專利名稱：細(xì)胞培養(yǎng)方法以及進行該方法的設(shè)備的制作方法
細(xì)胞培養(yǎng)方法以及進行該方法的設(shè)備 本發(fā)明涉及通過包括以下部件的設(shè)備培養(yǎng)細(xì)胞
-具有頂蓋頂蓋的培養(yǎng)容器，其中設(shè)置有至少一個第一區(qū)和至少一個第二 區(qū)，所述第一區(qū)是基本不含任何細(xì)胞的培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移區(qū)，而所述第二區(qū)是細(xì)胞 培養(yǎng)區(qū)，所述第一區(qū)位于第二區(qū)內(nèi)部，
-使培養(yǎng)基循環(huán)通過培養(yǎng)區(qū)的循環(huán)培養(yǎng)基的裝置，所述培養(yǎng)區(qū)包括底壁和 頂壁，各壁具有能夠轉(zhuǎn)移基本不含細(xì)胞的培養(yǎng)基的開口。
這種培養(yǎng)設(shè)備是已知的，例如可從專利US 5 501 971中得知，該專利描述 了一種培養(yǎng)容器，其中在內(nèi)部培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移管道之外設(shè)置有培養(yǎng)區(qū)。細(xì)胞被置于 外部培養(yǎng)區(qū)內(nèi)，其類型為含有載體的籃子，培養(yǎng)基通過該培養(yǎng)區(qū)從頂部向底部 流動。然后從培養(yǎng)區(qū)底部回收培養(yǎng)基，培養(yǎng)基在培養(yǎng)基循環(huán)設(shè)備的作用下通過 上述管道進入培養(yǎng)容器頂部，然后再通過培養(yǎng)區(qū)。專利US 5 507 971描述了一 些替代方案，但培養(yǎng)基總是從頂部到底部通過培養(yǎng)區(qū)。
這種設(shè)備的一個缺點是，它不適用于所有類型的細(xì)胞培養(yǎng)。實際上，這種 設(shè)備僅設(shè)計用于在固定床或緊密填充床的微載體上培養(yǎng)細(xì)胞，絕對不適合懸浮 液或流化床中的微載體上培養(yǎng)細(xì)胞。實際上，在專利US 5 501 971的設(shè)備中， 不含載體或微載體的懸浮液中的細(xì)胞或非固定載體上的細(xì)胞有在重力作用下 沉降并聚集在培養(yǎng)區(qū)底部的趨勢，并且，由于培養(yǎng)基從上到下流經(jīng)該培養(yǎng)區(qū)， 更加重了這種細(xì)胞聚集在培養(yǎng)區(qū)底部。因此，細(xì)胞層層堆疊并相互接觸，從而 使細(xì)胞無法充分獲取該區(qū)域中的物。
在專利US 5 501 971的反應(yīng)器中，當(dāng)在非固定載體或微載體上培養(yǎng)非常脆 弱而幾乎經(jīng)不起任何應(yīng)力的細(xì)胞時，細(xì)胞會經(jīng)受重力、培養(yǎng)基向下流動以及載 體重量的作用，這會極大損害培養(yǎng)物的存活率。此外，對于專利US 5 501 971 的生物反應(yīng)器而言，釆用懸浮培養(yǎng)是難以想像的，因為懸浮的細(xì)胞決不能經(jīng)歷 細(xì)胞和細(xì)胞接觸。實際上，如果存在這種接觸，細(xì)胞之間便會形成蛋白質(zhì)鍵并 聚集。這種聚集導(dǎo)致細(xì)胞由于缺乏氧氣和養(yǎng)料而死亡。本發(fā)明的目的是減輕現(xiàn)有技術(shù)的缺點，方法是獲得一種培養(yǎng)設(shè)備，該設(shè)備 同時培養(yǎng)懸浮液中的細(xì)胞和載體或微載體上的依賴于貼壁的細(xì)胞，并能確保對 細(xì)胞的應(yīng)力最小同時防止細(xì)胞聚集在培養(yǎng)區(qū)底部。
為解決該問題，本發(fā)明提供了如本文開始時提到的設(shè)備，其特征在于，該 設(shè)備還包括至少一個第三區(qū)和至少一個第四區(qū)，這兩個區(qū)都是基本不含細(xì)胞的 培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)，所述第三區(qū)是所述第二區(qū)之內(nèi)和所述第一區(qū)之外的區(qū)域，而所 述第四區(qū)是是所述第二區(qū)之外的區(qū)域，所述第三區(qū)與第一和第二區(qū)培養(yǎng)基連 通，而所述第四區(qū)經(jīng)培養(yǎng)基循環(huán)裝置與第二區(qū)(培養(yǎng)區(qū))和第一區(qū)(培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)) 培養(yǎng)基連通，且培養(yǎng)基循環(huán)裝置能夠使培養(yǎng)基在所述第二培養(yǎng)區(qū)內(nèi)從底部循環(huán) 到頂部。
所述第四區(qū)更具體包括一定體積的由生物反應(yīng)器環(huán)境大氣構(gòu)成的氣體，并 且還構(gòu)成該培養(yǎng)基的氧合區(qū)。
因此，從底部到頂部通過第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)的培養(yǎng)基到達第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移 區(qū)頂部并溢入與第一區(qū)培養(yǎng)基連通的第三區(qū)，培養(yǎng)基在循環(huán)裝置、重力以及連 通容器效應(yīng)的作用下向下流動，通過第二培養(yǎng)區(qū)底壁上的培養(yǎng)基通道開口，然 后又在連通容器效應(yīng)或培養(yǎng)基循環(huán)裝置或者這兩者的作用下向上流向培養(yǎng)區(qū) 頂部，之后又溢入經(jīng)循環(huán)裝置與第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)連通的第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)。 培養(yǎng)基循環(huán)裝置之后又立即使培養(yǎng)基到達第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)頂部并重新開始 循環(huán)。因此，得益于培養(yǎng)基的流動部分抵消了重力作用，培養(yǎng)區(qū)內(nèi)的細(xì)胞便可 隨培養(yǎng)基從底部流向頂部。流動使單獨的細(xì)胞或微載體上的細(xì)胞在培養(yǎng)區(qū)內(nèi)更 好地分散并降低了對它們的有害應(yīng)力。
當(dāng)使用術(shù)語"載體或微載體上的細(xì)胞"時，必需理解，所述載體可以在固 定或填充床內(nèi)、或在流化床內(nèi)。
同樣，當(dāng)使用術(shù)語"細(xì)胞培養(yǎng)物"或"細(xì)胞"時，必需理解，尤其是當(dāng)提 及動物細(xì)胞時，它可以指病毒產(chǎn)物、蛋白質(zhì)或其他重組產(chǎn)品、細(xì)胞代謝物、組 織細(xì)胞培養(yǎng)物(可能在三維載體上)、干細(xì)胞或者細(xì)菌或酵母。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，載體或微載體上的細(xì)胞受填充的影響小于無 載體或無微載體的懸浮液中的細(xì)胞，在固定床中尤其如此，盡管如此，技術(shù)人 員仍舊容易發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)區(qū)內(nèi)這樣的流動方向?qū)τ谂囵B(yǎng)物氧合和營養(yǎng)物分布的優(yōu)勢。實際上，己經(jīng)眾所周知細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟是培養(yǎng)容器的設(shè)計。培養(yǎng)容器 的設(shè)計必需滿足無新鮮培養(yǎng)基無法到達或者細(xì)胞會發(fā)生聚集的死角；細(xì)胞直接 與培養(yǎng)基接觸而非相互接觸對于它們的繁殖和/或生產(chǎn)代謝也是非常有利的。
因此，本發(fā)明提供了一種適合懸浮培養(yǎng)物和載體或微載體上的培養(yǎng)物的靈 活設(shè)備，該設(shè)備通過降低重力對細(xì)胞的影響并防止出現(xiàn)新鮮培養(yǎng)基無法到達或 者細(xì)胞會發(fā)生聚集的死角，能夠降低對細(xì)胞施加的應(yīng)力并能夠防止細(xì)胞在培養(yǎng) 區(qū)的特定區(qū)域內(nèi)聚集。此外，對于懸浮培養(yǎng)應(yīng)用，本發(fā)明的設(shè)備能夠使細(xì)胞良 好分散，這一方面是利用朝上的液流，另一方面是利用仍舊施加在細(xì)胞上的部 分重力。
術(shù)語"具有供基本不含細(xì)胞的培養(yǎng)基通過的開口的底壁"必需理解為是設(shè) 置在培養(yǎng)區(qū)底部的壁，它可以設(shè)置在培養(yǎng)區(qū)底部或界定所述培養(yǎng)區(qū)的垂直壁的 較低部位，且能允許培養(yǎng)基通過但不允許微載體或載體上甚至懸浮液中的細(xì)胞 通過。類似地，"具有供基本不含細(xì)胞的培養(yǎng)基通過的開口的頂壁"可以是具 有上述相同特征的設(shè)置在培養(yǎng)基頂部或界定培養(yǎng)區(qū)的垂直壁頂部的壁。
從第一區(qū)溢入第三區(qū)的培養(yǎng)基可自然從第一區(qū)的壁頂部溢出，并通過這種 方式到達第三區(qū)或者可經(jīng)安置在第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)頂部或底部的開口或管道 溢出。培養(yǎng)基以相同方式從第二區(qū)溢入第四區(qū)。
有利地，培養(yǎng)基循環(huán)裝置由設(shè)置在所述培養(yǎng)設(shè)備底部的離心泵構(gòu)成，包括 至少一個能夠圍繞基本位于中心的旋轉(zhuǎn)軸(真實的或虛擬的)旋轉(zhuǎn)的磁力設(shè)備、 至少一個培養(yǎng)基入口和至少一個培養(yǎng)基出口 ，所述循環(huán)裝置被設(shè)計成將培養(yǎng)基 吸入由磁力設(shè)備旋轉(zhuǎn)形成的虹吸管并將培養(yǎng)基推向置于所述磁力設(shè)備外部區(qū) 域內(nèi)的培養(yǎng)基出口，所述離心泵由旋轉(zhuǎn)磁力馬達驅(qū)動，所述馬達使培養(yǎng)基產(chǎn)生 循環(huán)，而不與設(shè)備外部連通，以及至少一個設(shè)計成能引導(dǎo)培養(yǎng)基通過所述出口 朝容器頂部推進的導(dǎo)向裝置。
現(xiàn)有常規(guī)生物反應(yīng)器的一個缺點是，它們利用葉片或螺旋攪拌系統(tǒng)使培養(yǎng)
容器內(nèi)的培養(yǎng)基均質(zhì)化，無法提供足夠的循環(huán)。在這種情況下，生物反應(yīng)器包 括具有兩片易碎機械墊片(例如由昂貴的碳化硅制成)并穿過生物反應(yīng)器頂蓋頂
蓋的主軸。通過生物反應(yīng)器的頂蓋會造成嚴(yán)重的污染風(fēng)險和明顯的坍塌風(fēng)險。 其他類型的生物反應(yīng)器包括培養(yǎng)基的外部循環(huán)。培養(yǎng)基經(jīng)蠕動泵或類似系統(tǒng)通過管道。顯然，這種方法盡管能部分防止直接污染但具有其他缺點。它無 法適用于長期培養(yǎng)。實際上，這種類型的泵中使用的管道在長期培養(yǎng)期間容易 磨損，它還涉及密封和污染的問題。
上述培養(yǎng)基循環(huán)還導(dǎo)致了出現(xiàn)"噴泉"效應(yīng)的技術(shù)難題。因此不足以使液 流以非常低的壓降穿過培養(yǎng)區(qū)，還需要同時維持培養(yǎng)容器內(nèi)的水平差異。實際 上，將液體帶向第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)頂部是一個關(guān)鍵步驟，但確保培養(yǎng)基不過度 聚集在第四區(qū)底部也是一個關(guān)鍵步驟。如果培養(yǎng)基聚集在第四培養(yǎng)區(qū)底部，溢 出效應(yīng)將被降低，且培養(yǎng)基從第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)到第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)以及然后 到第二培養(yǎng)區(qū)和最終進入第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)的循環(huán)將不是最佳的。
因此，本發(fā)明的循環(huán)裝置將包括圍繞基本位于中心的旋轉(zhuǎn)軸旋轉(zhuǎn)的磁力設(shè) 備以及培養(yǎng)基入口和出口。
在小規(guī)模培養(yǎng)時，例如，磁力設(shè)備將是簡單的磁力棒，它由外部磁鐵驅(qū)動，
能提供0.6-6升/分鐘(即l-10毫升/秒)的流速。由于培養(yǎng)基循環(huán)系統(tǒng)不與外部連 通而是由培養(yǎng)容器外部的設(shè)備驅(qū)動，因此便不存在污染風(fēng)險。根據(jù)本發(fā)明也可 考慮蠕動泵，但優(yōu)選用于短期培養(yǎng)。
在大規(guī)模培養(yǎng)時，磁力設(shè)備將是磁化馬達，其流速在例如10和200升/分 鐘之間，尤其為20-150升/分鐘，優(yōu)選為25-100升/分鐘。
在一具體的實施方式中，本發(fā)明所述的設(shè)備包括一系列模塊，各模塊包括 所述第一區(qū)、所述第二區(qū)、所述第三區(qū)和所述第四區(qū)，且其中，所述一系列模 塊中的相鄰模塊由培養(yǎng)基連通，各模塊的所述第一區(qū)和所述第四區(qū)直接或間接 與所述循環(huán)裝置連通。
該實施方式能夠獲得特別靈活的設(shè)備并能夠?qū)⒁?guī)模放大至100升體積。
通常，放大是生產(chǎn)重組產(chǎn)品、病毒、細(xì)胞代謝物或其他產(chǎn)品或細(xì)胞培養(yǎng)物 中的一個復(fù)雜步驟，因為采用以常規(guī)方式提供的區(qū)域時，無論是否提供氧氣或 營養(yǎng)物，這種放大通常都會產(chǎn)生問題。在上述實施方式中，培養(yǎng)設(shè)備包括一系 列例如疊放或并置的相鄰模塊。培養(yǎng)基穿過其他培養(yǎng)模塊從第一培養(yǎng)模塊的第 四區(qū)到達培養(yǎng)基循環(huán)裝置。本發(fā)明考慮了各種類型的預(yù)定體積的模塊。例如， 500毫升或5升的模塊，其體積從500毫升到5升，包括該范圍內(nèi)或涵蓋該范 圍的所有體積。因此，對于3升的培養(yǎng)物將使用6個500毫升的模塊。例如，可將6個模塊疊放在足夠大的容器中或者可使各模塊相連通以形成所述容器。
在文獻US 5 501 971的反應(yīng)器中，如果需要培養(yǎng)體積為3升，則需要培養(yǎng) 區(qū)的高度為H。在該專利中，到達培養(yǎng)區(qū)底部的培養(yǎng)基被幾乎耗盡，尤其就氧 而言。此外，專利US 5 501 971的作者考慮在培養(yǎng)區(qū)頂部和底部放置氧傳感器 并給反應(yīng)器環(huán)境過度供氧。不幸的是，由于這會使培養(yǎng)區(qū)頂部細(xì)胞的細(xì)胞成分 氧化并隨后造成細(xì)胞死亡，因此絕對不推薦這種類型的過度氧合。此外，當(dāng)專 利5 501 971的作者考慮放大時，由于無法再調(diào)節(jié)高度就必需考慮寬度。顯然， 占地面積很快便無法控制。精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，占地面積是一個關(guān) 鍵參數(shù)，尤其對于絕塵室而言，絕塵室的效率是根據(jù)要處理以獲得無菌空氣的 空氣體積來計算的，這種類型的空氣處理非常昂貴。要處理的空氣體積是將"絕 塵室"的高度乘以生物反應(yīng)器、其裝備以及培養(yǎng)設(shè)備操作人員的占地面積得到 的。
因此，根據(jù)要獲得的產(chǎn)率，通過使用疊放或并置的模塊可減小占地面積。 此外，其中的培養(yǎng)基在再次接觸生物反應(yīng)器周圍空氣之前必須過濾的培養(yǎng)體積 被相當(dāng)程度地降低。在我們之前的例子中，將該體積除以6。
根據(jù)一個有利的實施方式，因此還需要提供一種具有預(yù)定高度的可高壓滅 菌的空培養(yǎng)容器(用玻璃或不銹鋼制成)或空的一次性培養(yǎng)容器，在該容器底部 包括培養(yǎng)基循環(huán)裝置。然后則足以在該容器的培養(yǎng)基循環(huán)結(jié)構(gòu)上放置數(shù)量為N 的模塊并再用配套的頂蓋密封容器。此時，無論培養(yǎng)物為5升或50升，容器 體積都是相同的。
由于特別經(jīng)濟，該實施方式對于設(shè)施不多的實驗室特別有利。實際上，如 果將提供的容器設(shè)計成要培養(yǎng)35升，則僅需要5升或10升的培養(yǎng)模塊，例如 在上述培養(yǎng)基循環(huán)裝置上放置--個或兩個5升的培養(yǎng)模塊就足夠了。由于對于 5-35升之間的任何培養(yǎng)昂貴的部分總是相同的，因此大大降低了開銷。
此外，無論是培養(yǎng)5升或35升或更大體積，占地面積將是相同的，放大 時不涉及處理更大體積的空氣。此外，模塊內(nèi)各次傳遞之間的培養(yǎng)基實際上是 與反應(yīng)器內(nèi)的環(huán)境空氣接觸，因此放大時遇到的問題被大大降低了。
如前所述，培養(yǎng)基循環(huán)裝置由于對于本發(fā)明所述的設(shè)備具有特殊的價值因 此特別有效。因此，各模塊內(nèi)的流速是相同的，在輸出水平上也是相同的，按照本發(fā)明提高規(guī)模也不會造成問題。
在一個特別有利的實施方式中，循環(huán)裝置被限定在底部模塊中，所述底部 模塊與至少一個第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)和至少一個第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)直接或間接 培養(yǎng)基連通。
由于存在一些無法清潔到的區(qū)域，培養(yǎng)基循環(huán)裝置通常是存在交叉污染或 外部污染風(fēng)險的區(qū)域，因此，例如將底部模塊插入簡單的玻璃容器將特別有利， 但不限于此。這樣的底部模塊與培養(yǎng)模塊是適配的，能夠使所有存在模塊的第 一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)與培養(yǎng)基循環(huán)裝置的培養(yǎng)基出口之間的培養(yǎng)基連通，并能夠使 所有存在的培養(yǎng)模塊的所有第四區(qū)與培養(yǎng)基循環(huán)裝置的培養(yǎng)基入口之間直接 或間接培養(yǎng)基連通，即可通過或不通過其他模塊。
該設(shè)備優(yōu)選還包括頂部模塊，所述頂部模塊至少包括頂蓋?？蓪⑦@種頂部 模塊設(shè)計成能隔絕上述的疊加。
在一個有利的實施方式中，至少一個第四區(qū)包括至少一個基本垂直或傾斜 的流動壁。
這種流動壁的存在減少了從第二培養(yǎng)區(qū)溢入第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)期間可能 出現(xiàn)的泡沫。實際上，在沒有這種流動壁時，從第二區(qū)到第四區(qū)的培養(yǎng)基流動 是湍流，這樣必然會形成不希望的泡沫。需要指出的是，由于培養(yǎng)基富含蛋白 質(zhì)，因此在許多培養(yǎng)方法中泡沫形成都是一個主要問題。攪拌富含蛋白質(zhì)的液 體通常都會出現(xiàn)泡沫。因此湍流會有同樣的后果，這就是為什么本發(fā)明包括能 降低流動紊流的所述流動壁是有利的。
此外，這種第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)也是培養(yǎng)基與本發(fā)明所述設(shè)備的環(huán)境大氣相 接觸的區(qū)域。存在流動壁能促進這種接觸，從而通過增加氣-液接觸面的面積 而改善氧在環(huán)境大氣和培養(yǎng)基之間的交換。
有利地，為使膜穩(wěn)定，也可以在培養(yǎng)基中加入添加劑以改變水的流變學(xué)特
性，這樣的添加劑包括表面活性劑、普流羅尼(Pluronic)F68、甘油、季銨以及
能改變培養(yǎng)基流變學(xué)特性的任何其他添加劑。
在一個特別優(yōu)選的實施方式中，基本垂直或傾斜的流動壁包含親水膜。 實際上，如果流動壁不是或者不包含親水表面，則在其表面獲得培養(yǎng)基膜
是非常困難的。此外，常規(guī)壁上形成的膜是不穩(wěn)定的。因此，用親水膜覆蓋流動壁就能實現(xiàn)海綿的作用，自然可使培養(yǎng)基均勻地擴散和流動。因此，培養(yǎng)基 膜與環(huán)境大氣之間的接觸面被大大增加，這使得氧合作用可與高細(xì)胞密度相匹
配。所得總氧氣轉(zhuǎn)移的系數(shù)約為103-102 5.1。
在具有培養(yǎng)模塊的實施方式中，如果一些或所有的第四區(qū)包括具有親水膜 的流動壁，則氣-液交換將被進一步改善。因此，即便是一系列中的最后一個 模塊也有氧合培養(yǎng)基供應(yīng)。在具有培養(yǎng)基循環(huán)的現(xiàn)有技術(shù)的一些情況中，當(dāng)進 行培養(yǎng)時，例如體積為200升，培養(yǎng)基循環(huán)末端的細(xì)胞相對氧氣供應(yīng)不足，且 生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞生長不是均勻的。
在本發(fā)明所述的設(shè)備中，不存在氧氣供應(yīng)不足的區(qū)域或死角。 在一個有利的實施方式中，本發(fā)明所述的設(shè)備包括至少一個氣體入口開口
和一個氣體出口開口。
培養(yǎng)容器優(yōu)選包括至少一個氣體入口開口和一個氣體出口開口 。這樣可以 使本發(fā)明所述設(shè)備的環(huán)境大氣富含氧氣，例如，當(dāng)細(xì)胞消耗氧氣時。還可以給
環(huán)境大氣提供其他氣體，例如加入C02以改變pH，或者細(xì)胞培養(yǎng)時通常采用
的任何其他氣體。出口開口能夠防止壓力過大并排出氧濃度低的氣體或僅僅是 環(huán)境大氣中的部分氣體，從而降低本發(fā)明所述設(shè)備的環(huán)境壓力。同時，當(dāng)需要 略微過壓時這種氣體出口是能夠關(guān)閉或"關(guān)小"的。
氣體入口設(shè)置在培養(yǎng)容器的第一、第二、第三或第四區(qū)或與它們相連。第 一和第四區(qū)是優(yōu)選的區(qū)域。第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)不易受氣-液接觸影響，而培養(yǎng) 容器的第二區(qū)是細(xì)胞培養(yǎng)容器，其中，直接的氣-液接觸將會有使細(xì)胞組分氧 化的風(fēng)險，這是不利的。
有利地，氣體入口開口與至少一個第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)相連。 由于第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)在最后氣-液接觸最大，它還作為氧合區(qū)(有或沒有 流動壁)，因此在最后使其直接接收加入的新鮮氣體以促進培養(yǎng)基的氧合是有 利的。此外，溢入該第四區(qū)的培養(yǎng)基是被細(xì)胞消耗完全的培養(yǎng)基，因此部分氧
氣被消耗，還可能需要改變pH，因此使氣體(氧氣、空氣、C02或其他氣體) 進入該第四培養(yǎng)區(qū)以便提高任何調(diào)節(jié)或氧合作用或pH改變的功效是有利的。 在一具體的實施方式中，氣體入口與分布管相連。
在一具體的實施方式中，本發(fā)明能夠使氣泡在本發(fā)明所述的設(shè)備內(nèi)有效分散。通過浸入第一、第二、第三和第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)培養(yǎng)區(qū)內(nèi)的分布器可有效 實現(xiàn)氣泡的分散(大泡或微泡，根據(jù)應(yīng)用而定)。優(yōu)選地，通過埋入第一或第四 培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)培養(yǎng)基內(nèi)的分布器可有效實現(xiàn)氣泡的分散。
在一具體的實施方式中，培養(yǎng)容器的頂蓋與所述至少一個第二培養(yǎng)區(qū)頂壁
的至少一部分相連。
這種特別優(yōu)選的實施方式使取樣得以簡化從而使污染風(fēng)險最小化。尤其在 微載體上培養(yǎng)期間，取樣通常不是沒有任何風(fēng)險的步驟。為測量細(xì)胞密度，現(xiàn) 有方法非常有限，且這些方法既不十分可靠又復(fù)雜。因此，測量細(xì)胞密度的最
好方法是對載體取樣并在顯微鏡下觀察它們，有可能在染色之后觀察。
實際上，在常規(guī)的生物反應(yīng)器中，尤其是專利US 5 501 971的生物反應(yīng)器
中，由于培養(yǎng)區(qū)頂壁不是簡單能打開的，因此取樣是不可能的或有嚴(yán)重的污染 風(fēng)險。實際上，用戶需要打開培養(yǎng)容器頂蓋，這種頂蓋通常又大又重因此很難 在無菌環(huán)境下移動它，然后要托住頂蓋，通常是固定于托板或用于升起培養(yǎng)基 因此又重又大的其他設(shè)備，并且他需要確保他不會接觸任何內(nèi)容物并用一只手 托住以免污染。然后，他必須用另一只手打開培養(yǎng)區(qū)頂壁并用另一只手托住它。 然后，他必須通過第三只手中的夾鉗對一種或多種載體取樣以便能夠估算細(xì)胞 密度。這就需要有第二個用戶或者他的右手需要非常靈巧。
本發(fā)明將頂蓋固定于培養(yǎng)區(qū)的頂壁從而大大簡化了這一步驟；所需做的一 切只是簡單地抬起頂蓋頂蓋，培養(yǎng)區(qū)頂壁也同時升起，并放入無菌夾鉗或諸如 吸液管之類的取樣工具對一種或多種載體取樣以便估算細(xì)胞密度。接觸未滅菌 對象的風(fēng)險以及污染的風(fēng)險被大大降低。
有利地，在某些實施方式中，本發(fā)明所述的設(shè)備還包括設(shè)計成用來加熱轉(zhuǎn) 移的培養(yǎng)基的加熱裝置。這種加熱裝置宜設(shè)置在第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)或培養(yǎng)基循 環(huán)裝置上。當(dāng)然，第一區(qū)也可包含這種加熱裝置。
加熱裝置可以是電子元件、電線圈或是通常用于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的任何其他 加熱裝置，例如恒溫控制的雙層夾套。
實際上，在大或超大規(guī)模培養(yǎng)中，將本發(fā)明所述的設(shè)備放在恒溫控制的設(shè) 備或房間內(nèi)通常不容易。因此，本發(fā)明通過直接放置加熱設(shè)備以恒溫控制培養(yǎng) 基并在培養(yǎng)容器內(nèi)提供均勻的溫度從而解決了這一問題。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的設(shè)備提供了沒有任何不均勻加熱點的培養(yǎng)基加熱。
在某些實施方式中，本發(fā)明所述的設(shè)備包括測量培養(yǎng)參數(shù)的傳感器，所述 傳感器與培養(yǎng)基接觸。培養(yǎng)參數(shù)中包括溶解氧分壓、pH、溫度、光密度、某些
營養(yǎng)物的濃度，如乳酸鹽、銨、碳酸鹽、葡萄糖或者例如可能影響細(xì)胞密度的 任何代謝產(chǎn)物或要被代謝的物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明可以考慮使用這些參數(shù)的調(diào)節(jié)回路(regulationloop)。例如，這
些調(diào)節(jié)回路能夠根據(jù)現(xiàn)有溶解氧分壓或被細(xì)胞消耗的溶解氧的量調(diào)節(jié)被注入 氣體環(huán)境中的氧氣的量。可根據(jù)傳感器獲得的pH值或這種類型的培養(yǎng)中通常 采用的其他調(diào)節(jié)類型來注入C02。
優(yōu)選將傳感器安置在至少一個第四區(qū)的底部。第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)也是安置 傳感器的優(yōu)選區(qū)域，這是由于該區(qū)域的培養(yǎng)基來自所通過的培養(yǎng)區(qū)，因此該處 的傳感器獲得的值能準(zhǔn)確代表細(xì)胞消耗。
有利地，所述傳感器是一次性光學(xué)傳感器，前提是它能夠?qū)⒋泶郎y參數(shù) 的光信號通過所述培養(yǎng)容器發(fā)射到位于所述設(shè)備之外的光信號接收器。
在特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明所述的設(shè)備包括一系列模塊，各培養(yǎng)模 塊在其頂部具有第一固定裝置并在其底部具有第二固定裝置，其中，所述底部 模塊還在其頂部具有第一固定裝置且所述頂部模塊還在其底部具有第二固定 裝置，所述第一固定裝置和所述第二固定裝置為互補的固定裝置，從而產(chǎn)生從 底部到頂部為底部模塊、至少一個培養(yǎng)模塊和頂部模塊的疊放順序。
有利地，所述第一和所述第二固定裝置包括以氣密和液密方式產(chǎn)生所述疊 放順序的裝置。
實際上，根據(jù)本發(fā)明，可能設(shè)計一系列模塊，各模塊的壁將構(gòu)成培養(yǎng)容器 的壁。然后再將這一系列培養(yǎng)模塊與包括循環(huán)裝置的底部模塊和包括頂蓋的頂 部模塊裝配起來。這些模塊形成的組合件從而構(gòu)成培養(yǎng)設(shè)備。根據(jù)所需培養(yǎng)體 積，可將N個模塊裝在一起以形成具有高度H的專有培養(yǎng)設(shè)備。
在一個非常具體的實施方式中，本發(fā)明所述的設(shè)備是一次性設(shè)備。
目前存在許多在小規(guī)模和大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)時能得到極好結(jié)果的生物反應(yīng) 器。不幸的是，這些生物反應(yīng)器在清潔、滅菌、操作、安放和占地方面花費較 高。實際上，在生產(chǎn)臨床批次或感興趣的藥物產(chǎn)品時，必須將生物反應(yīng)器放置在無菌絕塵室內(nèi)。 一個500升的生物反應(yīng)器要求絕塵室的體積超過其自身體積 的20倍。絕塵室的標(biāo)準(zhǔn)為裝備的占用體積，這就是說，如果裝備的占地面積
為lm2，由于地表面至上的空氣體積都要處理，則要處理的空氣體積將是(l m2 +使用者所需的表面積)X絕塵室的高度。此外，生物反應(yīng)器和所占據(jù)的房 間都需要的滅菌、消毒、洗滌、清潔等步驟是眾多昂貴又繁復(fù)的過程，這在勞 動和產(chǎn)品安裝方面帶來了巨大花銷。這就是為什么主要在藥物、生物和生化實 驗室以及絕塵室中每天越來越多地使用通常體積較小、不需要洗滌、清潔、滅 菌和消毒的一次性設(shè)備。
使常規(guī)生物反應(yīng)器可重復(fù)使用的另一種解決方案是，例如，在通過能重復(fù) 產(chǎn)生波運動的攪拌平臺攪拌的一次性無菌容器，例如WAVE⑧生物反應(yīng)器中培 養(yǎng)。不幸的是，這種生物反應(yīng)器存在放大問題，因為500升的容器(這是攪拌 平臺上可放置的最大容器)將占據(jù)很大地面，這使得絕塵室空氣處理花費無法 估算，此外這種容器的操作、取樣和放置培養(yǎng)參數(shù)傳感器也十分困難。
還有其他解決方案，如叫做"旋轉(zhuǎn)器"的攪拌式一次性燒瓶。這些燒瓶也 不可能放大規(guī)模，且這些燒瓶的氧轉(zhuǎn)移低且在攪拌期間會對細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)力。
還可以在CELLCUBE②或CELLFACTORY⑧系統(tǒng)中培養(yǎng)。這種系統(tǒng)難以調(diào) 節(jié)且體積龐大。此外，它們的氧轉(zhuǎn)移弱并需要大體積的培養(yǎng)箱。放大又一次是 繁復(fù)的。
還已知BELLOCELI^系統(tǒng)。這種系統(tǒng)基于將細(xì)胞固定在填充于培養(yǎng)區(qū)內(nèi) 的多孔基質(zhì)中。培養(yǎng)基在較低區(qū)域裝有可壓縮的風(fēng)箱。培養(yǎng)基被升高并交替落 下以使基質(zhì)浸入培養(yǎng)基然后使基質(zhì)暴露于環(huán)境空氣。
不幸的是，該系統(tǒng)的放大也很困難。難以調(diào)節(jié)和測量培養(yǎng)參數(shù)。此外，細(xì) 胞在首先遇到下落培養(yǎng)基邊緣、干燥、以及之后的上升培養(yǎng)基邊緣時其表面會 承受拉伸應(yīng)力，這對于細(xì)胞生長是有害的。
總之，目前還不沒有在絕塵室和實驗室中易于使用的適合大規(guī)模和小規(guī)模 培養(yǎng)的一次性細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
因此，本發(fā)明獲得了一種非常創(chuàng)新的解決方案，它解決了這些缺點中的極 大部分，其方法是通過獲得出乎意料的系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在小規(guī)模和大規(guī)模使用， 適合在懸浮液中、載體上或微載體上培養(yǎng)，攪拌后能使培養(yǎng)基均勻而不存在死角或細(xì)胞聚集的區(qū)域。此外，由于不存在中央主軸，污染風(fēng)險非常低或者甚至 不存在。
實際上，本發(fā)明所述的設(shè)備具有上述常規(guī)生物反應(yīng)器的所有優(yōu)點，并且是 一次性的。本發(fā)明所述的設(shè)備由基于離心泵的與外界沒有任何接觸的培養(yǎng)基循 環(huán)裝置通過磁力攪拌。加熱裝置，例如電線圈，也為培養(yǎng)基提供均勻加熱且不 與外界接觸。
此外，如上所述，在特別優(yōu)選的方式中，本發(fā)明所述的培養(yǎng)設(shè)備包括傳感 器，所述傳感器是設(shè)計成將代表待測參數(shù)的光信號通過所述培養(yǎng)容器發(fā)射到位 于所述設(shè)備之外的光信號接收器的一次性光學(xué)傳感器。
因此，還測量了本發(fā)明所述設(shè)備壁上的培養(yǎng)參數(shù)，且這不需要與外界接觸， 與穿過經(jīng)典生物反應(yīng)器頂蓋頂蓋的溶解氧或pH探針不同，后者有無法徹底清 潔這些穿過開口的探針的風(fēng)險和由于缺乏密封而帶來污染的風(fēng)險。
傳感器可安置在本發(fā)明所述設(shè)備的底部或頂部，或者這兩者。當(dāng)傳感器位 于頂部和底部時，通過與細(xì)胞數(shù)相關(guān)或不相關(guān)的簡單數(shù)學(xué)差分操作就能夠連續(xù) 測量細(xì)胞呼吸。
附帶權(quán)利要求提到了該設(shè)備的其他實施方式。
本發(fā)明的另一個目的是本發(fā)明所述培養(yǎng)設(shè)備在懸浮液中、微載體上或載體 上進行細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。實際上，當(dāng)將本發(fā)明所述的設(shè)備用于在載體或微載 體上培養(yǎng)時，載體或微載體被限制在所述第二培養(yǎng)區(qū)。當(dāng)該設(shè)備被用于懸浮細(xì) 胞培養(yǎng)時(因此沒有載體或微載體)，具有開口的壁是培養(yǎng)基可滲透但細(xì)胞無法 滲透的膜。該膜的孔徑是所有尺寸的函數(shù)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述培養(yǎng)設(shè)備 在生產(chǎn)重組產(chǎn)品、病毒、代謝物等中的應(yīng)用。
重組產(chǎn)品是指藥物學(xué)研究感興趣的蛋白質(zhì)、治療或預(yù)防性分子、抗體、質(zhì) 粒、或者能夠由培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的任何其他分子，這種生產(chǎn)可通過分泌或在胞內(nèi) 產(chǎn)生。
本發(fā)明還涉及在具有培養(yǎng)基循環(huán)的培養(yǎng)容器內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞的方法，所述方法 包括
-將培養(yǎng)基引入培養(yǎng)基循環(huán)裝置，
-從所述培養(yǎng)基循環(huán)裝置中排出培養(yǎng)基，-將培養(yǎng)基向上轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移區(qū)的至少一次第一次轉(zhuǎn)移，
-將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到第二細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)的至少一次第二次轉(zhuǎn)移。
該方法的特征在于，它還包括
-所述第一次培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移之后的將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)的至 少一次第三次培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移，此次轉(zhuǎn)移通過從第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)溢出到第三培養(yǎng) 基轉(zhuǎn)移區(qū)而進行，
-所述第二次培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移之后的將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)的至 少一次第四次培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移，此次轉(zhuǎn)移通過從第二培養(yǎng)區(qū)溢出到第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移
區(qū)而進行，
且所述第二次培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移是將培養(yǎng)基向下轉(zhuǎn)移。
如上所述，不同于專利US 5 501 971的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)基向上穿過培養(yǎng)區(qū)， 這能夠防止細(xì)胞在培養(yǎng)區(qū)底部聚集并降低細(xì)胞上的壓力。因此，本發(fā)明的培養(yǎng) 方法是一種特別具有新穎性的方法，它在培養(yǎng)時沒有死角且沒有任何細(xì)胞聚集 區(qū)，能夠以非常高的效率培養(yǎng)。
有利地，該方法還包括在一次或多次所述轉(zhuǎn)移過程中氧合培養(yǎng)基。 優(yōu)選在一次或多次所述轉(zhuǎn)移期間通過直接氣-液接觸進行所述氧合。 在一具體的實施方式中，所述氧合是在第四次培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移過程中進行的， 所述第四次培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移是使所述培養(yǎng)基沿流動壁流動。
在該方法一個有利的實施方式中，為使膜穩(wěn)定，也可以在培養(yǎng)基中加入添 加劑以改變水的流變學(xué)特性，這樣的添加劑包括表面活性劑、普流羅尼F68、 甘油、季銨以及能改變培養(yǎng)基流變學(xué)特性的任何其他添加劑。 同樣有利地，所述培養(yǎng)基流動是沿親水壁流動。 附帶權(quán)利要求提到了本發(fā)明所述方法的其他實施方式。 通過以下描述、本發(fā)明的非限制性具體實施方式
以及附圖，本發(fā)明的其他 特征、細(xì)節(jié)和優(yōu)點將更加顯而易見。


圖1是本發(fā)明所述培養(yǎng)設(shè)備是輪廓圖。
圖2是培養(yǎng)基循環(huán)裝置一種變化形式的輪廓圖。
圖3是包括若干連續(xù)培養(yǎng)區(qū)、尤其適合放大的本發(fā)明所述培養(yǎng)設(shè)備的輪廓圖4高度概括了圖3的一種變化形式。
圖5是限定本發(fā)明所述設(shè)備優(yōu)選實施方式的培養(yǎng)基循環(huán)裝置的底部模塊底 部的橫截面圖。
圖6是圖5所示限制培養(yǎng)基循環(huán)裝置的底部模塊底部的頂視圖。
圖7是限制本發(fā)明所述設(shè)備優(yōu)選實施方式的循環(huán)裝置的底部模塊頂部的橫
截面圖。
圖8是限制圖7所示設(shè)備的循環(huán)裝置的底部模塊頂部的頂視圖。 圖9是通過模塊集合，尤其是一次性模塊集合產(chǎn)生的本發(fā)明所述培養(yǎng)設(shè)備 的橫截面圖。
圖10是圖9的分解圖。
在這些圖中，參考符號指代相同或類似的元件。
由圖1可見，培養(yǎng)設(shè)備1包括基本垂直且呈圓柱形的培養(yǎng)容器2，盡管本 發(fā)明也考慮了其他形式，例如任何棱柱形，優(yōu)選規(guī)則的棱柱形。培養(yǎng)容器包括 至少四個相互連通的區(qū)域。從容器中央向外側(cè)，該容器包括第一區(qū)3，第三區(qū) 4a、 4b，第二區(qū)5和第四區(qū)6。
含有經(jīng)孵育的細(xì)胞的區(qū)域用字母C表示，而培養(yǎng)基用字母M表示。 培養(yǎng)容器2在其底部包括培養(yǎng)基循環(huán)裝置。在該優(yōu)選的實施方式中，培養(yǎng) 基循環(huán)裝置由圍繞中央旋轉(zhuǎn)軸8(真實的或虛擬的)旋轉(zhuǎn)的磁力設(shè)備7，如磁力棒 7構(gòu)成，其第一端位于頂部嚙合裝置9內(nèi)，而其第二端位于底部嚙合裝置10 內(nèi)。磁力棒由圖中未顯示出的位于培養(yǎng)容器2之外的旋轉(zhuǎn)磁力驅(qū)動馬達驅(qū)動。 循環(huán)裝置包括至少一個培養(yǎng)基入口 11。培養(yǎng)基入口 ll包括至少一個第一端， 該端是培養(yǎng)基流動的轉(zhuǎn)向擋板12。磁力棒的功能是作為離心泵，也就是說培養(yǎng) 基在磁力棒產(chǎn)生的培養(yǎng)基移動作用下吸入相對中心的區(qū)域并圍繞中心點向外 推進。培養(yǎng)基轉(zhuǎn)向擋板12引導(dǎo)培養(yǎng)基位于磁力棒相對中心的區(qū)域，以使培養(yǎng) 基被吸入其中然后向外推進。
有利地，入口位于相同的平面(星形)且入口 11的數(shù)目能使它們的位置對稱 出現(xiàn)。更具體地說，如果有三個入口，則宜使它們相互之間隔開約120°，如果 入口的數(shù)目等于4，則入口之間相隔的角度約等于90°，如果入口的數(shù)目等于 10，則以約等于36。的間隔角度設(shè)置入口。
18培養(yǎng)基循環(huán)裝置還包括至少一個培養(yǎng)基出口 13。培養(yǎng)基出口 13宜位于在 培養(yǎng)基在磁力棒離心作用下推進的位置上。
有利地，出口 13的數(shù)目將使它們的位置對稱出現(xiàn)。更具體地說，如果有
三個出口，則宜使它們相互之間隔開約120°，如果出口的數(shù)目等于4，則出口 之間相隔的角度約等于卯。，如果出口的數(shù)目等于IO，則以約等于36。的間隔 角度設(shè)置出口。
優(yōu)選地，出口不位于與入口相同的水平面上。培養(yǎng)容器的底部包括至少一 個與所述至少一個出口 13相鄰的培養(yǎng)基導(dǎo)向裝置14，該裝置能引導(dǎo)培養(yǎng)基朝 上向培養(yǎng)容器2頂部推進。
培養(yǎng)容器2的第一區(qū)3基本位于中心區(qū)域并且是培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)。第一區(qū)3 包括基底部分3a和圓柱部分3b?；撞糠?a的直徑小于培養(yǎng)容器2的直徑。 基底部分3a與所述培養(yǎng)基循環(huán)裝置的至少一個培養(yǎng)基出口 13培養(yǎng)基連通?；?底部分3a在第一區(qū)3的頂部縮小成直徑小于基底部分3a的圓柱部分3b。頂部 圓柱部分3b包括與所述第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)的基底部分3a直接培養(yǎng)基連通的外 壁。
第三區(qū)4位于第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)3之外，是培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)。第三區(qū)還包括 實質(zhì)上基底部分4a(以套管形式)和基本呈圓柱形的頂部4b。
第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)4的基本上圓柱形的部分4b實質(zhì)上與第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移 區(qū)3的實質(zhì)上圓柱形部分3b同心，且這兩個部分培養(yǎng)基連通。培養(yǎng)基連通是 通過開口或管子、通過溢出(如圖所示)、或能夠?qū)崿F(xiàn)這種連通的任何其他可能 方法實現(xiàn)的。
第二區(qū)5是有或沒有載體或微載體的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)。第二區(qū)5也是套管形式， 其中心為第一和第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)3和4。
第二區(qū)5包括底壁15和頂壁16，各壁15和16具有能夠轉(zhuǎn)移培養(yǎng)過的基 本不含細(xì)胞的培養(yǎng)基的開口 17。第二培養(yǎng)區(qū)5通過允許培養(yǎng)基通過的底壁15 中的開口 17與第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)4的相對基底部分4a培養(yǎng)基連通。
第四區(qū)6是培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)，它位于第二培養(yǎng)區(qū)5之外但在培養(yǎng)容器2之內(nèi)。 第四區(qū)6與第二培養(yǎng)區(qū)5培養(yǎng)基連通。它還通過所述至少一個入口 11與培養(yǎng) 基循環(huán)裝置培養(yǎng)基連通。培養(yǎng)基連通是通過開口或管子、通過溢出、或通過能夠?qū)崿F(xiàn)這種連通的任何其他可能方法實現(xiàn)的。
這里描述的具體實施方式
包括基本呈圓柱形的培養(yǎng)容器，但也可考慮其他 實施方式，如前所述，例如基本棱柱形的容器，優(yōu)選規(guī)則的棱柱形。顯然也可 以具有不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)。它們也可以是棱柱形的，優(yōu)選規(guī)則的棱
柱形，也可以是任何形狀組合。此時，術(shù)語"套管"的橫截面必須與棱柱的橫 截面類似。
當(dāng)操作培養(yǎng)基循環(huán)裝置時，培養(yǎng)基通過所述至少一個出口 13離開，當(dāng)有 若干出口時則通過各個出口 13離開，并在導(dǎo)向裝置14的作用下轉(zhuǎn)向，終止于
第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)3的實質(zhì)上基底部分3a。第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)3的結(jié)構(gòu)以及泵 的輸出要求培養(yǎng)基流向第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)3的基本上圓柱形部分3b。當(dāng)培養(yǎng)基 到達實質(zhì)上圓柱形部分3b的壁頂部時就溢入第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)4。 培養(yǎng)基M的循環(huán)方向在圖中用箭頭顯示。
對于精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，在這個具體實施方式
，出于效 率和流速的原因，第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)3的實質(zhì)上圓柱形部分3b的壁的高度小 于第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)4的壁，但容易理解的是，第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)3的實質(zhì)上 圓柱形部分3b的壁也可以高于第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)4的實質(zhì)上圓柱形部分4b的壁。
因此，培養(yǎng)基在泵所賦予的流速和重力作用下從第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)4向下 流向?qū)嵸|(zhì)上圓柱形部分4a并到達第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)4的實質(zhì)上基底部分4b。 培養(yǎng)基然后在泵所賦予的流速作用下通過連通的容器向上流動并到達第二培 養(yǎng)區(qū)5頂部。培養(yǎng)基經(jīng)第二培養(yǎng)區(qū)5底壁15中的允許基本不含細(xì)胞的培養(yǎng)基 17通過的開口從第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)4到達第二培養(yǎng)區(qū)5。
如上所述，可根據(jù)培養(yǎng)類型確定培養(yǎng)基能通過的開口 17的大小。如果培 養(yǎng)物中不含載體，則具有開口 17的壁15或.6將是孔徑小于細(xì)胞直徑的多孔 膜。如果在微載體或載體上培養(yǎng)，則開口 17的大小將小于微載體或載體的大 小。
當(dāng)培養(yǎng)基的流動邊緣到達第二培養(yǎng)區(qū)5的壁的頂部時就溢入第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn) 移區(qū)6。自然，如果存在開口或管道，則必須理解，當(dāng)培養(yǎng)基的流動邊緣到達 開口或管道時就流入第四區(qū)6 。
20在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中，第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)6包括傾斜壁18，當(dāng) 培養(yǎng)基從第二區(qū)5進入第四區(qū)6時可在該壁上流動。傾斜壁優(yōu)選包含親水膜以 改善所示傾斜壁18上的膜形成。膜必須優(yōu)選是以盡可能防止泡沬形成。為使 膜穩(wěn)定，也可以在培養(yǎng)基中加入添加劑以改變水、尤其是培養(yǎng)基的流變學(xué)特性，
這樣的添加劑包括表面活性劑、普流羅尼F68、甘油、季銨以及能改變培養(yǎng)基 流變學(xué)特性的任何其他添加劑。
例如，親水膜將是由聚氧化乙烯構(gòu)成的膜。
傾斜壁上的膜形成是一個重要步驟，因為它允許"薄膜"上發(fā)生氧合。實 際上，相對于第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)內(nèi)的培養(yǎng)基量，氣體體積較大并能促進交換。 此外，傾斜壁上形成膜能增加氣-液接觸表面積。
由圖1可見，培養(yǎng)容器優(yōu)選包括具有至少一個氣體入口開口 20和至少一 個氣體出口開口 21的頂蓋19。氣體入口開口 20宜設(shè)置在此以便與第四培養(yǎng)基 轉(zhuǎn)移區(qū)6直接連通。在一些變化形式中，在培養(yǎng)容器2的垂直壁上或在培養(yǎng)容 器2的底部宜具有氣體入口開口 20，也就是說氣體能通過開口 20穿過培養(yǎng)容 器2上與頂蓋19相對的壁，可用管子代替這種開口 20以在液面以上開口(見 圖9)。
該實施方式中，頂蓋19由固定裝置22固定到第二培養(yǎng)區(qū)5的頂壁16。在 變化方式中，頂蓋19可以是第二培養(yǎng)區(qū)5頂壁16的一個整合部分，當(dāng)培養(yǎng)容 器2的頂蓋19升高時該部分打開。用這種方式容易取得含或不含載體的細(xì)胞 樣品以便例如估算細(xì)胞密度、細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及反映培養(yǎng)物健康的細(xì)胞的其他物理 特性。實際上，將這兩者相連就能夠簡單地通過升高培養(yǎng)容器2的頂蓋19來 打開培養(yǎng)室5。
當(dāng)懸浮培養(yǎng)時，使多孔膜與具有開口 17的第二培養(yǎng)區(qū)5的頂壁16相連是 有益的，這樣的組合件能夠提高頂蓋/膜組合件的剛性以便取樣。
圖2例舉了培養(yǎng)基循環(huán)裝置的磁力設(shè)備的一種變化形式。這里的磁力棒7 具有螺旋形狀。具有基本位于中心的旋轉(zhuǎn)軸8的磁力設(shè)備7的設(shè)計實質(zhì)上將取 決于培養(yǎng)物的體積。實際上，對于小體積的培養(yǎng)物，本發(fā)明用一個簡單的小棒 如磁力芯片就能夠循環(huán)培養(yǎng)基。對于大體積的培養(yǎng)物，本發(fā)明考慮使用磁力馬 達，該磁力馬達也由外部馬達驅(qū)動，例如養(yǎng)魚池中使用的馬達，它能使培養(yǎng)基高速循環(huán)。
根據(jù)本發(fā)明，還考慮使用氣泡發(fā)生設(shè)備(未顯示)，根據(jù)生成氣泡的大小更 通常被稱為"分布器"或"微分布器"。
有利地，當(dāng)將采用氣泡時，氣泡發(fā)生設(shè)備例如管子的穿孔端被浸入第四培 養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)底部的培養(yǎng)基中或被浸入第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)。當(dāng)選擇這種類型的氧 合時，通常還可以在薄膜上連續(xù)氧合，這就可以降低氣體流速和形成較少氣泡， 從而減少泡沫形成。此時，還可以在培養(yǎng)容器的頂蓋或在培養(yǎng)容器的垂直壁上 提供兩個氣體入口。此外，還可以考慮將氣泡發(fā)生設(shè)備僅作為救急過程并僅在 需要時使用。
培養(yǎng)設(shè)備還包括一系列培養(yǎng)參數(shù)傳感器23，例如用于測量溶解氧分壓
p02、 pH酸度、溫度、混濁度、光密度、葡萄糖、C02、乳酸鹽、銨以及通常 用來監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)的任何其他參數(shù)。這些傳感器優(yōu)選是不需要將培養(yǎng)容器內(nèi)側(cè) 與其外側(cè)相連的光學(xué)傳感器。這些傳感器23的優(yōu)選位置是臨界位置，也就是 說將它們放在靠近培養(yǎng)容器2的壁、與培養(yǎng)基M接觸是有利的，并優(yōu)選將它 們放置在戰(zhàn)略位置，如放在培養(yǎng)基M在穿過細(xì)胞之前或緊接之后所通過的區(qū) 域。
實際上，出于上述簡便和經(jīng)濟的原因，本發(fā)明尤其考慮制造一種一次性生 物反應(yīng)器。因此，這就是為什么要減少培養(yǎng)容器內(nèi)側(cè)和外側(cè)的連接。此外，本 發(fā)明的生物反應(yīng)器還考慮制造特別可靠的生物反應(yīng)器，其中，由于是一次性的 因此污染風(fēng)險被大大降低。
由圖3可見，本發(fā)明所述的設(shè)備還考慮了模塊設(shè)計，其包括可培養(yǎng)較大體 積的一系列模塊。例如，采用這種類型的模塊設(shè)計，通過使用非常有限數(shù)量的 標(biāo)準(zhǔn)模塊可實現(xiàn)約500毫升到100升的培養(yǎng)體積。
根據(jù)本發(fā)明，考慮了提供一系列可置于在具有培養(yǎng)基循環(huán)裝置和頂蓋頂蓋 19的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)容器2內(nèi)，在第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)3周圍"滑動"的模塊。
在一種特別靈活的變化形式中，本發(fā)明開始于獲得固定系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括 各種標(biāo)準(zhǔn)模塊。這些標(biāo)準(zhǔn)模塊是，例如，要被放置在組合件底部的循環(huán)裝置模 塊、 一個或多個培養(yǎng)模塊以及頂蓋模塊。根據(jù)本發(fā)明，模塊彼此夾緊，例如通 過液體和氣體宜不能滲透的快速連接件，此外也可考慮其他固定這些模塊的方法。
因此，根據(jù)培養(yǎng)類型和所需體積，用戶將能夠從他的儲備中取出包括培養(yǎng) 基循環(huán)裝置的底部模塊，他還可以根據(jù)所需的培養(yǎng)體積從中取出一定數(shù)目的培 養(yǎng)模塊，然后再取出與頂蓋相對應(yīng)的頂部模塊。然后，以無菌方式封裝所有這 些模塊，他只需要將它們拆開并將一個夾在另一個上面即可。疊加物可形成"一 次性生物反應(yīng)器"或者可將疊加物放在合適的容器中。
因此，圖3例舉了本發(fā)明所述模塊型培養(yǎng)設(shè)備的一個實施方式。 培養(yǎng)設(shè)備1包括培養(yǎng)容器2，培養(yǎng)容器2包括與圖1中詳細(xì)解釋的那些循
環(huán)裝置的培養(yǎng)基循環(huán)裝置。包括循環(huán)裝置的底部模塊mo可固定于培養(yǎng)容器2 的底部或者可滑入培養(yǎng)容器2(己經(jīng)描述過該實施方式)以便能夠安放它并使用
另一個模塊進行另外的培養(yǎng)并因此防止交叉污染。
底部模塊mo包括循環(huán)裝置。如圖1所示，這些循環(huán)裝置包括圍繞中央旋 轉(zhuǎn)軸8旋轉(zhuǎn)的磁力設(shè)備7，其第一端位于頂部嚙合裝置9內(nèi)，而其第二端位于 底部嚙合裝置10內(nèi)。循環(huán)裝置包括至少一個培養(yǎng)基入口 11。培養(yǎng)基循環(huán)裝置 還包括至少一個培養(yǎng)基出口 13。
培養(yǎng)容器的底部模塊mo包括至少一個鄰近所述至少一個出口 13的培養(yǎng)基 導(dǎo)向裝置14,該導(dǎo)向裝置能夠指導(dǎo)培養(yǎng)基朝上向培養(yǎng)容器2頂部推進。
培養(yǎng)容器2包括一系列培養(yǎng)模塊(riM， m2， ...， mn)，在該實施方式中，它 們是一個疊一個的。還可以預(yù)計，可以簡單地使它們相互相鄰，也就是說并排 放置。在圖3所示的實施方式中，通過快速連接件24或夾子將各模塊相互夾 住。
各培養(yǎng)模塊mp m2， ...， mn包括第一區(qū)3、第二區(qū)4、第三區(qū)5和第四區(qū) 6。 3、 4、 5、 6這些區(qū)域各自具有與圖l所示相同的功能。
此外，使各模塊包括與各培養(yǎng)模塊的第四區(qū)6連通的氣體或氣體混合物入 口(未顯示)也是有利的。容器也可包括過量氣體或氣體混合物的出口作為其一 部分(未顯示)。例如，氣體入口開口可存在于培養(yǎng)容器2的底部，也就是說氣 體通過貫穿培養(yǎng)容器2的與頂蓋3相對的壁上的開口經(jīng)過，且這種開口 20由 管子提供以在模塊rm的液面上方開口(見圖9)。因此，氣體混合物到達該模塊 的第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)6。放在模塊nn上的模塊m2也可包括能使培養(yǎng)模塊mi第四區(qū)6中存在的氣體混合物與模塊m2的第四區(qū)6連通的管道。因此使這種 管道通過模塊m2的底壁是有利的。
在某些實施方式中，為長期培養(yǎng)，用新鮮培養(yǎng)基代替部分培養(yǎng)基或加入營 養(yǎng)物是有益的。因此，底部模塊mo則可包括營養(yǎng)物入口(未顯示)。同樣有利地， 培養(yǎng)容器在培養(yǎng)基循環(huán)裝置中可包括培養(yǎng)基出口(未顯示)以防止溢出。
在類似的方式中，培養(yǎng)容器2包括具有頂蓋19的頂部模塊，有利地是， 它可通過固定裝置22與具有培養(yǎng)基通過開口 17的頂壁16相連以簡化從固定 在其上的模塊mn中取樣，如圖1所示。
此外，在各培養(yǎng)模塊中提供培養(yǎng)參數(shù)傳感器也是有利的。也可以僅在一個 或幾個培養(yǎng)模塊的所有區(qū)域中或在底部模塊中提供傳感器。
在圖3所示的實施方式中，培養(yǎng)基以以下方式循環(huán)。為簡便說明，我們將 僅采用兩個培養(yǎng)模塊m,和m2以及底部模塊mo，但可以肯定的是，本發(fā)明所 述培養(yǎng)設(shè)備可包括非常多數(shù)量的培養(yǎng)模塊。
在底部模塊mo中，培養(yǎng)基經(jīng)所述至少一個出口 13(當(dāng)存在若干出口時則通 過各個出口 13)從培養(yǎng)基循環(huán)裝置M推進，并在導(dǎo)向裝置14的作用下轉(zhuǎn)向。 它終止于第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)3的實質(zhì)上基底部分3a。該實施方式的實質(zhì)上基底 部分3a是所有培養(yǎng)模塊共有的區(qū)域，在所示實施方式中，它位于底部模塊中。 當(dāng)將培養(yǎng)模塊層疊或并置時這是有效的。
本發(fā)明所述設(shè)備第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)3以及泵輸出的結(jié)構(gòu)要求培養(yǎng)基直接流 向第一模塊mi第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)3的實質(zhì)上圓柱形部分3b，流向第二模塊m2 第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)3的實質(zhì)上圓柱形部分3b。
該實施方式中，模塊裝配形成包括實質(zhì)上圓柱形部分3b的巨大的第一培 養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)3。
當(dāng)培養(yǎng)基到達第二培養(yǎng)模塊m2實質(zhì)上圓柱形部分3b的壁的頂部時，則溢 入第二培養(yǎng)模塊m2的第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)4。 培養(yǎng)基M的循環(huán)方向用箭頭表示。
因此，培養(yǎng)基在泵賦予的流速和重力下，朝向第二培養(yǎng)模塊m2第三培養(yǎng) 基轉(zhuǎn)移區(qū)4底部，在第二培養(yǎng)模塊m2實質(zhì)上圓柱形部分4a中向下流，并到達 第二培養(yǎng)模塊m2第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)的實質(zhì)上基底部分4b。然后，培養(yǎng)基在連通容器效應(yīng)和泵所賦予的流速作用下向上流動并到達第二培養(yǎng)模塊m2第二培
養(yǎng)區(qū)5的頂部。培養(yǎng)基從第二培養(yǎng)模塊m2第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)4經(jīng)第二培養(yǎng)模 塊m2底壁15上的允許基本不含細(xì)胞的培養(yǎng)基17通過的開口到達第二培養(yǎng)模 塊m2第二區(qū)5。
當(dāng)培養(yǎng)基流動邊緣到達第二培養(yǎng)模塊m2第二培養(yǎng)區(qū)5外壁的頂部時，就 溢入第二培養(yǎng)模塊m2的第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)6。顯然，如果培養(yǎng)區(qū)5的該外壁上 存在開口或管道，則必須理解，當(dāng)培養(yǎng)基流動邊緣到達該開口或管道時，它會 流入第二培養(yǎng)模塊m2的第四區(qū)6。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中，第二培養(yǎng)模塊m2的第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)6 包括傾斜壁18，當(dāng)培養(yǎng)基從第二培養(yǎng)模塊m2的第二區(qū)5進入第二培養(yǎng)模塊m2 的第四區(qū)6時能在該壁上流動。傾斜壁優(yōu)選包含親水膜以促進所述傾斜壁18 上的膜形成。膜必須優(yōu)選是以盡可能防止泡沬形成。為使膜穩(wěn)定，也可以在培 養(yǎng)基中加入添加劑以改變水的流變學(xué)特性，如上所述。
然后，第二培養(yǎng)模塊m2第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)6中的培養(yǎng)基通過管道或通過 第二培養(yǎng)模塊m2第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)6的壁的頂部(D)溢入第一培養(yǎng)模塊mi的 第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)4。
因此，培養(yǎng)基在泵賦予的流速和重力下，從第一培養(yǎng)模塊mi第三培養(yǎng)基 轉(zhuǎn)移區(qū)4，在第一培養(yǎng)模塊rm實質(zhì)上圓柱形部分4a中向下流動，到達第一培 養(yǎng)模塊nn第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)的實質(zhì)上基底部分4b。然后，培養(yǎng)基在連通容器 效應(yīng)和泵所賦予的流速作用下向上流動并到達第一培養(yǎng)模塊mi第二培養(yǎng)區(qū)5 的頂部。培養(yǎng)基從第一培養(yǎng)模塊mi第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)4經(jīng)第一培養(yǎng)模塊mi底 壁15上的允許基本不含細(xì)胞的培養(yǎng)基17通過的開口到達第一培養(yǎng)模塊im第 二區(qū)5。
當(dāng)培養(yǎng)基流動邊緣到達第一培養(yǎng)模塊m,第二培養(yǎng)區(qū)5的壁的最高點時， 就溢入第一培養(yǎng)模塊nn的第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)6。顯然，如果該壁上存在開口或 管道，則必須理解，當(dāng)培養(yǎng)基流動邊緣到達該開口或管道時，它會流入第一培 養(yǎng)模塊m!的第四區(qū)6。
第一培養(yǎng)模塊mi的第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)6包括傾斜壁18，當(dāng)培養(yǎng)基從第一 培養(yǎng)模塊m！的第二區(qū)5進入第一培養(yǎng)模塊mi的第四區(qū)6時能在該壁上流動。如上所述，傾斜壁上可以具有親水膜。
然后，培養(yǎng)基經(jīng)入口(管道)ll返回到底部模塊mo和培養(yǎng)基循環(huán)裝置，也
就是說第一培養(yǎng)模塊m,第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)6中存在的培養(yǎng)基通過管道或通過 第一培養(yǎng)模塊rm第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)6的壁的頂部溢入管道11，管道11終止于 構(gòu)成本發(fā)明所述底部模塊mo培養(yǎng)基循環(huán)裝置的所述離心泵形成的虹吸管的基 本位于中心的區(qū)域。
在圖4中高度示意表示并在圖9中詳細(xì)表示的該實施方式的一個變化形式 中，疊放的模塊m構(gòu)成培養(yǎng)容器。在圖4所示的這種變化形式中，例如，可存 在三種類型的模塊底部模塊mo，包括四個區(qū)域的模塊m,、 m2, ...,n，以及頂 部模塊m"未顯示)。底部模塊mo或基底模塊m。包括培養(yǎng)基循環(huán)裝置和裝配裝 置，裝配裝置被設(shè)計成與四區(qū)域模塊nn,2,…,n的第一裝配裝置24a嚙合，如上 所述，并構(gòu)成容器的底部。頂部模塊mt被設(shè)計成與四區(qū)域模塊rm,2, ....n的第 二裝配裝置24b嚙合。被底部模塊mo嚙合的四區(qū)域模塊nn, 2, ...,n與被頂部模 塊mt嚙合的模塊可以是相同的，或者，被底部模塊mo嚙合的四區(qū)域模塊mj, 2, .., n可以是一系列四區(qū)域模塊mi, 2. .... n中的第一個，而被頂部模塊mt嚙合的 模塊因此可以是一系列四區(qū)域模塊mi, 2, .... n中的第二個。
這種變化形式以與圖3所述相同的方式發(fā)揮作用。
圖5和6顯示了底部模塊mo基底部分中的一半。圖5為橫截面圖，圖6 為頂視圖。由圖可見，培養(yǎng)基被設(shè)計成通過在圖中用字母x表示的基本中心區(qū) 域中的至少一個入口進入底部模塊。磁力設(shè)備7的旋轉(zhuǎn)軸通過該真實或虛擬的 中心x。當(dāng)循環(huán)裝置運作時，磁力設(shè)備7圍繞其旋轉(zhuǎn)軸旋轉(zhuǎn)，其旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生將培 養(yǎng)基吸入培養(yǎng)基循環(huán)裝置的虹吸管。磁力設(shè)備旋轉(zhuǎn)的區(qū)域由擋板或壁25限定。 該實施方式中顯示了兩個擋板，但擋板的數(shù)目可以更多，如3、 4、 5、 6、 8、 10，等等。擋板將優(yōu)選是對稱放置在其周圍的。
擋板25之間的間隙13是培養(yǎng)基出口開口。實際上，培養(yǎng)基被磁力設(shè)備旋 轉(zhuǎn)形成的虹吸管吸入，同時，培養(yǎng)基通過擋板之間的開口 13朝擋板25界定區(qū) 域之外推出。盡管顯示了兩個擋板25，因此在該實施方式中有兩個培養(yǎng)基出口 開口，但擋板的數(shù)目可以更多，例如3、 4、 5、 6、 8、 10，等等。由于擋板宜 對稱設(shè)置，因此培養(yǎng)基出口 13的位置也宜對稱設(shè)置。當(dāng)培養(yǎng)基被出口 13推出時就離開實質(zhì)上的循環(huán)區(qū)域27。
該實施方式中，底部模塊m。的基底部分具有基本為呈管狀的開口 20，該
開口允許例如氣體或氣體混合物和新鮮培養(yǎng)基進入，排出氣體或氣體混合物， 排出培養(yǎng)基，等等。
此外，凹槽31是為從外部接觸這些開口20提供的，它使這些開口能夠與 氣體或氣體混合物、新鮮培養(yǎng)基等的供給相連。
圖7是本發(fā)明所述底部模塊m。的頂部的橫截面圖，圖8是該部分的頂視 圖。頂部包括基本呈管形的培養(yǎng)基入口開口 11。這些入口開口 11引導(dǎo)來自本 發(fā)明所述設(shè)備1第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)6的培養(yǎng)基進入磁力設(shè)備旋轉(zhuǎn)形成的虹吸 管。當(dāng)磁力設(shè)備旋轉(zhuǎn)時，位于圖5和6所示基本呈圓周區(qū)域27內(nèi)的培養(yǎng)基進 入穿孔26，所述穿孔26與管道28連通，使排出的培養(yǎng)基到達與本發(fā)明所述設(shè) 備第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)3、尤其與第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)的實質(zhì)上呈管狀的部分培養(yǎng) 基連通的區(qū)域。
圖7描繪的頂部是設(shè)計成放置在圖5所示底部上的部件。顯然，這種底部 模塊mo也可用其他方式獲得，但出于制造簡單的原因，在該實施方式中它是 分可連接在一起的兩個部分制造的。此外還可發(fā)現(xiàn)，頂部和底部優(yōu)選在圖5和 7所示的凹槽29處以密封方式相連。
本申請的培養(yǎng)基循環(huán)裝置的所有例子也可以不同方法制造。不言而喻的 是，制造限定或不限定在底部模塊內(nèi)的培養(yǎng)基循環(huán)裝置各種實施方式的所有方 法都包括在要求保護的范圍之內(nèi)。
圖9是本發(fā)明所述設(shè)備一個特別有益的實施方式的橫截面視圖，而圖10 是同一實施方式的分解橫截面視圖。分解圖能更加清楚地理解本發(fā)明的特殊實 踐和發(fā)明點。
因此將同時描述這兩幅圖。如所示，本發(fā)明所述設(shè)備從底部到頂部由夾在 一起的以下部件的疊層構(gòu)成
底部模塊mo的底部(moa)，其中包括由擋板25限定的磁力設(shè)備旋轉(zhuǎn)的 區(qū)域。該圖中可見的擋板25之間的間隙13是培養(yǎng)基出口開口。這是由于培養(yǎng) 基被磁力設(shè)備旋轉(zhuǎn)形成的虹吸管吸入，培養(yǎng)基通過擋板25之間的開口 13朝擋 板25界定區(qū)域的外側(cè)27(基本為環(huán)狀區(qū)域)推出， 底部模塊mo的頂部(mob)，其包括基本呈管形的培養(yǎng)基入口開口 11。 這些入口開口 11引導(dǎo)來自本發(fā)明所述設(shè)備1第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)6的培養(yǎng)基進 入磁力設(shè)備7旋轉(zhuǎn)形成的虹吸管。當(dāng)磁力設(shè)備旋轉(zhuǎn)時，位于基本呈圓周區(qū)域27 內(nèi)的培養(yǎng)基進入穿孔26，所述穿孔26與管道28連通，使排出的培養(yǎng)基到達與 本發(fā)明所述設(shè)備第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)3、尤其與第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)的實質(zhì)上呈管 狀的部分培養(yǎng)基連通的區(qū)域30，
第一培養(yǎng)模塊mp如圖3的解釋中詳細(xì)解釋，
第二培養(yǎng)模塊m2(見圖3)，
具有凹槽33的頂部模塊，其包括埋入培養(yǎng)基內(nèi)的光學(xué)傳感器23，具有 與第二培養(yǎng)模塊m2第二培養(yǎng)區(qū)5頂壁16的16a部分相連的固定裝置22的頂 蓋19。
如圖4、 9和10所示，所有模塊包括固定裝置24a和24b。各模塊包括若
干固定裝置，根據(jù)所需的裝配可使用或不使用這些裝置，但使用這種裝置能夠 獲得可與其他培養(yǎng)模塊以及與底部模塊或頂部模塊裝配的單一培養(yǎng)模塊。這些
固定裝置是，例如，具有環(huán)形密封的同心圓環(huán)，細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域熟知的快速連接 件，螺絲釘和鋸齒，或可用來裝配本發(fā)明的這些模塊的任何其他設(shè)備。
在該實施方式中，底部模塊m。的基底部分與基本呈管形的開口 20相連， 此時能通過該開口弓I入氣體或氣體混合物。氣體入口開口 20與管道32相連， 管道32終止于培養(yǎng)基平面之上，從而使氣體或氣體混合物至少能夠到達本發(fā) 明所述培養(yǎng)設(shè)備1的第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)6。本發(fā)明所述培養(yǎng)設(shè)備1第四培養(yǎng)基 轉(zhuǎn)移區(qū)6的所有環(huán)境大氣通過類似管道32相連，從而使氣體混合物能夠到達 頂部。這在具有在高度上可疊加的模塊的設(shè)備中特別有利，所述高度可以非常 高，從而可通過反應(yīng)器底部提供氣體。
在一種變化形式中，基底部分包括氣體或氣體混合物進料管以便為裝有磁 力設(shè)備的區(qū)域提供氣態(tài)物質(zhì)。采用這種方法，磁力設(shè)備的旋轉(zhuǎn)使進入的氣體攪 拌起來，同時培養(yǎng)基運動促進氧氣溶解。過量的氣體也被攪拌并以小氣泡的形 式繼續(xù)向上移動。這種變化也適用于圖l所示的實施方式。
此外，凹槽31是為從外側(cè)接觸這些開口20而提供的，從而使得可將這些 開口與氣體、氣體混合物、新鮮培養(yǎng)基等的供給相連。模塊mQ的頂部m。b是設(shè)計成被固定裝置28夾緊并被底部模塊mo底部m0a 的環(huán)狀密封34密封的元件。
顯然，本發(fā)明不限于上述實施方式，可對其做出許多修飾而不背離權(quán)利要 求的范圍。
例如，圖l所示的本發(fā)明所述設(shè)備也可包括營養(yǎng)物進料口，它可位于穿過
頂蓋的管道內(nèi)或穿過本發(fā)明所述設(shè)備一個壁的管道內(nèi)。同樣，本發(fā)明所述設(shè)備 或者模塊或各個四區(qū)域模塊的第一或第四區(qū)內(nèi)也可存在加熱裝置。可能的話，
本發(fā)明所述設(shè)備還可包括若干培養(yǎng)基循環(huán)裝置，例如若干離心泵。
組件列表
1. 培養(yǎng)設(shè)備
2. 培養(yǎng)容器
3. 第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)
3a.第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)基底部分
3b.第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)的頂部圓柱部分
4. 第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)
4a.第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)的基底部分 4b.第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)的圓柱形頂部
5. 第二培養(yǎng)區(qū)
6. 第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)
7. 磁力設(shè)備
8. 中央旋轉(zhuǎn)軸
9. 頂部嚙合裝置
10. 底部嚙合裝置
11. 培養(yǎng)基入口
12. 轉(zhuǎn)向擋板
13. 培養(yǎng)基出口
14. 培養(yǎng)基導(dǎo)向裝置
15. 第二培養(yǎng)區(qū)的底壁16. 第二培養(yǎng)區(qū)的頂壁
17. 第二培養(yǎng)區(qū)頂壁和底壁內(nèi)的開口
18. 傾斜壁
19. 培養(yǎng)容器頂蓋
20. 氣體入口開口 21 .氣體出口開口
22. 將頂蓋固定于第二培養(yǎng)區(qū)頂壁的裝置
23. 傳感器
24. 裝配裝置
24a.第一裝配裝置 24b.第二裝配裝置
25. 底部模塊的擋板或壁
26. 底部模塊中的穿孔
27. 實質(zhì)上的循環(huán)區(qū)域
28. 管道
29. 環(huán)狀密封的凹槽
30. 與第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)培養(yǎng)基連通的區(qū)域
31. 連接開口20的凹槽
32. 氣體給料管道
33. 頂蓋中放置傳感器的凹槽
34. 環(huán)狀密封 mo=底部模塊
至mn =培養(yǎng)模塊 mt=頂部模塊 M=培養(yǎng)基 C=細(xì)胞
D=第四培養(yǎng)區(qū)的頂壁
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備(1)，其包括-具有頂蓋(19)的培養(yǎng)容器(2)，其中設(shè)置有至少一個第一區(qū)(3)和至少一個第二區(qū)(5)，所述第一區(qū)(3)是基本不含任何細(xì)胞的培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移區(qū)，而所述第二區(qū)(5)是細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)，所述第一區(qū)(3)位于第二區(qū)內(nèi)部，-使培養(yǎng)基通過培養(yǎng)區(qū)(5)循環(huán)的循環(huán)培養(yǎng)基的裝置，所述培養(yǎng)區(qū)(5)包括底壁(15)和頂壁(16)，各壁(15，16)具有能夠轉(zhuǎn)移基本不含細(xì)胞的培養(yǎng)基的開口(17)，其特征在于，它還包含至少一個第三區(qū)(4)和至少一個第四區(qū)(6)，這兩個區(qū)都是基本不含細(xì)胞的培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移區(qū)，所述第三區(qū)(4)是所述第二區(qū)(5)之內(nèi)和所述第一區(qū)(3)之外的區(qū)域，而所述第四區(qū)(6)是所述第二區(qū)(5)之外的區(qū)域，所述第三區(qū)(4)與第一(3)和第二區(qū)(5)培養(yǎng)基連通，而所述第四區(qū)(6)經(jīng)培養(yǎng)基循環(huán)裝置與第二區(qū)(5)(培養(yǎng)區(qū)(5))和第一區(qū)(3)(培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)(3))培養(yǎng)基連通，其中，培養(yǎng)基循環(huán)裝置能夠使培養(yǎng)基在所述第二培養(yǎng)區(qū)(5)內(nèi)從底部循環(huán)到頂部。
2. 如權(quán)利要求1所述的設(shè)備(l)，其特征在于，培養(yǎng)基循環(huán)裝置由設(shè)置在 所述培養(yǎng)設(shè)備(1)底部的離心泵以及至少一個導(dǎo)向裝置(12， 14， 25)構(gòu)成，包括 至少一個能夠圍繞基本位于中心的旋轉(zhuǎn)軸(8)旋轉(zhuǎn)的磁力設(shè)備(7)、至少一個入 口(11)和至少一個培養(yǎng)基出口(13)，所述循環(huán)裝置被設(shè)計成將培養(yǎng)基吸入由磁力 設(shè)備(7)旋轉(zhuǎn)形成的虹吸管并將培養(yǎng)基推向置于所述磁力設(shè)備(7)外部區(qū)域內(nèi)的 培養(yǎng)基出口(13)，所述離心泵由設(shè)計成能使不與所述設(shè)備(l)外部連通的培養(yǎng)基 產(chǎn)生循環(huán)的旋轉(zhuǎn)磁力馬達驅(qū)動，前提是能引導(dǎo)培養(yǎng)基通過所述出口(13)朝容器 (2)頂部推進。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的設(shè)備(1)，其包括一系列培養(yǎng)模塊(mp ...， mn)， 各模塊包括所述第一區(qū)(3)、所述第二區(qū)(5)、所述第三區(qū)(4)和所述第四區(qū)(6)， 其中，所述一系列培養(yǎng)模塊中的相鄰模塊由培養(yǎng)基連通，且各模塊的所述第一 區(qū)(3)和所述第四區(qū)(6)直接或間接與所述循環(huán)裝置連通。
4. 如上述權(quán)利要求中任一項所述的設(shè)備(l)，其特征在于，循環(huán)裝置被限 定在底部模塊(mo)內(nèi)，所述底部模塊(mo)與至少一個第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)(3)和至少一個第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)(6)直接或間接培養(yǎng)基連通。
5. 如上述權(quán)利要求中任一項所述的設(shè)備(l)，還包括頂部模塊(mt)，所述頂 部模塊(mt)至少包括頂蓋(19)。
6. 如上述權(quán)利要求中任一項所述的設(shè)備(l)，其特征在于，所述至少一個 第四區(qū)(6)包括至少一個基本垂直或傾斜的流動壁(18)。
7. 如權(quán)利要求5所述的設(shè)備(l)，其特征在于，所述基本垂直或傾斜的流 動壁(18)包含親水膜。
8. 如上述權(quán)利要求中任一項所述的設(shè)備(l)，還包括至少一個氣體入口開 口(20)和一個氣體出口開口(21)。
9. 如權(quán)利要求7所述的設(shè)備(1)，其特征在于，所述氣體入口開口(20)與至 少一個第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)(6)連通。
10. 如權(quán)利要求5或6所述的設(shè)備(l)，其特征在于，所述氣體入口開口(20) 與分布管相連。
11. 如上述權(quán)利要求中任一項所述的設(shè)備(l)，其特征在于，培養(yǎng)容器(2) 的頂蓋(19)與至少一個第二培養(yǎng)區(qū)(5)所述頂壁(16)的至少一部分相連。
12. 如上述權(quán)利要求中任一項所述的設(shè)備(l)，還包括加熱裝置，前提是能 加熱轉(zhuǎn)移的培養(yǎng)基(M)。
13. 如上述權(quán)利要求中任一項所述的設(shè)備(l)，還包括測量培養(yǎng)參數(shù)的傳感 器(23)，所述傳感器(23)與培養(yǎng)基(M)接觸。
14. 如權(quán)利要求13所述的設(shè)備(l)，其特征在于，所述傳感器(23)是一次性 光學(xué)傳感器，前提是能將代表要測量的參數(shù)的光信號通過所述培養(yǎng)容器(2)傳遞 到位于所述設(shè)備(l)之外的光信號接收器。
15. 設(shè)備(l)，其包括一系列培養(yǎng)模塊(mo， ...， mn)，各培養(yǎng)模塊(mo，...， nO包括所述第一區(qū)(3)、所述第二區(qū)(5)、所述第三區(qū)(4)和所述第四區(qū)(6)，其中， 所述一系列培養(yǎng)模塊(mc， ...， rrO中的相鄰培養(yǎng)模塊(mo，…，iO培養(yǎng)基連通， 各培養(yǎng)模塊(mo， ...， mn)的所述第一區(qū)(3)和所述第四區(qū)(6)直接或間接與所述循 環(huán)裝置連通，其中，循環(huán)裝置被限定在底部模塊(mo)中，所述底部模塊(mo)與 至少一個第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)(3)和至少一個第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)(6)直接或間接培 養(yǎng)基連通，如權(quán)利要求5-14中任一項所述，其中，各培養(yǎng)模塊(mo， ...， mj在其頂部包括第一固定裝置(24a)并在其底部包括第二固定裝置(24b)，其中，所述 底部模塊(mo)在頂部(mOb)還包括第一固定裝置(24a)且所述頂部模塊(mt)在其 底部還包括第二固定裝置(24b)，所述第一固定裝置(24a)和所述第二固定裝置 (24b)為互補的固定裝置，從而產(chǎn)生從底部到頂部為底部模塊(mo)、至少一個培 養(yǎng)模塊(mo， ...， m。)和頂部模塊(mt)的疊放順序。
16. 如權(quán)利要求15所述的設(shè)備(l)，其特征在于，所述第一(24a)和所述第 二固定裝置(24b)包括用于以氣密和液密方式產(chǎn)生所述疊放順序的裝置(34)。
17. 如權(quán)利要求1-16中任一項所述的一次性設(shè)備(l)。
18. 如權(quán)利要求1-17中任一項所述的設(shè)備(l)在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。
19. 如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，用于在固定床或流化床的微載體上培養(yǎng)細(xì)胞。
20. 如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，用于在懸浮液中培養(yǎng)細(xì)胞。
21. 如權(quán)利要求18-20中任一項所述的應(yīng)用，用于產(chǎn)生重組產(chǎn)品、病毒、 代謝物等。
22. 在具有培養(yǎng)基循環(huán)的培養(yǎng)容器(2)內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞的方法，所述方法包括 -將培養(yǎng)基(M)引入培養(yǎng)基循環(huán)裝置，-從所述培養(yǎng)基循環(huán)裝置中排出培養(yǎng)基(M)，-將第一培養(yǎng)基向上轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移區(qū)(3)的至少一次第一次培養(yǎng)基(M)轉(zhuǎn)移， -將培養(yǎng)基(M)轉(zhuǎn)移到第二細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)(5)的至少一次第二次轉(zhuǎn)移， 其特征在于，所述方法還包括-所述第一次培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移之后的將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至第三培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)(4)的 至少一次第三次培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移，此次轉(zhuǎn)移通過從第一培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)(3)溢出到第三 培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)(4)而進行，-所述第二次培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移之后的將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至第四培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移區(qū)(6)的 至少一次第四次培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移，此次轉(zhuǎn)移通過從第二培養(yǎng)區(qū)(5)溢出到第四培養(yǎng)基 轉(zhuǎn)移區(qū)(6)而進行，且所述第二次培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移是將培養(yǎng)基向下轉(zhuǎn)移。
23. 如權(quán)利要求22所述的培養(yǎng)細(xì)胞的方法，還包括在一次或多次所述轉(zhuǎn)移 期間氧合培養(yǎng)基。
24. 如權(quán)利要求22或23所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述氧合是在一次或多次所述轉(zhuǎn)移期間通過直接氣-液接觸發(fā)生的。
25. 如權(quán)利要求22-24中任一項所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述氧合 是在第四次培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移期間進行的，所述第四次培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移是使所述培養(yǎng)基(M) 沿流動壁(18)流動。
26. 如權(quán)利要求22-25中任一項所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng) 基(M)流動是沿親水壁流動。
全文摘要
包括具有頂蓋(19)的培養(yǎng)容器(2)的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備(1)，其中，第一區(qū)(3)用于將基本不含細(xì)胞的培養(yǎng)基在內(nèi)部轉(zhuǎn)移到第二細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)(5)，第三區(qū)(4)和第四區(qū)(6)用于轉(zhuǎn)移基本不含細(xì)胞的培養(yǎng)基。第三區(qū)(4)位于第二區(qū)(5)之內(nèi)和第一區(qū)(4)之外，而第四區(qū)(6)是所述第二區(qū)(5)之外的區(qū)域。所有區(qū)域由培養(yǎng)基連通。該設(shè)備還包括能夠使培養(yǎng)基循環(huán)從底部到頂部通過培養(yǎng)區(qū)(5)的培養(yǎng)基循環(huán)裝置。
文檔編號C12M3/00GK101316925SQ200680044141
公開日2008年12月3日 申請日期2006年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月4日
發(fā)明者J·A·卡斯蒂略弗南德茲 申請人:阿爾特萊斯公司