專利名稱：：假單胞菌hn-72以及用其純化2,6-萘二甲酸的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種新穎的微生物，該微生物能夠將包含在粗萘二曱酸(cNDA)中的2-甲酰基-6-萘甲酸(FNA)(其為2,6-二曱基萘P,6-DMN)的氧化產物)雜質轉化為^6-萘二曱酸(NDA),以及用此微生物高純度純化2，6-萘二曱酸的方法。
背景技術：
：萘二甲酸的二酯可用于制備各種聚合材料，如聚酯和聚酰胺。特別有用的二酯是2,6-萘二甲酸二甲酯(NDC)。NDC能與乙二醇縮合形成高性能聚酯材料聚2,6-萘二曱酸乙二酯(PEN)。由PEN制成的纖維和薄膜與由聚對苯二曱酸乙二醇酯(PET)制成的那些相比顯示出高強度和優(yōu)越的熱性能?；谶@些優(yōu)勢，PEN非常適用于商業(yè)制品(如能夠用于制造磁性錄音帶和電子元件的薄膜)的生產。另外，由于PEN的高抗氣體(特別是二氧化碳、氧氣和水蒸氣)擴散性，由PEN制成的薄膜能用于制造食品容器，特別是耐熱食品容器。PEN還能用于生產可用于輪胎簾布的制造的增強纖維。NDC通常通過氧化2，6-DMN以得到粗萘二曱酸(cNDA)和使cNDA酯化來生產。目前，NDC用作合成PEN的主要原料。然而，當NDC用作合成PEN的原料時，相比于應用2,6-萘二曱酸(NDA)時，存在一些問題。首先，在NDA的縮合期間，形成副產物水，而在NDC的情況下形成副產物甲醇，因而有爆炸的風險。其次，由于純NDC通過NDA的酯化和酯化產物的純化生成，相比于應用NDA，包括一個額外的工序。第三，考慮到現(xiàn)有的PET生產詔:備的應用，NDC的應用是不適合的。盡管有這些與NDC的應用相關的問題，NDC還是優(yōu)選用于生產PEN,因為生產具有合成PEN所需純度的純4匕的NDA仍舊困難。氧化2,6-二甲基萘(2,6-DMN)形成含有各種雜質(如2-甲?；鵢6-萘甲酸(FNA)、2-萘曱酸和偏苯三酸)的cNDA。特別地，在cNDA中FNA的存在會使用于產生PEN的聚合終止，從而不利地影響最終聚合物(即PEN)的物理性質。因而去除存在于cNDA中的FNA是必要的，但是去除FNA存在困難。在這些情況下，已經進行了許多有關用于去除存在于cNDA中的FNA或純化NDA的方法的研究。例如，通過以下步驟產生NDA:l)重結晶cNDA，2)多次氧化cNDA,或2)用曱醇處理cNDA以產生NDC并水解NDC。另夕卜，通過cNDA的氬化產生純化的NDA。另一方面，如溶劑處理、熔融/結晶、高壓結晶和超臨界萃取等許多方法已被用于純化NDA,但是這些都不能成功地生產具有令人滿意純度的NDA。這些方法可用于增加NDA的純度，但L卻導致了NDA的低產率，這使得該方法難于在工業(yè)上實施。
發(fā)明內容本發(fā)明考慮到現(xiàn)有技術的問題而產生，并且本發(fā)明的一個目的是提供一種用于通過用微生物的生物處理選擇性地將FNA(其為含在cNDA中的雜質)轉化為NDA的生產高純度NDA的新穎的方法。依據本發(fā)明的一方面，提供了假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-W(保藏編號KCTC1081犯P),其具有將2-甲?；?6-萘甲酸轉化成2，6-萘二甲酸的能力。依據本發(fā)明的另一方面，提供一種用假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72(保藏編號KCTC10819BP)高純度純化2，6-萘二甲酸的方法。本發(fā)明的假單胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72在將2-甲?；?6-萘甲酸轉化成2,6-萘二甲酸方面具有極好的效果。因此，本發(fā)明的假單胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72有助于以經濟的和環(huán)境友好的方式生產高純度的2，6-萘二甲酸，從而在用于工業(yè)應用中是非常重要的。通過以下的詳細說明連同隨附的附圖將更清晰地理解本發(fā)明的上述以及其他目的、特征和其他優(yōu)勢，其中圖l表示本發(fā)明的假單胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72的16SrDNA的部分序列。具體實施例方式以下將提供依據本發(fā)明的新穎菌抹的更詳細的解釋。本發(fā)明人已成功地從土壤中分離出具有將FNA轉化成NDA的能力的新穎的菌抹。通過16srDNA的部分測序確定本發(fā)明的新穎的菌抹屬于假單胞菌屬的細菌，并且稱其為假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72。假單胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72在2005年6月16日保藏于作為國際保藏單位的KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology(KRIBB)的基因庫中，保藏編號為KCTC-10819BP。本發(fā)明的假單胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72是一種微生物，其氧化具有與2-甲酰基-6-萘曱酸在相同位置上有曱?；?-萘曱醛而將2-萘曱醛的曱酰基轉化成羧基。因此，本發(fā)明的菌抹能高度選擇性地將包含在粗萘二曱酸中的2-曱酰基-6-萘曱酸(其為2,6-二曱基萘的氧化產物)轉化為2,6-萘二甲酸。當與芽孢桿菌(Bacillussp.)菌抹F-3(其記載于已提交的專利申請(韓國專利申請No.10_2002-0087819)中)相比時，本發(fā)明的假單胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72有相當大的改善的轉化能力。本發(fā)明的假單胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN"72(保藏編號KCTC-10819BP)能容易地在液體培養(yǎng)基中在25~37°C的寬的溫度范圍內培養(yǎng)。隨后將對用本發(fā)明的假單胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72純化2，6-萘二曱酸的方法作更詳細地說明。特別地，本發(fā)明的方法包括步驟1)將假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72(保藏編號KCTC10819BP)接種在液體培養(yǎng)基上，振搖培養(yǎng)接種體，收集培養(yǎng)的細菌，并用生理鹽水洗滌收集的細菌以使細菌活化，2)將作為基質的粗萘二曱酸與緩沖液混合，調節(jié)混合液的pH以制備用于隨后純化的反應液，和3)將在步驟l)中制備的活性細菌(假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72)與在步驟2)中制備的反應液反應以將含在粗萘二曱酸中的2-曱?；?6-萘曱酸轉化成2,6-萘二曱酸，從而提高2,6-萘二曱酸的純度。對于在步驟1)中用于培養(yǎng)假單胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72的液體培養(yǎng)基，可以無限制地使用LB或M9培養(yǎng)基。假單胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72的振搖培養(yǎng)優(yōu)選在25~37°C的溫度范圍內，更優(yōu)選在3(TC下進行。振搖培養(yǎng)后收集的細菌(假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-")優(yōu)選儲存在4°C的冷藏器中或凍干從而盡可能長地保持細菌的活性。在步驟2)中使用的緩沖液的類型不特別限制。作為緩沖液，可用水、磷酸鉀(KH2P04)-KOH緩沖液、焦磷酸鈉-HCl緩沖液、硼酸-NaOH緩沖液、硼酸鈉-HCl緩沖液等。優(yōu)選j吏用磷酸鉀-KOH緩沖液或硼酸-NaOH緩沖液。與cNDA的反應降低了反應液的pH。特別地，當與cNDA在反應液中反應完畢后，反應液的pH在7.0~8.0的范圍內。因此，pH為6.0-8.0的磷酸鉀(KH2P04)-KOH緩沖液優(yōu)選用作緩沖液。此時，優(yōu)選緩沖液的濃度為0.01~100mM。另一方面，在隨后的cNDA的純化反應(步驟3)中的反應液的pH是非常重要的反應因素。在步驟2)中，混合液的pH優(yōu)選調節(jié)至7.5~8.3。當反應液的起始pH低于7.5或高于8.3時，在步驟3)中沒有反應進行。在步驟2)中，為了溶解cNDA,可以另外將有機溶劑添加至混合液中。優(yōu)選的有機溶劑的實例包括二曱基亞砜(DMSO)、N,N-二曱基曱酰胺(DMF)、N,N-二曱基乙酰胺(DMA)和四氫呋喃(THF)。在這些物質中，考慮到酶的活性，二曱基亞砜是最優(yōu)選的。有機溶劑優(yōu)選以0.01~10%的濃度添加。更優(yōu)選地，不添加有機溶劑。以超過10%的濃度添加有機溶劑導致微生物的細胞膜被溶解破壞，乂人而阻礙反應。在步驟3)中，反應優(yōu)選在30~50°C下進行。當反應溫度超出此溫度范圍時，會導致不期望的細菌活性的顯著降低。在下文中，將參考下述實施例對本發(fā)明的構成和效果進行具體地解釋。然而，這些實施例的目的是舉例說明，不解釋為對本發(fā)明的范圍的限制。實施例實施例1:菌抹的分離土壤采樣自韓國京畿道的廢水處理廠、儲油庫和加油站。將每個土壤樣品5g添加到50ml的0.85%生理鹽水溶液中，振搖并過濾得到濾液。濾液稀釋到適當?shù)乃?，涂在含有cNDA的LB固體培養(yǎng)基上，在30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)結果，分離出200種微生物。依據如下工序，首先僅篩選出能分解與FNA在相同位置上有甲?；?-萘曱醛的微生物。首先，將200種微生物各自接種到lml的LB液體培養(yǎng)基上，在30℃下以200rpm振搖培養(yǎng)16小時。離心分離培養(yǎng)物收集相應的細菌。將收集到的細菌懸浮在lml的0.85%生理鹽水溶液中。單獨地，將0.2ml的2-萘甲醛溶液(50mg/ml于DMSO溶液中)加入到含有3ml的(3-NAD溶液(0.25mg/ml于100mMKH2P04-KOH(pH8,0)溶液中)的樣品試管中，并將0.2ml的DMSO添加到含有3ml的β-NAD溶液(0.25mg/ml于100mMKH2P04-KOH(pH8.0)溶液中)的空白試管中。將試管分別置于分光光度計中，穩(wěn)定3分鐘。當分別添加0.05ml微生物懸浮液于樣品試管中后5分鐘，在340nm處測定混合物的吸收度。比較樣品試管中的混合物的吸收度值與空白試管的吸收度值以確定2-萘曱醛的曱?；紧然难趸?。結果，分離出四種具有最小吸收度差異為0.1的微生物。將四種首先篩選出的微生物各自接種在LB液體培養(yǎng)基上，在30℃以200rpm振搖培養(yǎng)16小時。離心分離培養(yǎng)物收集相應的細菌，用0.85%生理鹽水溶液洗滌，并與具有表1中所示組成的溶液在30。HPLC的反應浴中反應3小時。反應產物用高效液相色譜(HPLC)分析以最終篩選具有高的去除FNA能力的菌抹。HPLC分析在表2所示的條件下進行。HPLC分析顯示稱為HN-72的菌林具有高的分解FNA能力。表1:用于最終篩選的反應液<table><row><column>組成</column><column>體積(ml)</column><column>注釋</column></row><row><column>50mMKH2P04-KOH(pH8.0)</column><column>37.5</column><column>-</column></row><row><column>cNDA溶液</column><column>4</column><column>*NDA溶液的濃度50mg/ml</column></row><row><column>DMSO</column><column>2.5</column><column>*反應液的最終濃度5%</column></row><row><column>微生物懸浮液</column><column>5</column><column>*微生物懸浮液的濃度0.5g(w.w)/ml</column></row><row><column>總計</column><column>50</column><column>-</column></row><table>表2:HPLC分析的條件<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例2(l)微生物的鑒別對實施例1中分離的菌抹的16SrDNA進行部分測序來鑒別菌抹。結果顯示于圖1。依據此結果，鑒定菌林屬于假單胞菌屬的細菌。菌株被稱為假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72并于2005年6月16日寸呆藏在作為國際寸呆藏單4立的KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology(KRIBB)基因庫中，保藏編號為KCTC-10819BP。確定菌抹(假單胞菌HN-72)的形態(tài)學和生物化學特征，其結果概述于表3和4中。表3:假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72的特征實驗特征革蘭氏染色陰性細胞形態(tài)學桿狀最佳生長溫度25~30℃氧化酶陽性脫硝作用陰性明膠降解陰性淀粉降解陰性兒茶紛降解陰性表4:假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72對碳源的應用<table><row><column>碳水化合物</column><column>利用能力</column><column>碳水化合物</column><column>利用能力</column></row><row><column>葡萄糖</column><column>+</column><column>乳糖酶</column><column>+</column></row><row><column>果糖</column><column>+</column><column>檸檬酸酯</column><column>+</column></row><row><column>半乳糖</column><column>-</column><column>甘油</column><column>+</column></row><row><column>阿拉伯糖</column><column>-</column><column>鄰苯二曱酸酯</column><column>-</column></row><row><column>鼠李糖</column><column>+</column><column>異丙醇</column><column>-</column></row><row><column>海藻糖</column><column>-</column><column>丁醇</column><column>+</column></row><row><column>麥芽糖</column><column>-</column><column>山梨醇</column><column>-</column></row><row><column>乳糖</column><column>-</column><column>甘露醇</column><column>-</column></row><row><column>蔗糖</column><column>-</column><column>核糖</column><column>-</column></row><row><column>淀粉</column><column>-</column><column>琥珀酸酯</column><column>+</column></row><table>(2)假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72與已知菌林的比較將假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72的反應效率與在已有專利申請(韓國專利申請No.10-2002-0087819)中記載的具有相同的去除FNA能力的芽孢桿菌(Bacillussp.)菌抹F-3的反應效率進行比較。當添加芽孢桿菌(Bacillussp.)菌抹F-3和假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72至具有表1中所示組成的反應液中時，在相同條件下各自的實驗組進行反應。在圖2中所示的條件下進行HPLC分析。將兩個菌抹分別添加至含有濃度為1%和5%的cNDA的反應液中，在30'C下反應。分析所述反應液，結果見表5。由表5的結果，可以確認當與芽孢桿菌(Bacillussp.)菌抹F-3相比時，假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72也能與cNDA在較高的濃度下反應，并能夠高度轉化FNA為NDA，即顯示出高的NDA產率和純度。表5:由假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72和芽孢桿菌(Bacillussp.)F-3引起的cNDA反應液中NDA含量的變化<table>complextableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例3:反應溫度的影響具有表6中所示組成的cNDA反應液在30、35、45和50°C下反應以確定cNDA反應液的最佳反應溫度。此時，酶溶液通過如下方式制備在LB液體培養(yǎng)基上接種假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72,在30。C下振搖培養(yǎng)接種體16小時，并離心培養(yǎng)物以收集培養(yǎng)的細菌，用0.85%的生理鹽水溶液洗滌收集的細菌，并且在0.85%的生理鹽水溶液中懸浮洗滌后的細菌。調節(jié)反應液中細菌的最終濃度至0.05g/ml。由表7的結果明顯看出，較高的反應溫度對反應是有利的，40°C或更高的溫度不會導致反應的任何實質的改變。表6<table><row><column>組成</column><column>含量</column><column>注釋</column></row><row><column>50mMKH2P04-KOH(pH8.0)</column><column>42.5ml</column><column></column></row><row><column>cNDA溶液</column><column>2.5g</column><column>*反應液的最終濃度5%</column></row><row><column>DMSO</column><column>2.5ml</column><column>*反應液的最終濃度5%</column></row><row><column>微生物懸浮液</column><column>5ml</column><column>*微生物懸浮液的濃度0.5g(w.w)/ml</column></row><row><column>總計</column><column>50ml</column><column></column></row><table>表7:在不同反應溫度下的cNDA反應液中NDA含量/FNA含量的變化<table><row><column></column><column>30°C</column><column>35°C</column><column>40°C</column><column>50°C</column></row><row><column>0</column><column>90.82%/5.66%</column><column>90.35%/6.08%</column><column>89.51%/6.05%</column><column>89.73%/5.95%</column></row><row><column>30分鐘</column><column>93.16%/3.16%</column><column>94.72%/1.55%</column><column>95.09%/0.44%</column><column>95.01%/0.45%</column></row><row><column>1小時</column><column>94.63%/1.06%</column><column>95.39%/0.19%</column><column>95.55%/0.06%</column><column>95.49%/0.05%</column></row><table>實施例4:二甲基亞砜(DMSO)的影響由于作為基質的cNDA不溶于水溶液，將二曱基亞砜(DMSO)作為溶劑進行反應。為了評價DMSO對反應的影響，通過改變如表8所示的DMSO的濃度比較具有表6中所示組成的cNDA反應液中含量比(NDA含量/FNA含量)的改變。即，含有50mM磷酸鉀(KH2P04)-KOH緩沖液(pH8.0)和濃度為0%、5%和10%的DMSO的5%的cNDA反應液在40°C下反應。結果示于表8。由表8所示的數(shù)據可見，不含DMSO的cNDA反應液顯示最好的結果。表8:隨著DMSO濃度的改變cNDA反應液中NDA含量/FNA含量的變化<table></column></row><row><column>0%</column><column>5%</column><column>10%</column></row><row><column>0</column><column>91.09%/2.54%</column><column>90.39%/2.86%</column><column>90.51%/2.75%</column></row><row><column>30分鐘</column><column>92.68%/0.31%</column><column>92.16%/1.19%</column><column>91.09%/2.44%</column></row><row><column>1小時</column><column>93.23%/0%</column><column>92.76%/0.46%</column><column>91.55%/1.36%</column></row><table>實施例5:緩沖液的影響在此實驗中，依據緩沖液的類型，評估每個具有類似的pH范圍的不同的緩沖液的效果。此時，用緩沖液維持微生物細菌的體內穩(wěn)態(tài)。此實驗通過改變具有表6中所示組成的反應液中的緩沖液來進行。在本實驗中使用磷酸鉀(KH2P04)-KOH緩沖液、焦磷酸鈉-HC1緩沖液,硼酸-NaOH緩沖液和硼酸鈉-HCl緩沖液.將緩沖液的濃度和pH分別調節(jié)到50mM和8.0.實驗結果見表9。結果顯示當使用磷酸鉀(KH2P04)-KOH緩沖液和硼酸-NaOH緩沖液時得到較好結果。與cNDA的反應降低了反應液的pH。特別地，在與反應液中cNDA反應完畢后反應液的pH值為7.0~8.0。因此判斷pH為6.0-8.0的石辟酸鉀(KH2P04)-KOH緩沖液的應用最適合。另外，通過從0到100mM改變磷酸鉀-KOH緩沖液的濃度來評估磷酸鉀(KH2P04)-KOH緩沖液對反應液的組成的影響。結果見表10。結果顯示，盡管緩沖液的濃度發(fā)生變化，但沒有觀察到反應液組成的差別。表9:依據緩沖液的類型在cNDA反應液中NDA含量/FNA含量的變化<table></column><column>磷酸鉀(KH2P04)-KOH緩沖液</column><column>硼酸-NaOH</column><column>焦磷酸鈉-HCl</column><column>硼酸鈉-HCl</column></row><row><column>0</column><column>91.09%/2.54%</column><column>90.79%/2.69%</column><column>90.81%/2.75%</column><column>90.99%/2.65%</column></row><row><column>15分鐘</column><column>92.68%/0.31%</column><column>92.56%/0.39%</column><column>92.29%/0.67%</column><column>92.49%/0.44%</column></row><row><column>30分鐘</column><column>93.23%/0%</column><column>93.16%/0.02%</column><column>93.04%/0.36%</column><column>93.05%/0.16%</column></row><table>表10:改變磷酸鉀-KOH緩沖液的濃度時cNDA反應液中NDA含量/FNA含量的變化<table></column><column>0mM(D.W)</column><column>20mM</column><column>50mM</column><column>100mM</column></row><row><column>0</column><column>91.12%/2.47%</column><column>91.15%/2.62%</column><column>91.09%/2.54%</column><column>90.91%/2.65%</column></row><row><column>15分鐘</column><column>92.65%/0.30%</column><column>92.65%/0.37%</column><column>92.68%/0.31%</column><column>92.59%/0.34%</column></row><row><column>30分鐘</column><column>93.20%/0%</column><column>93.26%/0%</column><column>93.23%/0%</column><column>93.25%/0%</column></row><table>實施例6:反應液的起始pH由于隨著pH的增加，cNDA的溶解度增加，反應液的pH在cNDA純化反應中是重要的反應因素。在此實驗中，具有表1所示組成的反應液的起始pH在7.0~9,0的范圍內變化。結果，沒有反應在不高于7.5和不低于8.3的pH下進行，這表示反應液的最佳pH范圍為7.5~8.3。而且，發(fā)現(xiàn)用于cNDA純化反應的最佳pH范圍為7.8~8.1。在此pH范圍內，反應后沒有觀察到cNDA反應液的組成的差別。實施例7:cNDA中FNA的含量、cNDA的濃度和細菌的量的影響在此實驗中，進4亍具有1%~10%的不同F(xiàn)NA含量的cNDA的純化反應。實驗結果顯示，在cNDA中FNA的含量、反應液中cNDA的濃度和完成去除FNA所需的細菌的量之間有密切的關系。即，當cNDA中FNA的含量和反應液中cNDA的濃度增加時，需要大量的細菌(假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72)來處理FNA。表11和12顯示在不同cNDA中FNA的含量和不同cNDA的濃度下需要的細菌(假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72)的量。表11:cNDA中恒定FNA含量(4%)下改變cNDA濃度所需的細菌的量<table><row><column>cNDA濃度(％)</column><column>5</column><column>6</column><column>7</column><column>10</column></row><row><column>細菌的量(g/L)</column><column>40</column><column>50</column><column>50</column><column>87.5</column></row><table>表12:cNDA中恒定FNA含量(1%)下改變cNDA濃度所需的細菌的量<table><row><column>cNDA濃度(％)</column><column>5</column><column>6</column><column>7</column><column>8</column><column>9</column><column>10</column></row><row><column>細菌的量(g/L)</column><column>10</column><column>10</column><column>20</column><column>37.5</column><column>50</column><column>75</column></row><table>實施例8:收集的細菌(假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72)的儲存通常，在培養(yǎng)后，微生物的活性隨著時間流逝而降低。因此，盡可能長地保持細菌的活性對本發(fā)明的純化方法是有利的。為了長時間保持培養(yǎng)的細菌(假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72)的活性，將實施例1所述條件下培養(yǎng)的細菌離心、收集、并儲存在4'C的冷藏器中或凍干。結果，細菌的活性甚至在4'C的冷藏器中儲存4天后還能保持。當凍干時，細菌可儲存更長時間。工業(yè)應用由上述說明可明顯看出，使用本發(fā)明-暇單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72的純化方法是經濟的和環(huán)境友好的，能夠產生高純度的2,6-萘二甲酸。因此，本發(fā)明的假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72對用于工業(yè)應用非常重要。權利要求1.假單胞菌HN-72(保藏編號KCTC10819BP)，其能將2-甲?；?6-萘甲酸轉化為2，6-萘二甲酸。2.—種用假單胞菌HN-72(保藏編號KCTC10819BP)純化2,6-萘二曱酸的方法。3.依據權利要求2的方法，其中所述方法包括步驟1)將假單胞菌HN-72(保藏編號KCTC10819BP)接種在液體培養(yǎng)基上，振搖培養(yǎng)接種體，收集培養(yǎng)的細菌，并用生理鹽水洗滌收集的細菌以使細菌活化；2)將作為基質的粗萘二曱酸與緩沖液混合，調節(jié)混合液的pH以制備用于隨后純化的反應液；和3)將在步驟l)中制備的活性細菌(假單胞菌HN-7"與在步驟2)中制備的反應液反應以將含在粗萘二曱酸中的2-曱?；?6-萘曱酸轉化成2,6-萘二甲酸，從而提高2，6-萘二甲酸的純度。4.依據權利要求3的方法，其中所述液體培養(yǎng)基是LB或M9培養(yǎng)基。5.依據權利要求3的方法，其中振搖培養(yǎng)在25~37°C下進行。6.依據權利要求3的方法，其中將在振搖培養(yǎng)后收集的細菌(假單胞菌HN-72)儲存在4。C的冷藏器中或凍干。7.依據權利要求3的方法，其中所述緩沖液從由水、磷酸鉀(KH2P04)-KOH緩沖液、焦磷酸鈉-HCl緩沖液、硼酸-NaOH緩沖液和硼酸鈉-HCl緩沖液組成的組中選出。8.依據權利要求3的方法，其中所述緩沖液是磷酸鉀-KOH緩沖液或硼酸-NaOH緩沖液。9.依據權利要求3的方法，其中所述緩沖液的濃度為0.01~100mM。10.依據權利要求3的方法，其中將所述混合液的pH調節(jié)到7.5-8.0。11.依據權利要求3的方法，其中所述混合液還含有有機溶劑。12.依據權利要求ll的方法，其中所述有機溶劑從由二曱基亞砜、N,N-二曱基曱酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、四氫呋喃(THF)、及其混合物組成的組中選出。13.依據權利要求11的方法，其中以0.01~10%的濃度添加所述有機溶劑。14.依據權利要求3的方法，其中在步驟3)中，所述反應在30~50°C下進行。全文摘要本發(fā)明涉及假單胞菌HN-72以及用其純化2，6-萘二甲酸的方法。本發(fā)明提供了一種新穎的微生物和用所述微生物高純度純化2，6-萘二甲酸的方法。所述微生物是從土壤中分離的假單胞菌菌株HN-72，其能夠將包含在粗萘二甲酸中的2，6-二甲基萘的氧化產物2-甲?；?6-萘甲酸雜質轉化為2，6-萘二甲酸。假單胞菌菌株HN-72在以高產率生產高純度2，6-萘二甲酸方面具有極好效果。文檔編號C12P7/44GK101346461SQ200680043965公開日2009年1月14日申請日期2006年1月16日優(yōu)先權日2005年11月24日發(fā)明者崔龍福,李鐘桓,金東誠,金成均,金蘇穎申請人:株式會社曉星