-(6)中制備的細胞，按照與實施例14-(7)同樣的方法進行抗腫瘤相關抗原(MART-l)特異性CTL的誘導，繼續(xù)培養(yǎng)15天。(2)抗原識別能力的測定實施例16-(1)中制備的誘導開始后第15天的CTL的抗原識別能力按照與實施例8-(2)同樣的方法測定?？乖R別能力測定結果如表43所示。以附加在耙細胞上的肽濃度為lOj^M時的細胞毒活性為100,抗原識別能力表示為各附加肽濃度下的細胞毒活性的相對值。[表43]表43附加在把細胞上'附加狀為IOuM時的細胞毒活性的相對值的肽終濃度PBMC對照CH—296(MM)(未固定CH-296)如表43所示，在由CH-296組誘導的CTL群中，與對照組和PBMC組比較，附加有低濃度抗原肽的靶細胞也被殺傷，CTL群的特異性抗原識別能力高。即，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，使用固定有CH-296的培養(yǎng)器材得到的培養(yǎng)細胞可以誘導特異性抗原識別能力更高的CTL群。實施例17CH-296初期刺激時以及之后的培養(yǎng)時，來自使用透氣性培養(yǎng)袋擴大培養(yǎng)的細胞的CD45RA+CCR7+T細胞的細胞因子生成性評價(1)CD45RA+CCR7+T細胞和CD45RA—CCR丁T細胞的分離按照與實施例3-(3)同樣的方法，對實施例14-(6)中制備的細胞進行染色和分選。(2)抗人CD3抗體和抗人CD28抗體的固定和細胞的刺激為了刺激分離的細胞，與實施例3-(4)的方法同樣地，在培養(yǎng)板上固定抗人CD3抗體和抗人CD28抗體。將實施例17-(l)中得到的各細胞群懸浮于0.5%GT-T503中，向制備的板的各孔中添加細胞，濃度為2xl()5個細胞/0.2mL,在5%C02、在37。C下培養(yǎng)。24小時后回收培養(yǎng)上清，供給通過ELISA法進行的細胞因子測定實驗。(3)通過ELISA法測定IL-2的生成臨床上的淋巴細胞擴大培養(yǎng)中使用可在封閉系統(tǒng)中培養(yǎng)的透氣性培養(yǎng)袋。在實施例14中使用培養(yǎng)袋擴大培養(yǎng)時，CH-296組與對照組相比，可得到CD45RA+CCR7+T細胞群比例高的結果。為了確認該CD45RA+CCR7+T細胞群是否保持了幼稚T細胞樣細胞的性質，與實施例3-(6)同樣地評價CD45RA+CCR7+T細胞和CD45RAX:CR7T細胞的IL-2生成性。結果如表44所示。[表44]表44固定CH-296IL-2(pg/mL)CD8+T細胞CD45RA+CCR7+T細胞347.2CD45RA-CCR7T細胞<0CD8T細胞CD45RA+CCR7+T細胞1686.7CD45RA—CCR7T細胞215.6如表44所示，CD8+T細胞和CD8T細胞在CD45RA+CCR7+T細胞中均優(yōu)先生成IL-2。如實施例3-(6)所示，在實施例中，使用CH-296進行培養(yǎng)袋培養(yǎng)的冷凍細胞的CD45RA+CCR7+T細胞群保持幼稚T細胞樣細胞的性質。實施例18使用H-296、CH-271、H-271、C-CS1片萃殳擴大培養(yǎng)的T細胞群中CD45RA+CCR7+T細胞的分析(1)抗人CD3抗體和H-296、CH-271、H-271、C-CS1片段的固定按照與實施例4-(l)同樣的方法進行。不使用CH-296片段，添加H-296、CH-271、H-271、C-CS1的各片段，終濃度為25ng/mL，以此代替片段添加組。(2)T細胞群的擴大培養(yǎng)培養(yǎng)開始第4天，稀釋為約14倍，將10mL稀釋液轉移到25cm2細胞培養(yǎng)瓶(Corning制備)中，第7天不進行傳代操作，除此之外按照實施例3-(l)進行，繼續(xù)培養(yǎng)9天。培養(yǎng)開始第8天的擴大培養(yǎng)率結果如表45所示。[表45]表45放大率(倍率)<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>如表45所示，在T細胞群擴大培養(yǎng)初期，使用固定有H-296、CH-271、H-271、C-CS1的培養(yǎng)器材的組(以下稱為片段組)中，與對照組比較，T細胞群的擴大培養(yǎng)率高。(3)CD45RA+CCR7+T細胞的分析按照與實施例3-(2)同樣的方法，對實施例18-(2)中制備的細胞計算培養(yǎng)開始第9天的CD45RA+CCR7+T細胞的比例。結果如表46所示。[表46]表46<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>如表46所示，片段組與對照組比較，得到了培養(yǎng)中的T細胞群中CD45RA+CCR7+T細胞群高的結果。產業(yè)實用性本發(fā)明提供T細胞群的制備方法。該方法中，作為高比例含有表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28中任一項的T細胞的T細胞群，例如適合用于免疫療法。因此，本發(fā)明的方法有望對醫(yī)療領域作出很大貢獻。附圖簡述圖1是表示纖連蛋白的結構域的結構的模式圖。圖2是表示用過施用T細胞抑制小鼠肺瘤形成的作用的圖序列表文本SEQIDNO.l:SEQIDN0.2:SEQIDNO.3:SEQIDN0.4:SEQIDN0.5:SEQIDN0.6:SEQIDN0.7:SEQIDN0.8:SEQIDN0.9:SEQIDNO.10SEQIDNO.11SEQIDNO.12SEQIDNO.13SEQIDNO.14SEQIDNO.15SEQIDNO.16SEQIDNO.17SEQIDNO.18SEQIDN0.19SEQIDNO.20SEQIDNO.21SEQIDN0.22SEQIDN0.23命名為ni-8的纖連蛋白部分區(qū)域命名為in-9的纖連蛋白部分區(qū)域命名為m-io的纖連蛋白部分區(qū)域命名為m-ii的纖連蛋白部分區(qū)域命名為in-12的纖連蛋白部分區(qū)域命名為ni-13的纖連蛋白部分區(qū)域命名為in-14的纖連蛋白部分區(qū)域命名為cs-i的纖連蛋白部分區(qū)域命名為C-274的纖連蛋白片段命名為H-271的纖連蛋白片段命名為H-296的纖連蛋白片段命名為CH-271的纖連蛋白片段命名為CH-296的纖連蛋白片段命名為C-CS1的纖連蛋白片段命名為CH-296Na的纖連蛋白片段命名為CHV-89的纖連蛋白片段命名為CHV-90的纖連蛋白片段命名為CHV-92的纖連蛋白片段命名為CHV-179的纖連蛋白片段命名為CHV-181的纖連蛋白片段命名為H-275-Cys的纖連蛋白片段來自黑素瘤抗原MART-1的表位肽命名為CH-296的小鼠纖連蛋白片段,權利要求1.表達CD45RA，且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種T細胞群的制備方法，其特征在于該方法包含在纖連蛋白、其片段或它們的混合物的存在下，將含有T細胞的細胞群進行培養(yǎng)的步驟。2.權利要求l的制備方法，其中，包含培養(yǎng)步驟的總培養(yǎng)天數(shù)為4-14天。3.權利要求1或2的制備方法，其中，在纖連蛋白、其片段或它們的混合物存在下進行的培養(yǎng)至少在培養(yǎng)開始時實施。4.權利要求3的制備方法，其特征在于在纖連蛋白、其片段或它們的混合物存在下進行的培養(yǎng)至少實施1天或以上。5.權利要求1-4中任一項的制備方法，其中，在纖連蛋白、其片段或它們的混合物存在下進行培養(yǎng)的步驟在CD3配體的存在下實施。6.權利要求5的制備方法，其中，CD3配體是抗CD3抗體。7.權利要求1-6中任一項的制備方法，其中，纖連蛋白片段是包含至少一個序列表中序列號1~8中所示氨基酸序列的多肽(m)，或者是包含至少一個在上述任一氨基酸序列中1或多個氨基酸發(fā)生置換、缺失、插入或者附加所得的氨基酸序列、并與上述多肽(m)具有同等功能的多肽(n)。8.權利要求7的制備方法，其中，纖連蛋白的片段是含有序列表中SEQIDN0.1-3和5-8所示任意的氨基酸序列的多肽。9.權利要求1-8中任一項的制備方法，該方法進一步包含將表達CD45RA、CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的細胞群進行分離的步驟。10.權利要求1-9中任一項的制備方法，該方法進一步包含向細胞群中導入外源基因的步驟。11.權利要求10的制備方法，其中，使用反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、慢病毒載體或猿猴病毒載體導入外源基因。12.T細胞群，該T細胞群由權利要求1-11中任一項的方法獲得、表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種。13.藥物，該藥物含有T細胞群作為有效成分的，其中所述T細胞群由權利要求1-11中任一項的方法獲得、表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種。14.疾病的治療方法或預防方法，該方法包含將有效量的T細胞群施用于受試體的步驟，其中所述T細胞群由權利要求1-11中任一項的方法獲得、表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種。15.T細胞群在藥物制備中的應用，其中，T細胞群由權利要求1-11中任一項的方法獲得、表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種。16.T細胞群的制備方法，其特征在于該制備方法包含以下步驟通過選自具有呈遞抗原的能力的細胞、呈遞了抗原的細胞、抗原、CD3配體、CD28配體、細胞因子、趨化因子和具有生成細胞因子的能力的細胞的至少一種刺激因子對T細胞群施加刺激的步驟，其中T細胞群由權利要求1-11中任一項的方法獲得、表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種。17.T細胞群，該T細胞群由權利要求16的方法獲得。18.藥物，該藥物含有由權利要求16的方法獲得T細胞群作為有效成分。19.疾病的治療方法或預防方法，該方法包含對受試體施用有效量的由權利要求16的方法獲得的T細胞群的步驟。20.由權利要求16的方法獲得的T細胞群在藥物制備中的應用。21.藥物，該藥物包含以下述兩種制劑(a)含有T細胞群作為有效成分的制劑，其中，所述T細胞群由權利要求1-11中任一項的方法獲得、表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種；以及(b)含有選自刺激因子作為有效成分的制劑，其中，所述刺激因子選自具有呈遞抗原的能力的細胞、呈遞了抗原的細胞、抗原、CD3配體、CD28配體、細胞因子、趨化因子和具有生成細胞因子的能力的細胞的至少一種；上述制劑作為包含于所述藥物中的不同制劑可同時或分別施用。22.疾病的治療方法，其特征在于包含下述(a)和(b)的步驟(a)將T細胞群施用于患者的步驟，其中，所述T細胞群由權利要求1-11中任一項的的方法獲得、表達CD45RA、且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種；(b)將選自具有呈遞抗原的能力的細胞、呈遞了抗原的細胞、抗原、CD3配體、CD28配體、細胞因子、趨化因子和具有生成細胞因子的能力的細胞的至少一種刺激因子施用于患者的步驟。全文摘要本發(fā)明涉及包含在纖連蛋白、其片段或它們的混合物的存在下，將含有T細胞的細胞群進行培養(yǎng)的步驟；上述T細胞群表達CD45RA，且表達選自CD62L、CCR7、CD27和CD28的至少一種的T細胞群的制備方法。文檔編號C12N5/0783GK101400785SQ20068004411公開日2009年4月1日申請日期2006年9月27日優(yōu)先權日2005年9月30日發(fā)明者佐川裕章,円居隆宏,出野美津子,加藤彰子,加藤郁之進,村木信子,榎龍嗣申請人:寶生物工程株式會社