專利名稱：鈣蛋白酶抑制蛋白基因1836位snp標(biāo)記篩選豬的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于SNP標(biāo)記篩選豬的方法，具體是利用鈣蛋白酶抑制蛋白基因編碼區(qū)域中第1836位的SNP標(biāo)記與豬肉嫩度顯著相關(guān)的特性，作為豬的SNP標(biāo)記進行輔助選種和選配。屬于家畜分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
SNP標(biāo)記(單核苷酸多態(tài)性)是指在染色體基因組水平上單個核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性，而其中一種等位基因在群體中的頻率不少于1％。SNP標(biāo)記在基因組內(nèi)可以劃分為2種形式第一是遍布于基因組的大量單堿基變異；第二是基因編碼區(qū)的功能性突變。后者由于分布在基因編碼區(qū)(codingregion)，故又稱其為cSNP(coding SNP)。cSNP常引起表達蛋白的多態(tài)性變異，從而影響它們的功能特性。在家畜分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，SNP標(biāo)記主要作為一種標(biāo)記輔助技術(shù)應(yīng)用于家畜的篩選，從而指導(dǎo)家畜的選種和選配。
豬的SNP標(biāo)記起步于90年代中期并且進展十分迅速，與此同時有關(guān)豬SNP標(biāo)記的專利爭奪正逐步展開。鑒于豬SNP標(biāo)記數(shù)目多，還有大量未被發(fā)現(xiàn)，且它們有重要的理論和應(yīng)用價值，特別是我國大量的優(yōu)良地方豬種還可能存在特有的SNP標(biāo)記，因此在我國開展豬的SNP標(biāo)記的分析、鑒定和應(yīng)用研究，開發(fā)具有我國知識產(chǎn)權(quán)的SNP標(biāo)記顯得十分迫切和必要。
隨著生活水平提高，人們對食物有了更高的要求。豬肉作為人膳食中重要的組成部分，是人們近年來改善的重點。既瘦又嫩，多汁味美的豬肉在市場上頗受消費者青睞。另一方面，隨著養(yǎng)豬業(yè)對提高肉豬生長速率和飼料效率的遺傳選育，使得肉豬生產(chǎn)水平得到了提高，但同時，豬肉品質(zhì)變得粗老，適口性差，降低了消費者對肉質(zhì)的滿意度。豬肉品質(zhì)成了當(dāng)今世界養(yǎng)豬界專家共同關(guān)心研究的一項重大課題。其中豬肉嫩度是消費者對豬肉肉質(zhì)進行評價的重要指標(biāo)，豬肉嫩度受大量的遺傳和非遺傳因素的影響，肉質(zhì)專家們針對這些影響因子做了大量的研究，許多研究都揭示了遺傳因子的重要性，這使得育種公司意識到利用基因技術(shù)來進行動物的遺傳育種在改良豬肉的嫩度上發(fā)揮著重要作用。
鈣蛋白酶抑制蛋白基因是影響豬肉嫩度的一個重要的候選基因，許多科研工作者都試圖在鈣蛋白酶抑制蛋白基因中尋找影響豬肉嫩度的SNP標(biāo)記位點。經(jīng)文獻檢索和專利檢索發(fā)現(xiàn)，Ernst(1998)等將鈣蛋白酶抑制蛋白基因定位于2q2.1-2.4，并發(fā)現(xiàn)了3個在非編碼區(qū)上的PCR-RFLP多態(tài)性位點(HinfI，MspI，RsaI)。孫立彬(2005)等也發(fā)現(xiàn)了2個在非編碼區(qū)上的PCR-RFLP多態(tài)性位點(HinfI，TaqI)。但由于非編碼區(qū)的變異不影響蛋白質(zhì)的改變，很難證實非編碼區(qū)上的基因突變與豬肉嫩度的相關(guān)性。Rothschild(2003)等在鈣蛋白酶抑制蛋白基因編碼區(qū)上發(fā)現(xiàn)了兩個與肉質(zhì)相關(guān)的SNP，并申請了美國國家專利(SerialNo.339279)。但Rothschild是以西方豬種為研究對象，而東西方豬品系有很大的遺傳差異，西方豬種的多態(tài)位點是否能指導(dǎo)中國豬種的改良還需要驗證。
為了提高豬肉品質(zhì)和指導(dǎo)中國地方豬的保種和降低生產(chǎn)成本，本領(lǐng)域迫切需要在編碼區(qū)找到更多新的影響豬肉(特別是中國地方品系)嫩度的SNP位點，并開發(fā)基于豬肉嫩度進行豬只篩選的SNP標(biāo)記方法和試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，利用鈣蛋白酶抑制蛋白基因編碼區(qū)域中第1836位的SNP與豬肉嫩度顯著相關(guān)的特性，提供一種利用SNP標(biāo)記篩選豬的方法，進而提供一種新的篩選豬的試劑盒，為豬的標(biāo)記輔助選種和選配提供新的分子標(biāo)記，可進行豬只早期篩選。
本發(fā)明提供的鈣蛋白酶抑制蛋白基因1836位SNP標(biāo)記篩選豬的方法包括如下步驟(a)提取豬的耳組織總RNA樣品，進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用鈣蛋白酶抑制蛋白基因特異性引物進行PCR反應(yīng)，得到擴增產(chǎn)物；(b)檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性1836位C→T；
其中，核苷酸位置編號基于GenBank索引號M20160。
所述的基因特異性引物具有5’-GTCTCGGACCTCCTTGTG-3’和5’-ATTCAGGCGGGATAGTGT-3’的序列，所述的擴增產(chǎn)物的長度為100～4000bp，且含有M20160中第1836位。
進而，本發(fā)明提供了一種基于鈣蛋白酶抑制蛋白基因1836位SNP標(biāo)記篩選豬的試劑盒，它包括進行PCR反應(yīng)的鈣蛋白酶抑制蛋白基因特異性引物，所述的特異性引物具有5’-GTCTCGGACCTCCTTGTG-3’和5’-ATTCAGGCGGGATAGTGT-3’的序列；引物擴增長度為100～4000bp，且含有M20160中第1836位的擴增產(chǎn)物。
所述試劑盒還可以含有選自下組的試劑(a)與M20160中第1836位的突變結(jié)合的探針；(b)識別M20160中第1836位的突變限制性內(nèi)切酶。所述的突變選自以下單核苷酸多態(tài)性1836位C→T；其中，核苷酸位置編號基于M20160。
本發(fā)明的積極效果(1)在鈣蛋白酶抑制蛋白基因編碼區(qū)1836位分析鑒定出一個突變位點，經(jīng)國際基因數(shù)據(jù)庫中檢索，證明為新的SNP標(biāo)記。
(2)經(jīng)將上述的SNP標(biāo)記與梅山豬等五個群體的110頭豬的豬肉嫩度進行相關(guān)性分析，首次證明該標(biāo)記與豬肉嫩度顯著相關(guān)，可以用于豬只的早期篩選，從而降低飼養(yǎng)成本，增加產(chǎn)品的附加值。
(3)所發(fā)明的試劑盒可用于早期檢測以提高檢測效率，降低檢測成本。
具體實施例方式
本發(fā)明針對中國地方豬種梅山豬和蘇太豬進行了深入的研究，并和西方豬的品系進行了對比研究。對鈣蛋白酶抑制蛋白基因整個編碼區(qū)域進行了測序，在編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)多個新的SNP位點，其中統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，在鈣蛋白酶抑制蛋白基因編碼區(qū)第1836位的SNP與豬肉嫩度顯著相關(guān)(p＜0.05)，因此可作為檢測豬肉嫩度的特異性SNP，用于豬的標(biāo)記輔助選種和選配。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例11.1研究對象由于豬肉嫩度是多基因參與的受多種環(huán)境因素影響的數(shù)量性狀，為了降低環(huán)境的影響，所有實驗豬都在相同的飼養(yǎng)水平下飼養(yǎng)，并在同一天進行屠宰，參照陳潤生(2002)等的方法測定每一個樣品的肌肉嫩度。
實驗用110頭豬實驗豬均在蘇州市蘇太集團飼養(yǎng)，28頭梅山；27頭蘇太豬、15頭長白×蘇太豬雜種、15頭大白×蘇太豬、25頭杜×長×大雜種豬。通過直接測序的方法進行SNP的檢測。
1.2實驗方法和結(jié)果1.2.1RNA提取在豬場采取豬耳組織樣，迅速放入液氮中，冷凍后保存于實驗室-80℃冰箱中，準(zhǔn)備提取組織總RNA。取100mg耳組織樣放入1ml Trizol(trizal reagent，invitrogen BRL，USA)的勻漿器管中勻漿。4℃ 12000g離心10分鐘。吸取上清液，15-30℃溫育5分鐘。加0.2ml氯仿，蓋上蓋子，用手劇烈震蕩15秒。15-30℃溫育2-3分鐘。4℃ 12000g離心15分鐘。吸取上清液，加0.8ml異丙醇，混合均勻。15-30℃溫育10分鐘，4℃ 12000g離心10分鐘，離心管底部白色沉淀即為RNA。倒掉上清，加1ml 75％乙醇洗滌RNA，4℃ 7500g離心10分鐘。自然干燥或真空干燥RNA溶于水(RNase free)中分裝，-70℃保存。
1.2.2PCR及測序引物的設(shè)計根據(jù)GenBank中豬鈣蛋白酶抑制蛋白基因的編碼序列M20160，(可參見網(wǎng)址http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。用引物設(shè)計軟件primer5.0設(shè)計引物。具體引物如下表1所示。
表1 引物序列表

1.2.3鈣蛋白酶抑制蛋白基因的RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR)擴增反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組成10μL 2×Bca 1st Buffer，4μL 25Mm MgSO2，1μL dNTPMixtμre，0.5μL Rnase Inhibitor(40U/μL)，1μL BcaBEST Polymerase(22U/μL)，1μL Oligo dT Primer，1μL RNA Sample，1.5μL Rnase Free dH2O，總體系為20μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件65℃1分鐘，30℃5分鐘(15分鐘-30分鐘內(nèi)勻速升溫)，65℃25分鐘，98℃5分鐘，5℃5分鐘。PCR擴增條件97℃變性5分鐘；95℃30秒→55℃30秒→72℃1分鐘，如此進行30次循環(huán)；72℃延伸10分鐘，RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證。結(jié)果，獲得623bp的擴增產(chǎn)物。
1.2.4SNP的檢測RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)Resin樹脂純化后，用ABI-PRISMTM377DNA測序儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司appliedbiosystems(ABI)進行熒光標(biāo)記末端終止雙向測序，用Polyphred.html)進行序列的判讀和SNP確認(rèn)。
1.2.5SNP基因分型和關(guān)聯(lián)分析用直接單向測序法進行SNP基因分型，將在編碼區(qū)上發(fā)現(xiàn)了多個SNP采用以下模型對基因型效應(yīng)和遺傳模式進行分析y＝1μ+X1S+X2B+X3M+e模型中，y為個體表型記錄向量，μ為總體均數(shù)，S為性別效應(yīng)向量；B為群體效應(yīng)向量；M為基因型效應(yīng)向量；e為隨機誤差向量；1、X1、X2、X3為設(shè)計矩陣；統(tǒng)計分析采用SAS(8.02)軟件進行，其中多重比較采用SSR法。
結(jié)果，其中大部分SNP與豬肉嫩度并不相關(guān)。發(fā)現(xiàn)存在以下SNP1836位C→T，該SNP位于鈣蛋白酶抑制蛋白基因的編碼區(qū)，導(dǎo)致編碼氨基酸發(fā)生變化，由Val→Ala。關(guān)聯(lián)研究表明該位點是與豬肉嫩度關(guān)聯(lián)性非常高的SNP，對豬肉嫩度影響顯著，多重比較發(fā)現(xiàn)，含有C型SNP的豬肉嫩度比含有T型SNP的豬肉嫩度高18.13％，證實了M20160中1836位的C/T型SNP與豬肉嫩度存在著相關(guān)性。
實施例2基于鈣蛋白酶抑制蛋白基因1836位SNP標(biāo)記篩選豬的試劑盒，如實例1所述，M20160中的1836位C→T的突變與豬肉嫩度密切相關(guān)。因此，可基于這個SNP位點設(shè)計鈣蛋白酶抑制蛋白基因特異性引物進行擴增和檢測。
制備一試劑盒(100次)，組成如下表所示

在豬場采取豬耳組織樣，提取總RNA，按實施例1所述方法進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將試劑盒中的PCR引物稀釋到1pmol/μL，以所提取的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板用上述試劑盒進行PCR反應(yīng)。PCR擴增條件97℃變性5分鐘；95℃30秒→55℃30秒→72℃1分鐘，如此進行30次循環(huán)；72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI-PRISMTM377DNA測序儀進行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟件進行序列的判讀和SNP確認(rèn)。
根據(jù)本發(fā)明提供的標(biāo)記方法，如果用與M20160中第1836位的突變結(jié)合的探針或識別M20160中第1836位的突變的限制性內(nèi)切酶也可以檢測出1836位C→T。
檢測結(jié)果，含有T型SNP的豬肉嫩度比含有G型SNP的豬肉嫩度高18.13％。
權(quán)利要求
1.一種鈣蛋白酶抑制蛋白基因1836位SNP標(biāo)記篩選豬的方法，其特征在于包括如下步驟(a)提取豬的耳組織總RNA樣品，進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再用鈣蛋白酶抑制蛋白基因特異性引物進行PCR反應(yīng)，得到擴增產(chǎn)物；(b)檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性1836位C→T；其中，核苷酸位置編號基于GenBank索引號M20160；所述的基因特異性引物具有5’-GTCTCGGACCTCCTTGTG-3’和5’-ATTCAGGCGGGATAGTGT-3’的序列；所述的擴增產(chǎn)物的長度為100～4000bp，且含有M20160中第1836位。
2.一種鈣蛋白酶抑制蛋白基因1836位SNP標(biāo)記篩選豬的試劑盒，其特征在于包括進行PCR反應(yīng)的鈣蛋白酶抑制蛋白基因特異性引物，所述的特異性引物具有5’-GTCTCGGACCTCCTTGTG-3’和5’-ATTCAGGCGGGATAGTGT-3’的序列；引物擴增長度為100～4000bp，且含有M20160中第1836位的擴增產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的試劑盒，其特征在于還含有選自下組的試劑(a)與M20160中第1836位的突變結(jié)合的探針；(b)識別M20160中第1836位的突變限制性內(nèi)切酶；所述的突變選自以下單核苷酸多態(tài)性1836位C→T；其中，核苷酸位置編號基于M20160。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鈣蛋白酶抑制蛋白基因1836位SNP標(biāo)記篩選豬的方法，屬于家畜分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。其步驟包括，提取豬的基因組RNA，鈣蛋白酶抑制蛋白基因的反轉(zhuǎn)錄PCR擴增，SNP標(biāo)記的檢測及其與豬肉嫩度的相關(guān)性分析。本發(fā)明的特征是分離鑒定出豬鈣蛋白酶抑制蛋白基因新的SNP標(biāo)記，篩選出一個適用于豬肉嫩度的SNP標(biāo)記(1836位C→T)，設(shè)計了擴增該位點的引物，還提供了用于該方法的試劑盒。本發(fā)明利用鈣蛋白酶抑制蛋白基因編碼區(qū)域中第1836位的SNP與豬肉嫩度顯著相關(guān)的特性，為豬的標(biāo)記輔助選種和選配提供了新的分子標(biāo)記方法。
文檔編號C12Q1/68GK1824806SQ20051011180
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日
發(fā)明者潘玉春, 王起山, 孫立彬, 孟和, 于丹丹 申請人:上海交通大學(xué)