專利名稱：一種穩(wěn)定性同位素的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于穩(wěn)定性同位素標記化合物生產技術領域，尤其涉及采用微生物發(fā)酵和生物提取方法生產穩(wěn)定性同位素15N標記L-纈氨酸的工藝。
背景技術：
L-纈氨酸-15N與其它標記的氨基酸一樣，可作為示蹤劑廣泛應用于醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)和生命科學等相關研究領域。L-纈氨酸-15N獨特的示蹤作用可以用來實驗和研究L-纈氨酸在機體內的獨特生理作用。對L-纈氨酸的生產，國內外有一些研究小組對其做了許多研究工作，有US 6737255 B2；US4542098；US6214591B；微生物學報，15(4)P325～329，1975；藥物生物技術，6(1)P24～27，1999。但是，關于生物合成法研究15N穩(wěn)定性同位素標記L-纈氨酸的生產的文獻和專利還不多，有微生物學報，2(2)P75～78，1994。采用直接發(fā)酵法生產，目標氨基酸大量富集，穩(wěn)定性同位素15N容易標記，但由于發(fā)酵配方中有機氮源很難標記以及天然豐度氮源的影響，常常使L-纈氨酸-15N的豐度下降很多，達不到產品要求，同時15N原料的利用率也較低，從而增加了成本，所以需要對常規(guī)發(fā)酵配方及工藝進行改進。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現有技術存在的不足而提供一種穩(wěn)定性同位素15N標記L-纈氨酸的生產工藝，該工藝采用微生物直接發(fā)酵法生產L-纈氨酸-15N，通過添加微量維生素復合物改善生長和代謝，旨在解決15N豐度下降的問題，并盡量提高15N利用率，以滿足產品生產要求。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現一種穩(wěn)定性同位素15N標記L-纈氨酸的生產工藝，其特征在于，該生產工藝包括以下步驟(1)選擇適用菌種選擇適用于L-纈氨酸生產的黃色短桿菌(Brevobacterium flavum)、北京棒桿菌(Corynebacterium pekinense)、鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)、大腸桿菌(Escherichia coli)、乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)中的一種；(2)斜面制備將上述發(fā)酵菌株接種斜面，28～35℃培養(yǎng)8～24小時，斜面冷藏待用；(3)發(fā)酵培養(yǎng)配方以全合成培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加少量有機氮源，主要配方如下所示葡萄糖60～140g/L或蔗糖120～250g/L；氯化銨15～50g/L或硫酸銨15～30g/L；玉米漿或菌體水解液0～5g/L；K2HPO4·3H2O 1～4g/L；MgSO4·7H2O0.2～0.8g/L；MnSO4·H2O2～20mg/L；FeSO4·7H2O2～20mg/L；Zn SO4·7H2O0.5～10mg/L；生物素0～100μg/L；鹽酸硫胺素20～100μg/L；CaCO320～60g/L；(4)發(fā)酵工藝將在活化斜面中培養(yǎng)好的菌苔用少量無菌水洗下后接種于已滅菌的裝有上述發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，搖床發(fā)酵控制條件為初始pH6.4～7.2，搖床轉速180～220r/min，發(fā)酵時間60～96小時。發(fā)酵罐控制條件為發(fā)酵初始溫度30～33℃，通氣量0.5～1.5VVM，罐壓0.02～0.05Mpa，溶解氧0.5％～90％飽和度，通過聚醚類或硅酮類消泡劑消泡；發(fā)酵18～32小時，提高轉速和通氣量保證溶解氧在30～50％飽和度；發(fā)酵全過程控制pH在微酸性，通過添加15N標記尿素、氨水或液氨調節(jié)pH6～7，流加50％葡萄糖控制發(fā)酵液葡萄糖濃度2％～5％，發(fā)酵時間48～72小時；(5)分離提取發(fā)酵液中穩(wěn)定性同位素15N標記L-纈氨酸的分離采用離子交換法分離提取得到穩(wěn)定性同位素15N標記L-纈氨酸，通過真空濃縮趕氨并采用乙醇低溫結晶和真空干燥得到產品。
所述的步驟(1)中黃色短桿菌(Brevobacterium flavum)選自市售ATCC14067、ATCC14020、ATCC13869、ATCC14066中的一種或幾種，北京棒桿菌(Corynebacterium pekinense)選自市售CGMCC1.586、CGMCC1.299CGMCC 1.495中的一種或幾種，鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)選自市售CGMCC1.452、CGMCC1.1001、CGMCC1.1007中的一種或幾種，大腸桿菌(Escherichia coli)選自市售ATCC13005，乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)選自市售ATCC13058，谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)選自市售ATCC2256、ATCC13032、ATCC14751中的一種或幾種。
本發(fā)明利用微生物斜面菌苔直接轉發(fā)酵生產L-纈氨酸-15，控制有機氮源添加量，直接添加生物素和鹽酸硫胺素，通過改善發(fā)酵配方及工藝來提高產酸率。這樣可使15N原料得到有效利用，豐度下降不至于影響產品生產要求。
如果采用常規(guī)發(fā)酵方法，穩(wěn)定性同位素15N標記L-纈氨酸產量雖然相對較高，但15N豐度下降很大，往往下降3％以上，很難達到高豐度產品要求。采用全合成培養(yǎng)基發(fā)酵雖然對15N豐度影響不大，但產酸量太低使得15N原料利用率不高。通過改變發(fā)酵配方和工藝，直接添加鹽酸硫胺素和生物素，使本發(fā)明獲得的穩(wěn)定性同位素15N標記的L-纈氨酸產量比采用全合成培養(yǎng)基發(fā)酵產酸量相應提高10～50％以上，而穩(wěn)定性同位素15N標記的L-纈氨酸15N豐度下降可以減少到0.5％以下，有的甚至幾乎不下降，大大提高了15N原料利用率，減少了生產成本。同時，在保證產品15N豐度條件下，簡化發(fā)酵工藝，直接從活化斜面轉接菌種，不僅生產周期縮短，而且宜于控制15N產品的豐度，同時原料得到充分利用，大大節(jié)省了原料回收成本。本發(fā)明可利用低豐度和高豐度15N無機原料滿足不同豐度產品要求。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1使用的斜面培養(yǎng)基葡萄糖1g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，瓊脂20g/L，發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖100g/L，(15NH4)2SO415g/L，K2HPO41.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，MnSO4·H2O 0.02g/L，生物素50μg/L，硫胺素100μg/L，玉米漿1g/L，CaCO330g/L。
將北京棒桿菌CGMCC1.586從保藏斜面接種于活化斜面，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，用少許無菌水洗下2支斜面菌苔轉入裝有20ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，共10瓶，30℃下200r/min在巡回式搖床上發(fā)酵培養(yǎng)60小時結束，發(fā)酵平均產L-纈氨酸-15N可達18g/L。
發(fā)酵液采用732陽離子交換樹脂單柱分離，采用常規(guī)方法得到干燥固體L-纈氨酸-15N產品，經質譜分析得到產品豐度98.28％，豐度下降0.427％。
如果將發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿改為10g/L，發(fā)酵工藝不變，發(fā)酵平均產L-纈氨酸-15N可達33g/L，但豐度只有95.34％，豐度下降3.6％。如果發(fā)酵培養(yǎng)基中不加玉米漿，發(fā)酵平均產L-纈氨酸-15N只有5g/L，豐度98.71％，豐度下降0.232％。上述發(fā)酵培養(yǎng)基中如果沒有添加生物素、硫胺素等維生素復合物，發(fā)酵平均產L-纈氨酸-15N只有2g/L。綜合考慮，此發(fā)明效果顯著。
實施例2使用的斜面培養(yǎng)基葡萄糖1g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，瓊脂20g/L，發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖120g/L，(15NH4)2SO430g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O 0.02g/L，生物素50μg/L，硫胺素100μg/L，菌體水解液5g/L，CaCO340g/L。
將北京棒桿菌CGMCC1.1001從保藏斜面接種于活化斜面，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時，用少許無菌水洗下2支斜面菌苔轉入上述裝有發(fā)酵培養(yǎng)基20mL的500mL的三角瓶中，30℃下200rpm在巡回式搖床上發(fā)酵培養(yǎng)72小時結束，發(fā)酵平均產L-纈氨酸-15N可達25g/L。
發(fā)酵液采用1500H陽離子交換樹脂單柱分離，采用常規(guī)方法得到干燥固體L-纈氨酸-15N產品，經質譜分析得到產品豐度98.83％，豐度下降0.131％。
實施例3使用的斜面培養(yǎng)基葡萄糖1g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，瓊脂20g/L，發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖140g/L，(15NH4)2SO440g/L，K2HPO43g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，MnSO4·H2O 0.08g/L，生物素100μg/L，硫胺素50μg/L，玉米漿2g/L，CaCO330g/L。
將黃色短桿菌ATCC14067從保藏斜面接種于活化斜面，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15小時，用少許無菌水洗下2支斜面菌苔轉入裝有20mL發(fā)酵液的500mL三角瓶中，30℃下200r/min在巡回式搖床上發(fā)酵培養(yǎng)96小時結束，發(fā)酵平均產L-纈氨酸-15N可達21g/L。
發(fā)酵液采用FMC11Na陽離子交換樹脂單柱分離，采用常規(guī)方法得到干燥固體L-纈氨酸-15N產品，經質譜分析得到產品豐度98.66％，豐度下降0.283％。
權利要求
1.一種穩(wěn)定性同位素15N標記L-纈氨酸的生產工藝，其特征在于，該生產工藝包括以下步驟(1)選擇適用菌種選擇適用于L-纈氨酸生產的黃色短桿菌(Brevobacterium flavum)、北京棒桿菌(Corynebacterium pekinense)、鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)、大腸桿菌(Escherichia coli)、乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)中的一種；(2)斜面制備將上述發(fā)酵菌株接種斜面，28～35℃培養(yǎng)8～24小時，斜面冷藏待用；(3)發(fā)酵培養(yǎng)配方以全合成培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加少量有機氮源，主要配方如下所示葡萄糖60～140g/L或蔗糖120～250g/L；氯化銨15～50g/L或硫酸銨15～30g/L；玉米漿或菌體水解液0～5g/L；K2HPO4·3H2O 1～4g/L；MgSO4·7H2O0.2～0.8g/L；MnSO4·H2O 2～20mg/L；FeSO4·7H2O 2～20mg/L；Zn SO4·7H2O0.5～10mg/L；生物素0～100μg/L；鹽酸硫胺素20～100μg/L；CaCO320～60g/L；(4)發(fā)酵工藝將在活化斜面中培養(yǎng)好的菌苔用少量無菌水洗下后接種于已滅菌的裝有上述發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，搖床發(fā)酵控制條件為初始pH6.4～7.2，搖床轉速180～220r/min，發(fā)酵時間60～96小時。發(fā)酵罐控制條件為發(fā)酵初始溫度30～33℃，通氣量0.5～1.5VVM，罐壓0.02～0.05Mpa，溶解氧0.5％～90％飽和度，通過聚醚類或硅酮類消泡劑消泡；發(fā)酵18～32小時，提高轉速和通氣量保證溶解氧在30～50％飽和度；發(fā)酵全過程控制pH在微酸性，通過添加15N標記尿素、氨水或液氨調節(jié)pH6～7，流加50％葡萄糖控制發(fā)酵液葡萄糖濃度2％～5％，發(fā)酵時間48～72小時；(5)分離提取發(fā)酵液中穩(wěn)定性同位素15N標記L-纈氨酸的分離采用離子交換法分離提取得到穩(wěn)定性同位素15N標記L-纈氨酸，通過真空濃縮趕氨并采用乙醇低溫結晶和真空干燥得到產品。
2.根據權利要求1所述的一種穩(wěn)定性同位素15N標記L-纈氨酸的生產工藝，其特征在于，所述的步驟(1)中黃色短桿菌(Brevobacterium flavum)選自市售ATCC14067、ATCC14020、ATCC13869、ATCC14066中的一種或幾種，北京棒桿菌(Corynebacterium pekinense)選自市售CGMCC1.586、CGMCC1.299CGMCC1.495中的一種或幾種，鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)選自市售CGMCC1.452、CGMCC1.1001、CGMCC1.1007中的一種或幾種，大腸桿菌(Escherichia coli)選自市售ATCC13005，乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)選自市售ATCC13058，谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)選自市售ATCC2256、ATCC13032、ATCC14751中的一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定性同位素
文檔編號C12R1/02GK1982466SQ20051011137
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月12日 優(yōu)先權日2005年12月12日
發(fā)明者梅叢笑, 譚青喬, 李良君, 杜曉寧, 宋明鳴, 侯靜華 申請人:上?；ぱ芯吭?br>